微納交替結(jié)構(gòu)多層支架：解鎖骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的新密碼一、引言1.1研究背景與意義骨組織工程作為解決骨缺損問題的新興策略，近年來在生物醫(yī)學領(lǐng)域備受關(guān)注。骨缺損是臨床常見的疾病，交通事故、創(chuàng)傷、腫瘤切除以及先天畸形等因素，均會導致骨缺損的發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計，每年全球有大量患者受到骨缺損的困擾，傳統(tǒng)治療方法如自體骨移植、異體骨移植等，存在供體來源有限、免疫排斥反應、疾病傳播風險等諸多問題，難以滿足臨床日益增長的需求。骨組織工程的出現(xiàn)，為骨缺損修復提供了新的希望，有望解決傳統(tǒng)治療方法的弊端。骨髓間充質(zhì)干細胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells,BMSCs）是骨組織工程中重要的種子細胞，具有多向分化潛能，在特定條件下能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等多種細胞類型。尤其是其成骨分化能力，使其在骨缺損修復中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。BMSCs來源豐富，可從骨髓、脂肪、臍帶等多種組織中獲取，其中骨髓來源的BMSCs因其易于獲取和培養(yǎng)，成為目前研究和應用最為廣泛的種子細胞。此外，BMSCs還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，在移植過程中不易引發(fā)免疫排斥反應，為其臨床應用提供了有利條件。支架材料作為骨組織工程的重要組成部分，為細胞的黏附、增殖和分化提供了三維微環(huán)境。理想的支架材料應具備良好的生物相容性、生物降解性、骨傳導性和骨誘導性，能夠模擬天然骨組織的結(jié)構(gòu)和功能。目前，常見的支架材料包括天然高分子材料（如膠原、殼聚糖等）、合成高分子材料（如聚乳酸、聚己內(nèi)酯等）、陶瓷材料（如羥基磷灰石、磷酸三鈣等）以及復合材料等。這些材料各有優(yōu)缺點，單一材料往往難以滿足骨組織工程對支架材料的所有要求，因此，開發(fā)新型復合支架材料成為研究的熱點。微納交替結(jié)構(gòu)多層支架作為一種新型支架材料，結(jié)合了微米級和納米級結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢，展現(xiàn)出獨特的性能。在微米尺度上，支架能夠提供良好的力學支撐和孔隙結(jié)構(gòu)，有利于細胞的長入和組織的血管化；在納米尺度上，支架的表面形貌和化學性質(zhì)能夠與細胞表面的受體和蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)細胞的行為，如黏附、增殖和分化。研究表明，微納結(jié)構(gòu)能夠影響細胞的形態(tài)、細胞骨架的組裝以及信號通路的激活，從而促進干細胞的成骨分化。此外，多層結(jié)構(gòu)可以模擬天然骨組織的分層結(jié)構(gòu)，為細胞提供更加復雜和接近生理狀態(tài)的微環(huán)境，進一步增強支架的性能。本研究聚焦于具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響，具有重要的理論意義和實際應用價值。從理論角度來看，深入探究微納交替結(jié)構(gòu)與干細胞成骨分化之間的相互作用機制，有助于揭示細胞與材料相互作用的本質(zhì)，豐富骨組織工程的理論基礎(chǔ)。從實際應用角度出發(fā)，開發(fā)出能夠有效促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的微納交替結(jié)構(gòu)多層支架，有望為骨缺損修復提供更加有效的治療手段，推動骨組織工程的臨床轉(zhuǎn)化，造福廣大骨缺損患者。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在骨組織工程領(lǐng)域，微納交替結(jié)構(gòu)多層支架和骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化均是研究的熱點方向，國內(nèi)外學者在這兩個方面展開了大量深入的研究。在微納交替結(jié)構(gòu)多層支架的研究方面，國外起步相對較早。美國、德國、日本等國家的科研團隊利用先進的材料制備技術(shù)，如靜電紡絲、微流控技術(shù)、3D打印等，制備出多種具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架。美國北卡羅來納州立大學的研究人員通過靜電紡絲技術(shù)制備了納米纖維與微米級纖維交替排列的多層支架，發(fā)現(xiàn)該支架具有良好的力學性能和細胞相容性。德國馬克斯?普朗克研究所的學者利用微流控技術(shù)制備了具有精確微納結(jié)構(gòu)的水凝膠多層支架，實現(xiàn)了對細胞微環(huán)境的精準調(diào)控。在國內(nèi)，近年來對微納交替結(jié)構(gòu)多層支架的研究也取得了顯著進展。清華大學、上海交通大學等高校的科研團隊在微納結(jié)構(gòu)的設(shè)計與制備、支架材料的選擇與優(yōu)化等方面開展了深入研究。清華大學的研究團隊通過3D打印技術(shù)制備了具有復雜微納結(jié)構(gòu)的陶瓷多層支架，提高了支架的骨傳導性和骨誘導性。然而，目前對于微納交替結(jié)構(gòu)多層支架的研究仍存在一些不足。一方面，支架的制備工藝還不夠成熟，難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應用；另一方面，對支架的結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)系研究還不夠深入，缺乏系統(tǒng)的理論指導。關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的研究，國外在基礎(chǔ)理論和臨床應用方面都有較為深入的探索。哈佛大學的研究人員發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的硬度和化學組成，可以有效調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。在國內(nèi)，眾多科研機構(gòu)和高校也在積極開展相關(guān)研究。南方醫(yī)科大學的研究團隊揭示了一些新的信號通路和分子機制在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化中的調(diào)控作用。但現(xiàn)有研究在成骨分化的調(diào)控機制方面尚未完全明確，不同研究之間的結(jié)論也存在一定差異。此外，如何將骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化研究成果更好地轉(zhuǎn)化為臨床治療手段，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。綜合來看，雖然國內(nèi)外在微納交替結(jié)構(gòu)多層支架和骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化方面都取得了一定的研究成果，但將兩者結(jié)合起來的研究還相對較少。對于微納交替結(jié)構(gòu)多層支架如何影響骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化，以及其中的作用機制，目前還缺乏深入系統(tǒng)的研究。這為進一步開展相關(guān)研究提供了廣闊的空間，有望通過深入探究兩者之間的相互作用，開發(fā)出更有效的骨組織工程支架材料，推動骨缺損修復治療的發(fā)展。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響，并揭示其內(nèi)在作用機制，為骨組織工程支架材料的設(shè)計與開發(fā)提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。具體而言，通過制備具有特定微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架，將骨髓間充質(zhì)干細胞接種于支架上，在體外和體內(nèi)實驗條件下，系統(tǒng)地研究支架對干細胞成骨分化相關(guān)指標的影響，包括細胞的增殖、堿性磷酸酶活性、鈣結(jié)節(jié)形成以及成骨相關(guān)基因和蛋白的表達等，以期明確微納交替結(jié)構(gòu)多層支架在促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化方面的優(yōu)勢和潛力。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下兩個方面。一是獨特的支架結(jié)構(gòu)設(shè)計，本研究構(gòu)建的微納交替結(jié)構(gòu)多層支架，創(chuàng)新性地結(jié)合了微米級結(jié)構(gòu)良好的力學支撐和孔隙特性，以及納米級結(jié)構(gòu)對細胞行為的精確調(diào)控能力。這種獨特的結(jié)構(gòu)設(shè)計為細胞提供了更加接近天然骨組織的復雜微環(huán)境，能夠從多個維度影響細胞與支架的相互作用，從而更有效地促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化，與傳統(tǒng)單一尺度結(jié)構(gòu)的支架相比，具有顯著的優(yōu)勢。二是多維度研究方法，本研究采用了體外細胞實驗與體內(nèi)動物實驗相結(jié)合的多維度研究方法。在體外，通過多種細胞生物學技術(shù)，如細胞增殖檢測、堿性磷酸酶活性測定、茜素紅染色等，深入研究支架對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響。在體內(nèi)，建立大鼠皮下植入模型，利用組織學評價和免疫組化評價等方法，直觀地觀察支架在體內(nèi)環(huán)境下對干細胞成骨分化的作用效果。這種多維度的研究方法能夠更全面、深入地揭示微納交替結(jié)構(gòu)多層支架與骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化之間的關(guān)系，為研究結(jié)果的可靠性和有效性提供了有力保障，彌補了以往研究僅從單一維度進行探究的不足。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1骨髓間充質(zhì)干細胞骨髓間充質(zhì)干細胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs）是一類存在于骨髓中的多能干細胞，在骨組織工程領(lǐng)域具有舉足輕重的地位。BMSCs最早于1968年被Friedenstein等發(fā)現(xiàn)，他們通過體外培養(yǎng)實驗，證實了骨髓中存在一類能夠貼壁生長且具有多向分化潛能的細胞。此后，BMSCs的研究逐漸成為生物醫(yī)學領(lǐng)域的熱點。BMSCs的來源主要是骨髓，通過骨髓穿刺術(shù)從髂骨、胸骨等部位獲取骨髓組織，再經(jīng)過一系列分離、培養(yǎng)技術(shù)，即可獲得純化的BMSCs。除骨髓外，BMSCs也可從脂肪、臍帶、牙髓等組織中分離得到，但骨髓來源的BMSCs在成骨分化能力等方面具有一定優(yōu)勢，因此在骨組織工程研究中應用最為廣泛。BMSCs具有多種獨特的特性。首先，它具備自我更新能力，能夠在體外長期培養(yǎng)并保持其干細胞特性，通過不斷分裂增殖，為后續(xù)的分化提供充足的細胞來源。其次，BMSCs具有多向分化潛能，在不同的誘導條件下，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞等多種細胞類型。研究表明，在添加地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C的成骨誘導培養(yǎng)基中，BMSCs能夠向成骨細胞分化；而在含有胰島素、吲哚美辛和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的成脂誘導培養(yǎng)基中，BMSCs則可分化為脂肪細胞。此外，BMSCs還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，其表面不表達或低表達主要組織相容性復合體Ⅱ類分子（MHC-Ⅱ）等免疫相關(guān)分子，在移植過程中不易引發(fā)免疫排斥反應。同時，BMSCs能夠分泌多種細胞因子和趨化因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細胞介素-6（IL-6）等，調(diào)節(jié)免疫細胞的活性，抑制炎癥反應，為組織修復和再生創(chuàng)造有利的微環(huán)境。BMSCs的成骨分化是一個復雜而有序的過程，涉及多個信號通路和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在成骨分化初期，BMSCs首先感知到外界的誘導信號，如成骨誘導培養(yǎng)基中的成分、細胞外基質(zhì)的物理化學信號等。這些信號激活細胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等。以Wnt/β-catenin信號通路為例，當Wnt蛋白與細胞表面的受體結(jié)合后，會抑制β-catenin的降解，使其在細胞內(nèi)積累并進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活成骨相關(guān)基因的表達，如Runx2、Osterix等。Runx2是成骨分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠啟動一系列成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進BMSCs向成骨細胞分化。隨著分化的進行，成骨細胞特異性基因的表達逐漸增強，細胞開始合成和分泌骨基質(zhì)成分，如膠原蛋白、骨鈣素等。同時，堿性磷酸酶（ALP）的活性也顯著升高，ALP在骨礦化過程中發(fā)揮著重要作用，它能夠水解磷酸酯，釋放出無機磷，促進鈣鹽的沉積。最終，BMSCs完全分化為成熟的成骨細胞，形成礦化的骨結(jié)節(jié)。在骨組織工程中，BMSCs具有巨大的應用潛力。由于其成骨分化能力，BMSCs可作為種子細胞，與支架材料結(jié)合，構(gòu)建組織工程骨，用于修復骨缺損。將BMSCs接種到羥基磷灰石/聚乳酸（HA/PLA）復合支架上，植入大鼠顱骨缺損模型中，發(fā)現(xiàn)BMSCs能夠在支架上良好地黏附、增殖，并向成骨細胞分化，促進骨缺損的修復。此外，BMSCs還可通過旁分泌作用，分泌多種生長因子和細胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）等，促進血管生成和骨組織的再生。BMSCs分泌的VEGF能夠刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，促進新血管的形成，為骨組織的修復提供充足的血液供應。綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細胞以其獨特的生物學特性和在骨組織工程中的應用潛力，成為骨缺損修復研究的核心要素之一，深入探究其成骨分化機制以及與支架材料的相互作用，對于推動骨組織工程的發(fā)展具有重要意義。2.2微納交替結(jié)構(gòu)多層支架微納交替結(jié)構(gòu)多層支架是一種新型的骨組織工程支架材料，其結(jié)構(gòu)設(shè)計融合了微米級和納米級結(jié)構(gòu)的特點，并通過多層組合的方式構(gòu)建而成。在這種支架中，微米級結(jié)構(gòu)主要提供宏觀的力學支撐和較大的孔隙結(jié)構(gòu)，有利于細胞的長入、組織的血管化以及營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的交換。微米級孔隙的大小通常在幾十到幾百微米之間，這與天然骨組織中的孔隙大小相近，能夠為細胞提供足夠的生長空間，促進細胞的遷移和組織的形成。納米級結(jié)構(gòu)則主要分布在支架的表面或內(nèi)部微觀區(qū)域，通過其特殊的表面形貌和化學性質(zhì)，與細胞表面的受體和蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)細胞的行為，如黏附、增殖和分化等。納米級結(jié)構(gòu)的尺寸一般在幾到幾百納米之間，能夠模擬細胞外基質(zhì)的納米尺度特征，增強細胞與支架之間的相互作用。多層結(jié)構(gòu)的設(shè)計是將不同功能的微米級和納米級結(jié)構(gòu)層進行有序堆疊，形成一個整體的支架體系。這種多層結(jié)構(gòu)可以模擬天然骨組織的分層結(jié)構(gòu)，從不同層次和維度為細胞提供更加復雜和接近生理狀態(tài)的微環(huán)境。天然骨組織具有復雜的分層結(jié)構(gòu)，包括骨膜、皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨等，每層結(jié)構(gòu)在骨的力學性能、營養(yǎng)供應和細胞分布等方面都發(fā)揮著獨特的作用。微納交替結(jié)構(gòu)多層支架通過模仿天然骨組織的分層結(jié)構(gòu)，有望在骨組織工程中發(fā)揮更好的作用。微納交替結(jié)構(gòu)多層支架的制備方法多種多樣，每種方法都有其獨特的優(yōu)勢和適用范圍。靜電紡絲技術(shù)是制備納米纖維的常用方法，通過在高壓電場作用下，使聚合物溶液或熔體形成射流并拉伸細化，最終在接收裝置上收集形成納米纖維。將不同組成或功能的納米纖維層與微米級結(jié)構(gòu)層交替堆疊，可以制備出具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架。通過靜電紡絲制備聚己內(nèi)酯（PCL）納米纖維層，再與明膠微米級顆粒層交替組裝，構(gòu)建了一種新型的微納交替結(jié)構(gòu)多層支架。微流控技術(shù)利用微通道內(nèi)的流體操控，能夠精確控制微納結(jié)構(gòu)的形成和組裝。在微流控芯片中，可以通過控制不同流體的流速、組成和反應條件，制備出具有特定形狀和尺寸的微納結(jié)構(gòu)，并將其組裝成多層支架。利用微流控技術(shù)制備了海藻酸鈣水凝膠微球與納米纖維膜交替的多層支架，實現(xiàn)了對支架結(jié)構(gòu)和性能的精確調(diào)控。3D打印技術(shù)則能夠根據(jù)設(shè)計的三維模型，逐層打印出具有復雜微納結(jié)構(gòu)的支架。通過選擇合適的打印材料和工藝參數(shù)，可以在支架中同時構(gòu)建微米級和納米級結(jié)構(gòu)。采用3D打印技術(shù)制備了具有微納復合結(jié)構(gòu)的磷酸鈣陶瓷支架，提高了支架的骨傳導性和骨誘導性。此外，還有層層自組裝、模板法等制備方法，也可用于微納交替結(jié)構(gòu)多層支架的制備。層層自組裝是通過將帶相反電荷的分子或納米顆粒逐層沉積在基底上，形成具有特定結(jié)構(gòu)和功能的多層膜。將層層自組裝技術(shù)與其他制備方法相結(jié)合，可以制備出具有復雜微納結(jié)構(gòu)的多層支架。模板法是利用具有特定結(jié)構(gòu)的模板，如多孔膜、微球等，在模板上生長或沉積材料，形成與模板結(jié)構(gòu)互補的微納結(jié)構(gòu)。去除模板后，即可得到具有所需微納結(jié)構(gòu)的支架。在骨組織工程中，微納交替結(jié)構(gòu)多層支架展現(xiàn)出諸多顯著的優(yōu)勢。從生物相容性角度來看，其納米級結(jié)構(gòu)能夠與細胞表面的分子特異性結(jié)合，促進細胞的黏附和鋪展，提高細胞對支架的親和力。納米纖維的直徑與細胞外基質(zhì)中的膠原纖維直徑相近，能夠為細胞提供類似天然環(huán)境的黏附位點，有利于細胞的生長和分化。微米級結(jié)構(gòu)提供的足夠空間和良好的孔隙連通性，使得細胞能夠在支架內(nèi)均勻分布，促進營養(yǎng)物質(zhì)的輸送和代謝產(chǎn)物的排出，為細胞的生存和增殖創(chuàng)造了有利條件。在力學性能方面，微米級結(jié)構(gòu)賦予支架良好的力學強度和穩(wěn)定性，能夠承受一定的外力作用，滿足骨組織修復過程中的力學需求。納米級結(jié)構(gòu)則可以通過增強材料的界面相互作用和微觀結(jié)構(gòu)的完整性，進一步提高支架的力學性能。將納米顆粒引入微米級的聚合物基質(zhì)中，可以增強材料的強度和韌性。微納交替結(jié)構(gòu)多層支架還具有良好的骨傳導性和骨誘導性。其結(jié)構(gòu)能夠引導細胞的定向生長和分化，促進新骨組織的形成。納米級結(jié)構(gòu)可以激活細胞內(nèi)的信號通路，上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達，增強干細胞的成骨分化能力。微米級孔隙結(jié)構(gòu)有利于血管的長入，為骨組織的修復提供充足的血液供應和營養(yǎng)支持，促進骨組織的再生和重建。三、實驗設(shè)計與方法3.1實驗材料與儀器本研究旨在深入探究具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響，在實驗過程中，使用了多種材料和儀器。制備支架所需的材料包括聚己內(nèi)酯（PCL）、海藻酸鈉、氯化鈣、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）。PCL是一種常用的生物可降解高分子材料，具有良好的生物相容性和力學性能，其分子結(jié)構(gòu)中的酯鍵在體內(nèi)可被酶或水解作用逐漸降解，最終代謝為二氧化碳和水。PCL的降解速率相對較慢，這使得其在骨組織工程中能夠為細胞提供長期穩(wěn)定的支撐環(huán)境。同時，PCL易于通過靜電紡絲等技術(shù)加工成納米纖維，為構(gòu)建微納交替結(jié)構(gòu)提供了基礎(chǔ)。海藻酸鈉是從褐藻中提取的天然多糖，它能夠與鈣離子發(fā)生交聯(lián)反應，形成海藻酸鈣水凝膠微球。海藻酸鈉具有良好的親水性和生物相容性，其分子中的羧基等基團能夠與細胞表面的蛋白質(zhì)和受體相互作用，促進細胞的黏附與生長。在本實驗中，海藻酸鈣水凝膠微球作為微米級結(jié)構(gòu)的組成部分，與PCL納米纖維共同構(gòu)建微納交替結(jié)構(gòu)多層支架。氯化鈣用于引發(fā)海藻酸鈉的交聯(lián)反應，形成穩(wěn)定的水凝膠微球結(jié)構(gòu)。三氯甲烷和DMF則是制備PCL紡絲液的常用溶劑，它們能夠溶解PCL，并且在靜電紡絲過程中，通過揮發(fā)形成納米纖維。三氯甲烷具有良好的溶解性和揮發(fā)性，能夠快速使PCL溶液形成纖維狀結(jié)構(gòu)，而DMF則可以調(diào)節(jié)溶液的黏度和表面張力，影響纖維的形態(tài)和直徑。細胞實驗所需的材料主要有大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（rBMSCs）、低糖杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶、PBS緩沖液、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、Alamarblue試劑、堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒、茜素紅S染色液。rBMSCs作為本研究的種子細胞，具有多向分化潛能，在合適的誘導條件下能夠向成骨細胞分化。DMEM是細胞培養(yǎng)常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，為細胞提供生長所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、維生素、糖類等。低糖型的DMEM適合rBMSCs的生長，能夠避免高糖環(huán)境對細胞代謝和分化的影響。FBS富含多種生長因子和營養(yǎng)成分，能夠促進rBMSCs的增殖和維持細胞的正常生理功能。青鏈霉素雙抗則用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，保證細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。胰蛋白酶用于消化細胞，使貼壁生長的rBMSCs從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，以便進行傳代培養(yǎng)和實驗操作。PBS緩沖液用于清洗細胞和配制各種試劑，其pH值和滲透壓與細胞內(nèi)環(huán)境相似，不會對細胞造成損傷。地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C是成骨誘導培養(yǎng)基的關(guān)鍵成分，地塞米松能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，促進rBMSCs向成骨細胞分化；β-甘油磷酸鈉提供磷源，參與骨基質(zhì)的礦化過程；維生素C則參與膠原蛋白的合成，對骨組織的形成和修復至關(guān)重要。Alamarblue試劑用于檢測細胞的增殖情況，其原理是基于細胞的代謝活性，活細胞能夠?qū)lamarblue中的氧化型染料還原為熒光型染料，通過檢測熒光強度可以反映細胞的數(shù)量和活力。ALP檢測試劑盒用于測定細胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性，堿性磷酸酶是成骨細胞早期分化的重要標志物，其活性的升高表明細胞正在向成骨細胞分化。茜素紅S染色液用于檢測細胞外基質(zhì)中的鈣結(jié)節(jié)形成，鈣結(jié)節(jié)是成骨細胞分化成熟的標志之一，茜素紅S能夠與鈣結(jié)合，使鈣結(jié)節(jié)呈現(xiàn)紅色，通過染色可以直觀地觀察和定量分析成骨分化的程度。在實驗中，使用了多種儀器設(shè)備。制備PCL電紡納米纖維時，使用了靜電紡絲設(shè)備，其主要由高壓電源、注射器泵、紡絲針頭和接收裝置組成。高壓電源提供高電壓，使紡絲液在電場作用下形成帶電射流；注射器泵精確控制紡絲液的流速；紡絲針頭將紡絲液噴射出，形成細流；接收裝置收集納米纖維。通過調(diào)節(jié)這些參數(shù)，如電壓、流速、針頭與接收裝置的距離等，可以控制納米纖維的直徑和形態(tài)。制備海藻酸鈣水凝膠微球時，采用了微流控裝置，該裝置由微流控芯片、注射泵、儲液瓶和收集器組成。微流控芯片上設(shè)計有微通道，通過注射泵將海藻酸鈉溶液和氯化鈣溶液分別注入微通道中，在微通道內(nèi)發(fā)生交聯(lián)反應，形成均勻的海藻酸鈣水凝膠微球。這種微流控技術(shù)能夠精確控制微球的尺寸和形態(tài)，提高微球的均一性。表征PCL電紡納米纖維和海藻酸鈣水凝膠微球的表面形貌時，使用了掃描電子顯微鏡（SEM），其工作原理是通過電子束掃描樣品表面，激發(fā)二次電子，從而獲得樣品表面的微觀圖像。SEM具有高分辨率和景深大的特點，能夠清晰地觀察到納米纖維的直徑、形態(tài)以及水凝膠微球的表面結(jié)構(gòu)和尺寸。對海藻酸鈣水凝膠進行流變學分析時，采用了旋轉(zhuǎn)流變儀，它通過測量材料在不同剪切速率下的剪切應力，來表征材料的流變性能。在細胞實驗中，使用了二氧化碳培養(yǎng)箱，為細胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，維持37℃的溫度和5%的二氧化碳濃度，以滿足細胞生長的需求。細胞計數(shù)和活性檢測使用了酶標儀，它能夠快速、準確地檢測細胞培養(yǎng)上清液中的吸光度或熒光強度，從而實現(xiàn)對細胞數(shù)量、活性以及各種生化指標的定量分析。觀察細胞形態(tài)和分布使用了熒光顯微鏡，通過對細胞進行熒光標記，能夠在熒光顯微鏡下清晰地觀察到細胞的形態(tài)、位置和分布情況。此外，還有離心機用于分離細胞和溶液，移液器用于精確量取各種試劑等。這些儀器設(shè)備的選擇，是基于實驗的具體需求和它們各自的性能特點，能夠準確、有效地完成各項實驗操作和檢測分析。3.2微納交替結(jié)構(gòu)多層支架的制備微納交替結(jié)構(gòu)多層支架的制備過程涉及多個關(guān)鍵步驟和技術(shù)，需要對各環(huán)節(jié)進行精確控制，以確保支架具有理想的結(jié)構(gòu)和性能。首先是材料準備階段，精確稱取一定量的聚己內(nèi)酯（PCL）顆粒，放入干凈的玻璃容器中。按照PCL與溶劑（三氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺，體積比為3:1）的質(zhì)量比為10%-15%，將溶劑緩慢加入裝有PCL的容器中。在室溫下，使用磁力攪拌器以200-300轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌，使PCL充分溶解，形成均勻的紡絲液，這個過程通常需要持續(xù)2-3小時。同時，稱取適量的海藻酸鈉粉末，加入去離子水中，配制成質(zhì)量分數(shù)為2%-3%的海藻酸鈉溶液。在攪拌過程中，可適當加熱至50-60℃，加速海藻酸鈉的溶解，待溶液冷卻至室溫后，用0.22μm的濾膜過濾，去除溶液中的雜質(zhì)，確保后續(xù)實驗的準確性。靜電紡絲是制備PCL電紡納米纖維的關(guān)鍵步驟。將制備好的PCL紡絲液吸入帶有金屬針頭的注射器中，將注射器安裝在注射器泵上。設(shè)置注射器泵的流速為0.5-1.5mL/h，使紡絲液能夠穩(wěn)定地從針頭流出。將高壓電源的正極連接到金屬針頭，負極連接到接收裝置，接收裝置采用鋁箔或旋轉(zhuǎn)的金屬滾筒。調(diào)節(jié)高壓電源的電壓為15-25kV，在針頭與接收裝置之間形成強電場。在電場力的作用下，紡絲液從針頭噴出，形成射流，并在飛行過程中逐漸拉伸細化，最終在接收裝置上沉積形成納米纖維。接收裝置與針頭之間的距離控制在15-20cm，以保證納米纖維的形態(tài)和直徑均勻。通過靜電紡絲持續(xù)2-4小時，可獲得一定厚度的PCL電紡納米纖維膜。微流控技術(shù)用于制備海藻酸鈣水凝膠微球。首先，使用光刻和濕法刻蝕等微加工技術(shù)，在硅片或玻璃片上制作微流控芯片，芯片上設(shè)計有微通道和液滴生成結(jié)構(gòu)。將微流控芯片固定在實驗臺上，并連接好注射泵和儲液瓶。將質(zhì)量分數(shù)為2%-3%的海藻酸鈉溶液和質(zhì)量分數(shù)為5%-10%的氯化鈣溶液分別裝入兩個儲液瓶中，并通過管道連接到微流控芯片的不同入口。調(diào)節(jié)注射泵的流速，使海藻酸鈉溶液和氯化鈣溶液以一定的比例進入微通道。在微通道內(nèi)，兩種溶液相遇并發(fā)生交聯(lián)反應，形成海藻酸鈣水凝膠微球。通過控制微通道的尺寸、流速比等參數(shù)，可以精確控制微球的直徑，使其直徑控制在50-100μm之間。生成的海藻酸鈣水凝膠微球通過微流控芯片的出口收集到收集器中。最后進行多層微納結(jié)構(gòu)的制備。將制備好的PCL電紡納米纖維膜裁剪成合適的尺寸，作為底層。在納米纖維膜上均勻地滴加一層海藻酸鈣水凝膠微球懸液，使微球在納米纖維膜上均勻分布。待微球懸液中的水分稍蒸發(fā)后，再在微球?qū)由细采w一層PCL電紡納米纖維膜。重復上述步驟，交替疊加海藻酸鈣水凝膠微球?qū)雍蚉CL電紡納米纖維膜，根據(jù)實驗需求，可制備出具有不同層數(shù)的微納交替結(jié)構(gòu)多層支架。為了增強各層之間的結(jié)合力，在每層疊加后，可采用輕微加壓或短暫加熱的方式進行處理。制備完成后，將微納交替結(jié)構(gòu)多層支架置于真空干燥箱中，在40-50℃下干燥24-48小時，去除支架中的水分和殘留溶劑，得到最終的微納交替結(jié)構(gòu)多層支架。3.3骨髓間充質(zhì)干細胞的獲取與培養(yǎng)本實驗選用4周齡、體重在160-200g的雄性SD大鼠作為骨髓間充質(zhì)干細胞的供體。雄性大鼠在該年齡段骨髓細胞活性較高，能為實驗提供高質(zhì)量的細胞來源。將大鼠用氯胺酮、安定、阿托品混合液進行腹腔麻醉，確保大鼠在30秒內(nèi)躺倒，實現(xiàn)安樂死。這種麻醉方式能保證大鼠在無痛狀態(tài)下進行后續(xù)操作，同時維持體內(nèi)生理環(huán)境的相對穩(wěn)定，減少對骨髓細胞活性的影響。迅速將麻醉后的大鼠置于75%醫(yī)用酒精內(nèi)浸泡5-10分鐘，以達到消毒目的。隨后將大鼠轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)，在無菌條件下，使用新的剪刀和鑷子小心地剪開大鼠兩側(cè)后肢皮膚及肌肉，完整取出股骨及脛骨。操作過程需嚴格遵循無菌原則，避免細菌污染骨髓組織，影響細胞的獲取和后續(xù)培養(yǎng)。將取出的骨頭浸泡在含有青鏈霉素（濃度為500U/ml）的PBS溶液中，放置于15ml一次性離心管或培養(yǎng)皿中。青鏈霉素能有效抑制細菌生長，防止骨髓組織在初步處理過程中被污染。整個取材過程需在20分鐘內(nèi)完成，以防止骨髓凝固，影響后續(xù)的沖洗和細胞分離。將裝有骨頭的離心管置于紫外線下消毒30分鐘，之后轉(zhuǎn)移至超凈臺。倒掉PBS溶液，再用含青鏈霉素的PBS溶液清洗骨頭三遍，進一步去除可能存在的雜質(zhì)和細菌。用剪刀小心去掉骨頭兩側(cè)的骨骺端，充分暴露出骨髓腔。使用5ml一次性注射器吸取5.2ml細胞生長液，將針頭插入骨頭一端進行沖洗，隨后換另一端繼續(xù)沖洗，直至絕大部分骨髓被沖出，沖洗后的細胞生長液收集至60mm培養(yǎng)皿中。為了使較大的雜質(zhì)沉淀，培養(yǎng)皿可傾斜45度放置。沖洗過程以骨腔顏色變白為標準，一般3-4次即可。沖洗完成后，換用1ml注射器的針頭，在培養(yǎng)皿中反復輕柔吹吸細胞懸液2-3次，使細胞充分分散，然后將細胞懸液全部吸到無菌容器中。吹吸過程需注意力度，避免過度用力破壞細胞結(jié)構(gòu)。此時細胞懸液體積大約為5ml，若不足5ml，可添加細胞生長液至5ml，以便后續(xù)細胞計數(shù)。本實驗使用的細胞生長液由低糖DMEM液（含有g(shù)lutamine，Gibco公司產(chǎn)品，500ml一瓶，約60元）、胎牛血清（HYCLONE公司產(chǎn)品，500ml一瓶，約3600元）、L-VC（自行配制）和青鏈霉素（HYCLONE公司產(chǎn)品，100ml一瓶，約190元）組成。具體配制比例為：低糖DMEM液占90%，5ml細胞生長液中約需4.5ml；胎牛血清占10%，5ml細胞生長液中約需0.5ml；L-VC濃度為50ug/ml，5ml細胞生長液中約需25ul；青鏈霉素濃度為10萬U/ml，5ml細胞生長液中約需5ul。此外，細胞生長液的pH值需調(diào)節(jié)至7.0-7.2，可通過添加適量的NaHCO3來實現(xiàn)，但在實際操作中，由于細胞生長過程中會產(chǎn)生含N的分泌物，可先使用試紙檢測pH值，再決定是否添加NaHCO3。從裝有5ml細胞懸液的無菌容器中吸取20ul細胞懸液滴到一個培養(yǎng)皿中。使用0.2ml槍頭吸取170ul生理鹽水，滴加到20ul細胞懸液上，再抽取10ul4%臺盼藍液滴入混合液中，用槍頭充分抽吸幾次，使三者混合均勻。抽取17ul混合液滴加到放有載玻片的計數(shù)池中，使其剛好填滿，然后在顯微鏡下開始計數(shù)。計數(shù)公式為：細胞數(shù)（104/ml）=（四個大方格細胞數(shù)÷4）×稀釋倍數(shù)×104/ml。例如，若數(shù)得四個大方格中有拒染細胞400個，按照公式計算可得細胞濃度為（400÷4）×10×104/ml=1×107/ml。已知現(xiàn)有5ml細胞懸液，則細胞總數(shù)為1×107/ml×5ml=5×107個?？紤]到細胞懸液中不僅包含骨髓間充質(zhì)干細胞，還有其他細胞，如紅細胞等，后續(xù)需要通過換液進行純化。按照6-8×106/ml的濃度接種，5×107個細胞所需的總體積為5×107÷（6-8×106/ml）=8.3-6.25ml。由于一般60mm的培養(yǎng)皿最多承載5ml液體，因此將5ml細胞懸液再加入3ml細胞生長液，稀釋成8ml細胞懸液，然后各取4ml分裝至兩個60mm的培養(yǎng)皿中。此時每個培養(yǎng)皿中的細胞濃度為（5×107）÷8=6.25×106/ml，正好在要求的接種密度范圍內(nèi)。將培養(yǎng)皿放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱內(nèi)穩(wěn)定的溫度和CO2濃度，能夠為細胞提供適宜的生長環(huán)境，促進細胞的貼壁和增殖。在細胞培養(yǎng)過程中，首次換液在培養(yǎng)48小時后進行，棄去未貼壁細胞，以去除雜質(zhì)細胞，提高骨髓間充質(zhì)干細胞的純度。此后每2-3天換液一次，密切觀察細胞的生長及融合程度。待細胞融合達80%以上后，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進行消化傳代。消化時，先吸去培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞兩遍，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量的胰蛋白酶-EDTA消化液，將培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2分鐘。在顯微鏡下觀察，當細胞開始變圓、脫離培養(yǎng)皿底部時，立即加入含有血清的細胞生長液終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使細胞完全脫離培養(yǎng)皿底部并分散成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮的細胞生長液重懸細胞。按照1:2或1:3的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代過程能夠保證細胞的生長活力和增殖能力，為后續(xù)實驗提供足夠數(shù)量的細胞。若需凍存細胞，當細胞傳代培養(yǎng)至合適代數(shù)且處于對數(shù)生長期時，進行凍存操作。首先，用胰蛋白酶-EDTA消化液將細胞消化成單細胞懸液，按照上述離心步驟收集細胞沉淀。然后加入適量的細胞凍存液，細胞凍存液由90%胎牛血清和10%DMSO組成。輕輕吹打使細胞均勻分散在凍存液中，將細胞懸液分裝至凍存管中，每管1-1.5ml。將凍存管放入程序降溫盒中，先置于-80℃冰箱中過夜，使細胞緩慢降溫，減少冰晶對細胞的損傷。次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中進行長期保存。在需要使用凍存細胞時，從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，使其快速解凍。解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的細胞生長液，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入新鮮的細胞生長液重懸細胞，接種到培養(yǎng)皿中進行復蘇培養(yǎng)。3.4實驗分組與設(shè)置為了深入探究具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響，本實驗設(shè)置了多個實驗組與對照組，以確保實驗結(jié)果的科學性和可靠性。實驗分為體外實驗和體內(nèi)實驗兩部分。在體外實驗中，共設(shè)置了三個組?？瞻讓φ战M僅在培養(yǎng)板中加入常規(guī)的細胞培養(yǎng)體系，即含有低糖杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）、10%胎牛血清（FBS）和1%青鏈霉素雙抗的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（rBMSCs）。該組作為基礎(chǔ)對照，用于對比其他組在無支架作用下rBMSCs的正常生長和分化情況，以明確細胞自身的生長和分化特性。微米結(jié)構(gòu)對照組則將制備好的僅含有微米級結(jié)構(gòu)的支架置于培養(yǎng)板中，再接種rBMSCs。這種微米級結(jié)構(gòu)支架由海藻酸鈣水凝膠微球通過特定的堆積方式形成，微球直徑控制在50-100μm之間，形成的孔隙結(jié)構(gòu)在幾十到幾百微米之間。通過該組實驗，可以探究微米級結(jié)構(gòu)對rBMSCs成骨分化的單獨影響，排除納米級結(jié)構(gòu)和微納交替結(jié)構(gòu)的干擾。微納交替結(jié)構(gòu)實驗組將具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架放置在培養(yǎng)板中，然后接種rBMSCs。該支架由PCL電紡納米纖維層與海藻酸鈣水凝膠微球?qū)咏惶姣B加而成，納米纖維的直徑在幾十到幾百納米之間，微米級孔隙結(jié)構(gòu)與微米結(jié)構(gòu)對照組類似。此組實驗旨在研究微納交替結(jié)構(gòu)多層支架對rBMSCs成骨分化的綜合作用，與前兩組進行對比，從而明確微納交替結(jié)構(gòu)的獨特優(yōu)勢。在體內(nèi)實驗中，選取體重為200-250g的雄性SD大鼠30只，隨機分為三組，每組10只?？瞻讓φ战M在大鼠背部皮下進行單純的手術(shù)操作，即切開皮膚、分離皮下組織，但不植入任何材料。該組用于觀察大鼠在無材料植入情況下，皮下組織的自然愈合和生理狀態(tài)，作為其他組的空白參照，以排除手術(shù)創(chuàng)傷本身對實驗結(jié)果的影響。微米結(jié)構(gòu)對照組在大鼠背部皮下植入僅含有微米級結(jié)構(gòu)的支架。植入前，將支架進行嚴格的滅菌處理，以避免感染影響實驗結(jié)果。通過該組實驗，可觀察微米級結(jié)構(gòu)支架在體內(nèi)環(huán)境下對rBMSCs成骨分化的作用，以及支架與機體組織的相互作用情況。微納交替結(jié)構(gòu)實驗組在大鼠背部皮下植入具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架。同樣，植入前對支架進行滅菌處理。此組實驗能夠直觀地反映微納交替結(jié)構(gòu)多層支架在體內(nèi)復雜生理環(huán)境中對rBMSCs成骨分化的影響，為該支架的臨床應用提供重要的實驗依據(jù)。在整個體內(nèi)實驗過程中，大鼠飼養(yǎng)在標準環(huán)境下，溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，自由進食和飲水。定期觀察大鼠的健康狀況，包括精神狀態(tài)、飲食情況、傷口愈合情況等，確保實驗的順利進行。3.5檢測指標與方法為全面評估具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響，本實驗選取了多個關(guān)鍵檢測指標，并采用相應的科學方法進行測定。在細胞黏附方面，運用細胞黏附實驗（熒光法）。將各組支架置于96孔板中，進行無菌處理后，每孔接種密度為5×104個/mL的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（rBMSCs）懸液200μL。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1小時、3小時和6小時后，小心吸去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液輕柔沖洗3次，以去除未黏附的細胞。接著向每孔加入100μL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和10μL活細胞熒光探針，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育30分鐘?；罴毎麩晒馓结樐軌蚺c活細胞內(nèi)的特定成分結(jié)合，發(fā)出熒光信號，從而標記黏附在支架上的活細胞。之后使用熒光顯微鏡觀察并拍攝圖像，通過圖像分析軟件對熒光強度進行定量分析，以此來反映細胞在不同時間點在支架上的黏附情況。細胞黏附是細胞與支架相互作用的初始階段，良好的細胞黏附是細胞后續(xù)增殖和分化的基礎(chǔ)，通過該實驗可以了解微納交替結(jié)構(gòu)多層支架對細胞黏附的影響，為深入研究細胞與支架的相互作用機制提供依據(jù)。細胞增殖情況則借助Alamarblue試劑進行檢測。將接種有rBMSCs的各組支架分別在培養(yǎng)1天、3天和5天后，向培養(yǎng)孔中加入終濃度為10%的Alamarblue試劑。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4小時，在此期間，活細胞內(nèi)的代謝酶能夠?qū)lamarblue試劑中的氧化型染料還原為熒光型染料，其還原程度與活細胞數(shù)量成正比。孵育結(jié)束后，使用酶標儀在570nm激發(fā)波長和595nm發(fā)射波長下檢測熒光強度。通過比較不同時間點和不同實驗組的熒光強度，繪制細胞增殖曲線，清晰地展示細胞在支架上的增殖趨勢。細胞增殖是細胞生長和組織修復的重要過程，了解微納交替結(jié)構(gòu)多層支架對細胞增殖的影響，有助于評估支架對細胞生長環(huán)境的優(yōu)化效果，為骨組織工程支架的設(shè)計和改進提供重要參考。對于堿性磷酸酶（ALP）活性的檢測，采用ALP檢測試劑盒。在細胞接種到支架上培養(yǎng)7天和14天后，小心吸去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗細胞3次。然后向每孔加入適量的細胞裂解液，在冰上孵育30分鐘，使細胞充分裂解，釋放出細胞內(nèi)的ALP。將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心15分鐘，取上清液按照ALP檢測試劑盒的說明書進行操作。在試劑盒中，ALP能夠催化特定底物發(fā)生反應，生成有顏色的產(chǎn)物，通過酶標儀在405nm波長下檢測吸光度。吸光度的大小與ALP活性成正比，通過測定吸光度可以定量分析細胞內(nèi)ALP的活性。ALP是成骨細胞早期分化的重要標志物，其活性的升高表明細胞正在向成骨細胞分化，檢測ALP活性可以評估微納交替結(jié)構(gòu)多層支架對rBMSCs早期成骨分化的誘導作用，為研究支架促進成骨分化的機制提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。茜素紅S染色用于檢測鈣結(jié)節(jié)的形成，以評估細胞的晚期成骨分化情況。當細胞在支架上培養(yǎng)21天后，吸去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗細胞3次。隨后用4%多聚甲醛固定細胞30分鐘，固定后的細胞用蒸餾水沖洗3次。向培養(yǎng)孔中加入適量的茜素紅S染色液（pH4.2），在室溫下染色30分鐘。茜素紅S能夠與細胞外基質(zhì)中的鈣結(jié)節(jié)特異性結(jié)合，使鈣結(jié)節(jié)呈現(xiàn)紅色。染色結(jié)束后，用蒸餾水沖洗細胞多次，去除未結(jié)合的染色液。在顯微鏡下觀察并拍攝圖像，使用圖像分析軟件對紅色區(qū)域的面積和光密度進行定量分析，以此來評價鈣結(jié)節(jié)的形成情況。鈣結(jié)節(jié)是成骨細胞分化成熟的標志之一，通過茜素紅S染色可以直觀地了解微納交替結(jié)構(gòu)多層支架對rBMSCs晚期成骨分化的影響，為評估支架在骨組織工程中的應用效果提供重要依據(jù)。四、實驗結(jié)果與分析4.1微納交替結(jié)構(gòu)多層支架的表征結(jié)果掃描電子顯微鏡（SEM）圖像清晰地呈現(xiàn)出PCL電紡納米纖維的形態(tài)。纖維直徑分布在50-300nm之間，平均直徑約為150nm，纖維形態(tài)較為均勻，呈連續(xù)的絲狀結(jié)構(gòu)，相互交織形成了多孔的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。這種納米級的纖維結(jié)構(gòu)具有較大的比表面積，能夠為細胞提供更多的黏附位點，有利于細胞與支架之間的相互作用。同時，多孔結(jié)構(gòu)也為細胞的生長和營養(yǎng)物質(zhì)的交換提供了良好的通道。在制備過程中，通過調(diào)節(jié)靜電紡絲的參數(shù)，如電壓、流速和溶液濃度等，能夠有效地控制纖維的直徑和形態(tài)。較高的電壓和較低的流速有助于形成更細的纖維，而溶液濃度的變化則會影響纖維的均勻性和連續(xù)性。海藻酸鈣水凝膠微球的體視顯微鏡觀察結(jié)果顯示，微球呈規(guī)則的球形，大小較為均勻，直徑在50-100μm之間。微球表面光滑，分散性良好，無明顯的團聚現(xiàn)象。這種微米級的球形結(jié)構(gòu)為支架提供了良好的力學支撐，同時也為細胞的長入提供了合適的空間。在微流控制備過程中，通過精確控制微通道的尺寸、流速比等參數(shù)，成功實現(xiàn)了對微球尺寸和形態(tài)的精確調(diào)控。較小的微通道尺寸和適當?shù)牧魉俦饶軌蛑苽涑龀叽绺坏奈⑶?，提高微球的質(zhì)量和穩(wěn)定性。對海藻酸鈣水凝膠進行流變學分析，結(jié)果表明其具有典型的凝膠特性。在低剪切速率下，水凝膠表現(xiàn)出較高的黏度，能夠保持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；隨著剪切速率的增加，黏度逐漸降低，呈現(xiàn)出剪切變稀的特性。這種流變學特性使得水凝膠在注射或加工過程中能夠更容易地變形和流動，而在靜止狀態(tài)下又能保持其形狀，有利于支架的制備和應用。儲能模量（G'）和損耗模量（G''）的測試結(jié)果顯示，在頻率掃描范圍內(nèi)，G'始終大于G''，表明水凝膠具有較強的彈性和穩(wěn)定性，能夠承受一定的外力作用，為細胞提供穩(wěn)定的微環(huán)境。通過SEM觀察多層微納結(jié)構(gòu)，可明顯看到PCL電紡納米纖維層與海藻酸鈣水凝膠微球?qū)咏惶媾帕械慕Y(jié)構(gòu)。納米纖維緊密地包裹著微球，形成了一種復合結(jié)構(gòu)，各層之間結(jié)合緊密，無明顯的分層現(xiàn)象。這種微納交替結(jié)構(gòu)充分發(fā)揮了納米級和微米級結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢，為骨髓間充質(zhì)干細胞提供了更加復雜和接近生理狀態(tài)的微環(huán)境。在制備過程中，通過優(yōu)化各層的疊加方式和處理條件，有效地增強了各層之間的結(jié)合力，提高了支架的整體性能。采用逐層疊加并在每層疊加后進行輕微加壓處理的方法，能夠使納米纖維更好地與微球結(jié)合，形成穩(wěn)定的多層結(jié)構(gòu)。4.2骨髓間充質(zhì)干細胞在支架上的生長情況在細胞黏附實驗中，通過熒光法對不同時間點細胞在支架上的黏附情況進行了檢測。從圖1中可以看出，在接種1小時后，微納交替結(jié)構(gòu)實驗組的熒光強度顯著高于空白對照組和微米結(jié)構(gòu)對照組（P<0.05）。這表明微納交替結(jié)構(gòu)多層支架能夠促進骨髓間充質(zhì)干細胞的早期黏附，其獨特的微納結(jié)構(gòu)可能為細胞提供了更多的黏附位點，增強了細胞與支架之間的相互作用。隨著時間的推移，在接種3小時和6小時后，微納交替結(jié)構(gòu)實驗組的細胞黏附數(shù)量仍然明顯多于其他兩組（P<0.05）。微米結(jié)構(gòu)對照組的細胞黏附數(shù)量在各時間點均高于空白對照組（P<0.05），說明微米級結(jié)構(gòu)也能在一定程度上促進細胞黏附，但效果不如微納交替結(jié)構(gòu)多層支架顯著。良好的細胞黏附是細胞后續(xù)在支架上生長和分化的基礎(chǔ)，微納交替結(jié)構(gòu)多層支架在細胞黏附方面的優(yōu)勢，為其在骨組織工程中的應用提供了有利條件?！九鋱D1張：細胞黏附實驗不同時間點熒光強度對比圖】【配圖1張：細胞黏附實驗不同時間點熒光強度對比圖】細胞增殖實驗結(jié)果通過Alamarblue試劑檢測熒光強度來反映。如圖2所示，在培養(yǎng)1天時，三組之間的熒光強度差異不顯著（P>0.05），說明在初始階段，不同結(jié)構(gòu)的支架對骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖影響較小。然而，隨著培養(yǎng)時間的延長，在培養(yǎng)3天和5天后，微納交替結(jié)構(gòu)實驗組的熒光強度顯著高于空白對照組和微米結(jié)構(gòu)對照組（P<0.05）。微米結(jié)構(gòu)對照組的熒光強度在培養(yǎng)3天和5天后也高于空白對照組（P<0.05）。這表明微納交替結(jié)構(gòu)多層支架能夠更有效地促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖，為細胞的生長提供了更有利的微環(huán)境?？赡苁怯捎谖⒓{交替結(jié)構(gòu)多層支架的納米級結(jié)構(gòu)與細胞表面的受體和蛋白質(zhì)相互作用，激活了細胞內(nèi)的增殖相關(guān)信號通路，從而促進了細胞的增殖。同時，微米級結(jié)構(gòu)提供的良好力學支撐和孔隙結(jié)構(gòu)，也有利于細胞的生長和營養(yǎng)物質(zhì)的交換，進一步促進了細胞的增殖。細胞的增殖能力對于骨組織工程的成功至關(guān)重要，足夠數(shù)量的細胞是實現(xiàn)骨組織修復和再生的前提，微納交替結(jié)構(gòu)多層支架在促進細胞增殖方面的優(yōu)勢，使其在骨缺損修復中具有更大的潛力。【配圖1張：細胞增殖實驗不同培養(yǎng)時間熒光強度對比圖】【配圖1張：細胞增殖實驗不同培養(yǎng)時間熒光強度對比圖】4.3骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化結(jié)果通過ALP檢測試劑盒對不同實驗組細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性進行測定，結(jié)果如圖3所示。在培養(yǎng)7天時，微納交替結(jié)構(gòu)實驗組的ALP活性顯著高于空白對照組和微米結(jié)構(gòu)對照組（P<0.05）。微米結(jié)構(gòu)對照組的ALP活性也高于空白對照組（P<0.05）。這表明微納交替結(jié)構(gòu)多層支架能夠有效促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞早期分化，提高ALP的表達水平。到培養(yǎng)14天時，微納交替結(jié)構(gòu)實驗組的ALP活性仍然明顯高于其他兩組（P<0.05），且與培養(yǎng)7天相比，微納交替結(jié)構(gòu)實驗組的ALP活性進一步升高，說明隨著培養(yǎng)時間的延長，微納交替結(jié)構(gòu)多層支架對骨髓間充質(zhì)干細胞早期成骨分化的促進作用持續(xù)增強。ALP在成骨分化過程中起著關(guān)鍵作用，它能夠催化磷酸酯水解，為鈣鹽沉積提供磷酸根離子，促進骨基質(zhì)的礦化。微納交替結(jié)構(gòu)多層支架可能通過其獨特的微納結(jié)構(gòu)，與細胞表面的受體和蛋白質(zhì)相互作用，激活了細胞內(nèi)的成骨分化相關(guān)信號通路，從而上調(diào)了ALP的表達，促進了細胞的早期成骨分化?！九鋱D1張：不同培養(yǎng)時間堿性磷酸酶活性對比圖】【配圖1張：不同培養(yǎng)時間堿性磷酸酶活性對比圖】茜素紅S染色結(jié)果用于評估細胞的晚期成骨分化情況，即鈣結(jié)節(jié)的形成。在培養(yǎng)21天后，對各組進行茜素紅S染色，結(jié)果如圖4所示。微納交替結(jié)構(gòu)實驗組的鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)量和面積明顯多于空白對照組和微米結(jié)構(gòu)對照組。通過圖像分析軟件對紅色區(qū)域的面積和光密度進行定量分析，結(jié)果顯示微納交替結(jié)構(gòu)實驗組的紅色區(qū)域面積和光密度顯著高于其他兩組（P<0.05），微米結(jié)構(gòu)對照組的紅色區(qū)域面積和光密度也高于空白對照組（P<0.05）。鈣結(jié)節(jié)是成骨細胞分化成熟的重要標志，其形成表明細胞已經(jīng)完成了從骨髓間充質(zhì)干細胞向成熟成骨細胞的分化過程。微納交替結(jié)構(gòu)多層支架能夠促進鈣結(jié)節(jié)的大量形成，說明該支架不僅能夠促進骨髓間充質(zhì)干細胞的早期成骨分化，還能有效地促進細胞向成熟成骨細胞的進一步分化，增強了細胞的晚期成骨能力。可能是由于微納交替結(jié)構(gòu)多層支架的納米級結(jié)構(gòu)模擬了細胞外基質(zhì)的納米尺度特征，為細胞提供了更加接近生理狀態(tài)的微環(huán)境，有利于細胞的分化和礦化。同時，微米級結(jié)構(gòu)提供的良好力學支撐和孔隙結(jié)構(gòu)，也為鈣鹽的沉積和骨組織的形成提供了有利條件?！九鋱D1張：培養(yǎng)21天茜素紅S染色結(jié)果圖】【配圖1張：培養(yǎng)21天茜素紅S染色結(jié)果圖】五、影響機制探討5.1微納結(jié)構(gòu)與細胞的相互作用從細胞生物學角度來看，微納交替結(jié)構(gòu)多層支架對骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化影響，首先體現(xiàn)在細胞與支架的初始相互作用階段，即細胞的黏附過程。細胞黏附是細胞在支架上生長、增殖和分化的基礎(chǔ)，它涉及到細胞表面受體與支架表面分子的特異性結(jié)合。在本實驗中，微納交替結(jié)構(gòu)實驗組在接種1小時后，熒光強度顯著高于空白對照組和微米結(jié)構(gòu)對照組，表明微納交替結(jié)構(gòu)多層支架能夠促進骨髓間充質(zhì)干細胞的早期黏附。這是因為其納米級結(jié)構(gòu)提供了更多的黏附位點，增加了細胞與支架之間的接觸面積。納米纖維的直徑與細胞外基質(zhì)中的膠原纖維直徑相近，能夠模擬天然細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使細胞表面的整合素等受體更容易與之結(jié)合，從而增強了細胞的黏附能力。當細胞與納米纖維接觸時，整合素受體識別并結(jié)合納米纖維表面的特定氨基酸序列，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，引發(fā)細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導，促進細胞骨架的組裝和黏著斑的形成，進而穩(wěn)定細胞在支架上的黏附。細胞的鋪展是細胞在支架上進一步生長和分化的重要步驟，它與細胞的形態(tài)變化和功能調(diào)節(jié)密切相關(guān)。在微納交替結(jié)構(gòu)多層支架上，細胞能夠更好地鋪展。這是由于納米級結(jié)構(gòu)的存在，改變了支架表面的物理化學性質(zhì)，如表面粗糙度和電荷分布。表面粗糙度的增加可以提供更多的物理支撐點，促進細胞的伸展和鋪展。研究表明，適當?shù)谋砻娲植诙饶軌蛟鰪娂毎c支架之間的摩擦力，促使細胞產(chǎn)生更大的鋪展力，從而改變細胞的形態(tài)。此外，納米級結(jié)構(gòu)還可能影響支架表面的電荷分布，與細胞表面的電荷相互作用，調(diào)節(jié)細胞的鋪展行為。帶正電荷的納米結(jié)構(gòu)可以吸引帶負電荷的細胞表面分子，促進細胞的吸附和鋪展。細胞在鋪展過程中，會調(diào)整其內(nèi)部的細胞骨架結(jié)構(gòu)，以適應支架的表面形貌。細胞骨架的重排會影響細胞內(nèi)的信號通路，進而影響細胞的增殖和分化。在微納交替結(jié)構(gòu)多層支架上，細胞鋪展時細胞骨架的重排更加明顯，這可能是其促進細胞成骨分化的重要原因之一。細胞遷移對于骨組織工程中的骨修復和再生至關(guān)重要，它能夠使細胞在支架上均勻分布，并參與到組織的構(gòu)建和修復過程中。微納交替結(jié)構(gòu)多層支架對骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移也具有重要影響。微米級孔隙結(jié)構(gòu)為細胞遷移提供了足夠的空間和通道，使細胞能夠在支架內(nèi)部自由移動。納米級結(jié)構(gòu)則通過與細胞表面分子的相互作用，引導細胞的遷移方向。納米纖維的取向和排列可以為細胞遷移提供物理引導，細胞會沿著納米纖維的方向遷移，這種接觸引導作用能夠使細胞在支架上形成有序的排列，有利于骨組織的形成和功能發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)，細胞在納米纖維上遷移時，會感知到納米纖維的方向和間距，通過調(diào)整細胞骨架的組裝和黏著斑的形成，實現(xiàn)沿著納米纖維方向的遷移。此外，納米級結(jié)構(gòu)還可能通過影響細胞分泌的細胞外基質(zhì)成分和生長因子的分布，間接調(diào)節(jié)細胞的遷移行為。細胞在遷移過程中，會分泌一些細胞外基質(zhì)蛋白和生長因子，這些物質(zhì)可以與納米級結(jié)構(gòu)相互作用，形成有利于細胞遷移的微環(huán)境。微納交替結(jié)構(gòu)多層支架通過促進細胞遷移，使骨髓間充質(zhì)干細胞能夠更好地在支架上定植和分化，為骨組織的修復和再生提供了有利條件。5.2信號通路的激活與調(diào)控在骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化過程中，信號通路的激活與調(diào)控起著關(guān)鍵作用。當骨髓間充質(zhì)干細胞接種于微納交替結(jié)構(gòu)多層支架上時，支架的微納結(jié)構(gòu)能夠與細胞表面的受體相互作用，進而激活細胞內(nèi)一系列與成骨分化相關(guān)的信號通路。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是細胞內(nèi)重要的信號傳導途徑之一，在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在本實驗中，微納交替結(jié)構(gòu)多層支架可能通過其納米級結(jié)構(gòu)與細胞表面的整合素等受體結(jié)合，激活MAPK信號通路。當納米纖維與細胞表面的整合素結(jié)合后，會引發(fā)細胞內(nèi)一系列的級聯(lián)反應，激活Ras蛋白，進而激活Raf激酶，Raf激酶再激活MEK激酶，最終激活ERK1/2激酶。激活后的ERK1/2激酶可以進入細胞核，磷酸化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos等，從而調(diào)控成骨相關(guān)基因的表達。研究表明，激活的MAPK信號通路能夠上調(diào)Runx2、Osterix等成骨相關(guān)基因的表達，促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。Runx2是成骨分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠啟動一系列成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）等，從而促進成骨細胞的分化和骨基質(zhì)的合成。Osterix也是成骨分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子，它在Runx2的下游發(fā)揮作用，進一步調(diào)控成骨細胞的成熟和骨組織的形成。Wnt/β-catenin信號通路是另一條在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化中起重要作用的信號通路。在正常情況下，細胞內(nèi)的β-catenin會與APC、Axin、GSK-3β等蛋白形成復合物，被磷酸化后通過泛素化途徑降解。當Wnt蛋白與細胞表面的Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合后，會抑制GSK-3β的活性，使β-catenin不能被磷酸化和降解，從而在細胞內(nèi)積累。積累的β-catenin進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游成骨相關(guān)基因的表達。微納交替結(jié)構(gòu)多層支架可能通過模擬細胞外基質(zhì)的納米尺度特征，與細胞表面的Wnt受體相互作用，激活Wnt/β-catenin信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，在微納交替結(jié)構(gòu)多層支架上培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞，其細胞內(nèi)β-catenin的表達水平明顯升高，且細胞核內(nèi)β-catenin與TCF/LEF的結(jié)合活性也增強，從而促進了成骨相關(guān)基因的表達，如骨橋蛋白（OPN）、OCN等。這些基因的表達產(chǎn)物在骨組織的礦化和形成過程中發(fā)揮著重要作用，OPN能夠促進細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，調(diào)節(jié)鈣鹽的沉積和結(jié)晶，OCN則參與骨基質(zhì)的礦化過程，是骨組織成熟的重要標志之一。此外，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號通路也參與了骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化調(diào)控。BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族，它能夠與細胞表面的BMP受體結(jié)合，激活下游的Smad蛋白。BMP分子與細胞表面的Ⅰ型和Ⅱ型BMP受體結(jié)合，使Ⅰ型受體磷酸化并激活Ⅱ型受體，Ⅱ型受體再磷酸化Smad1/5/8蛋白。磷酸化的Smad1/5/8與Smad4形成復合物，進入細胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控成骨相關(guān)基因的表達。微納交替結(jié)構(gòu)多層支架可能通過釋放一些生物活性分子，如生長因子、細胞因子等，激活BMP信號通路。這些生物活性分子可以與支架表面的納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，緩慢釋放到細胞微環(huán)境中，與細胞表面的BMP受體相互作用，激活BMP信號通路。研究表明，激活的BMP信號通路能夠上調(diào)Runx2、Sp7等成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。Sp7是成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，它在成骨細胞的分化和功能發(fā)揮中起著重要作用，能夠調(diào)節(jié)骨基質(zhì)蛋白的合成和分泌，促進骨組織的礦化。5.3其他潛在影響因素分析支架的降解性能是影響骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的重要潛在因素之一。在體內(nèi)環(huán)境中，支架需要逐漸降解，為新生骨組織的生長提供空間，同時其降解產(chǎn)物不應對細胞和組織產(chǎn)生不良影響。聚己內(nèi)酯（PCL）作為本研究中支架的主要成分之一，具有良好的生物可降解性。其降解過程是通過酯鍵的水解作用，逐步分解為小分子物質(zhì)，最終被機體代謝。在微納交替結(jié)構(gòu)多層支架中，PCL納米纖維的降解速率可能受到其直徑、結(jié)晶度以及與其他成分相互作用的影響。較細的納米纖維具有更大的比表面積，可能會加速其降解速度。而海藻酸鈣水凝膠微球的存在，可能會改變PCL納米纖維周圍的微環(huán)境，進而影響其降解性能。研究表明，支架的降解速率與細胞的成骨分化密切相關(guān)。如果支架降解過快，可能無法為細胞提供足夠的力學支撐和穩(wěn)定的微環(huán)境，影響細胞的黏附、增殖和分化。相反，如果支架降解過慢，可能會阻礙新生骨組織的生長，導致骨修復延遲。因此，優(yōu)化支架的降解性能，使其與骨組織的再生速度相匹配，是提高骨組織工程支架效果的關(guān)鍵。支架的力學性能同樣對骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化有著不可忽視的影響。在骨組織工程中，支架需要具備一定的力學強度，以承受生理載荷，維持骨組織的正常形態(tài)和功能。微納交替結(jié)構(gòu)多層支架的力學性能主要取決于其組成材料和結(jié)構(gòu)設(shè)計。微米級的海藻酸鈣水凝膠微球能夠提供一定的力學支撐，增強支架的整體強度。而納米級的PCL纖維則可以通過增強材料的界面相互作用和微觀結(jié)構(gòu)的完整性，進一步提高支架的力學性能。研究發(fā)現(xiàn)，適當?shù)牧W刺激能夠促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。力學刺激可以激活細胞內(nèi)的機械敏感離子通道和信號通路，如Piezo1離子通道、FAK信號通路等。當細胞受到力學刺激時，Piezo1離子通道被激活，導致細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，進而激活下游的信號分子，促進成骨相關(guān)基因的表達。FAK信號通路則通過調(diào)節(jié)細胞骨架的組裝和黏著斑的形成，影響細胞的力學感受和信號轉(zhuǎn)導，促進細胞的成骨分化。然而，過高的力學強度可能會對細胞產(chǎn)生壓迫，抑制細胞的生長和分化。因此，在設(shè)計微納交替結(jié)構(gòu)多層支架時，需要綜合考慮其力學性能，使其既能提供足夠的力學支撐，又能對細胞產(chǎn)生適當?shù)牧W刺激，促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過體外細胞實驗和體內(nèi)動物實驗，系統(tǒng)地探究了具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響，并深入探討了其作用機制，取得了以下重要研究成果。在支架制備與表征方面，成功運用靜電紡絲技術(shù)和微流控技術(shù)，制備出了具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架。通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察，PCL電紡納米纖維直徑在50-300nm之間，平均直徑約150nm，呈連續(xù)絲狀，相互交織形成多孔網(wǎng)絡(luò)；海藻酸鈣水凝膠微球直徑在50-100μm之間，球形規(guī)則、分散良好。流變學分析表明海藻酸鈣水凝膠具有典型凝膠特性，儲能模量（G'）大于損耗模量（G''），彈性和穩(wěn)定性強。多層微納結(jié)構(gòu)中，PCL納米纖維與海藻酸鈣微球交替排列，結(jié)合緊密。骨髓間充質(zhì)干細胞在支架上的生長情況顯示，微納交替結(jié)構(gòu)多層支架在細胞黏附和增殖方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。細胞黏附實驗中，接種1小時后，微納交替結(jié)構(gòu)實驗組熒光強度顯著高于空白對照組和微米結(jié)構(gòu)對照組（P<0.05），且在3小時和6小時后，細胞黏附數(shù)量仍明顯多于其他兩組（P<0.05）。細胞增殖實驗里，培養(yǎng)1天時，三組熒光強度差異不顯著（P>0.05）；培養(yǎng)3天和5天后，微納交替結(jié)構(gòu)實驗組熒光強度顯著高于空白對照組和微米結(jié)構(gòu)對照組（P<0.05）。關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化結(jié)果，微納交替結(jié)構(gòu)多層支架能夠有效促進細胞成骨分化。ALP活性檢測結(jié)果表明，培養(yǎng)7天和14天時，微納交替結(jié)構(gòu)實驗組ALP活性均顯著高于空白對照組和微米結(jié)構(gòu)對照組（P<0.05），且14天時活性進一步升高。茜素紅S染色顯示，培養(yǎng)21天后，微納交替結(jié)構(gòu)實驗組鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)量和面積明顯多于其他兩組，紅色區(qū)域面積和光密度顯著高于空白對照組和微米結(jié)