急性肝衰竭小鼠中miRNAs表達譜及其調(diào)控肝細胞凋亡的機制探究一、引言1.1研究背景急性肝衰竭（AcuteLiverFailure，ALF）是一種起病急驟、病情兇險的臨床綜合征，以大量肝細胞壞死和嚴重肝功能損害為主要特征，常伴有凝血功能障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等臨床表現(xiàn)。ALF的病因復雜多樣，在我國，病毒性肝炎是導致ALF的主要原因之一，其中乙型肝炎病毒（HBV）感染最為常見。此外，藥物性肝損傷、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、缺血性肝炎、先天性代謝異常以及妊娠期脂肪肝等也均可引發(fā)ALF。ALF的發(fā)病率雖然相對較低，但其病死率卻居高不下，嚴重威脅著人類的生命健康。據(jù)統(tǒng)計，未經(jīng)治療的ALF患者病死率可高達60%-80%。盡管目前臨床上采用了多種治療手段，如內(nèi)科綜合治療、人工肝支持系統(tǒng)以及肝移植等，但患者的預后仍然不容樂觀。肝移植作為治療ALF最有效的方法，由于受到供體短缺、免疫排斥反應以及高昂的治療費用等因素的限制，其廣泛應用受到了極大的制約。因此，深入研究ALF的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和干預措施，對于改善ALF患者的預后具有重要的現(xiàn)實意義。肝細胞凋亡在ALF的發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵作用。肝細胞凋亡是一種由基因調(diào)控的細胞程序性死亡方式，其發(fā)生機制涉及多條信號通路的激活和調(diào)控。在ALF時，多種因素如病毒感染、毒素作用、免疫攻擊等均可誘導肝細胞凋亡，導致肝細胞數(shù)量急劇減少，肝臟功能嚴重受損。當肝細胞凋亡過度時，肝臟無法維持正常的生理功能，進而引發(fā)一系列嚴重的并發(fā)癥，如肝性腦病、肝腎綜合征等，最終導致患者死亡。因此，抑制肝細胞凋亡成為治療ALF的一個重要策略。微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于真核生物中。miRNAs通過與靶基因信使核糖核酸（mRNA）的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或直接降解mRNA，從而在轉錄后水平對基因表達進行負調(diào)控。研究表明，miRNAs參與了細胞的增殖、分化、凋亡、代謝以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學過程，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。在肝臟疾病中，miRNAs同樣發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其表達水平的異常變化與ALF的發(fā)生發(fā)展密切相關。不同的miRNAs在ALF中可能具有不同的作用，有些miRNAs可能通過抑制肝細胞凋亡，減輕肝臟損傷，對ALF起到保護作用；而另一些miRNAs則可能促進肝細胞凋亡，加重ALF的病情。鑒于此，深入研究miRNAs在ALF小鼠中的表達譜及其對肝細胞凋亡的調(diào)控作用，不僅有助于揭示ALF的發(fā)病機制，為ALF的早期診斷和病情評估提供潛在的生物標志物，還可能為ALF的治療提供新的靶點和干預策略，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在通過高通量測序技術全面分析miRNAs在急性肝衰竭小鼠中的表達譜，篩選出差異表達的miRNAs，并深入探討其對肝細胞凋亡的調(diào)控作用及潛在機制，為急性肝衰竭的診斷、治療和預后評估提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。具體而言，研究目的主要包括以下三個方面：一是明確急性肝衰竭小鼠模型中miRNAs的表達譜，篩選出與正常小鼠相比差異表達顯著的miRNAs；二是通過體內(nèi)外實驗驗證差異表達miRNAs對肝細胞凋亡的調(diào)控作用；三是揭示差異表達miRNAs調(diào)控肝細胞凋亡的分子機制。從理論層面來看，本研究具有重要的意義。ALF的發(fā)病機制至今尚未完全明確，肝細胞凋亡在其中扮演著關鍵角色，但相關分子機制仍有待深入挖掘。miRNAs作為基因表達的重要調(diào)控因子，在ALF中的作用及機制研究尚處于起步階段。本研究通過對miRNAs在ALF小鼠中的表達譜進行系統(tǒng)分析，能夠進一步揭示miRNAs在ALF發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控網(wǎng)絡，豐富對ALF發(fā)病機制的認識，為該領域的理論發(fā)展提供新的視角和思路。在臨床實踐方面，本研究也有著不可忽視的價值。目前，ALF的早期診斷缺乏特異性指標，病情評估主要依賴于傳統(tǒng)的肝功能指標和臨床癥狀，難以準確反映疾病的嚴重程度和預后。本研究篩選出的差異表達miRNAs，有望成為ALF早期診斷的新型生物標志物，提高診斷的準確性和及時性。此外，深入了解miRNAs對肝細胞凋亡的調(diào)控機制，有助于開發(fā)以miRNAs為靶點的新型治療策略，為ALF患者提供更加有效的治療手段，改善患者的預后，降低病死率，具有重要的臨床應用前景。1.3研究方法與技術路線本研究主要采用動物實驗結合分子生物學技術的方法，對miRNAs在急性肝衰竭小鼠中的表達譜及其對肝細胞凋亡的調(diào)控作用進行深入探究。具體研究方法如下：實驗動物：選取健康成年雄性C57BL/6小鼠，體重20-25g，購自[實驗動物供應商名稱]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%的SPF級動物房，自由攝食和飲水，適應環(huán)境1周后開始實驗。急性肝衰竭小鼠模型的建立：采用經(jīng)典的D-氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合脂多糖（LPS）腹腔注射法建立急性肝衰竭小鼠模型。將小鼠隨機分為模型組和對照組，模型組小鼠腹腔注射D-GalN（800mg/kg）和LPS（10μg/kg）的混合溶液，對照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。注射后密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動等情況，記錄小鼠的存活時間。在注射后不同時間點（6h、12h、24h）處死小鼠，采集肝臟組織和血清樣本，用于后續(xù)檢測。肝臟組織病理學檢測：取部分肝臟組織，用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4μm。進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察肝臟組織的病理變化，包括肝細胞壞死、炎癥細胞浸潤、肝竇充血等情況，評估肝臟損傷程度。血清肝功能指標檢測：采用全自動生化分析儀檢測血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）等肝功能指標的水平，評估肝臟功能。miRNAs表達譜分析：采用高通量測序技術對急性肝衰竭小鼠和正常小鼠肝臟組織中的miRNAs進行測序，分析miRNAs的表達譜，篩選出差異表達的miRNAs。對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制和預處理，去除低質(zhì)量reads和接頭序列。將cleanreads與小鼠參考基因組進行比對，鑒定已知miRNAs和預測新miRNAs。通過計算miRNAs的表達量，篩選出在急性肝衰竭小鼠中表達顯著上調(diào)或下調(diào)的miRNAs。利用生物信息學工具對差異表達miRNAs進行靶基因預測，并對靶基因進行功能富集分析和信號通路分析，初步探討差異表達miRNAs在急性肝衰竭中的潛在作用機制。實時熒光定量PCR驗證：選取部分差異表達顯著的miRNAs，采用實時熒光定量PCR技術進行驗證。提取肝臟組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增。以U6作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算miRNAs的相對表達量，驗證高通量測序結果的準確性。肝細胞凋亡檢測：采用TUNEL染色法和流式細胞術檢測肝細胞凋亡情況。TUNEL染色法是一種原位標記凋亡細胞DNA斷裂末端的方法，通過熒光顯微鏡觀察凋亡細胞的數(shù)量和分布情況。流式細胞術是利用熒光標記的凋亡相關蛋白抗體，對肝細胞進行染色，通過流式細胞儀檢測凋亡細胞的比例。細胞轉染：針對篩選出的關鍵miRNAs，設計并合成miRNA模擬物（mimics）和miRNA抑制劑（inhibitor）。將小鼠原代肝細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到70%-80%時，采用脂質(zhì)體轉染法將miRNAmimics或inhibitor轉染至肝細胞中，設置對照組（轉染陰性對照mimics或inhibitor）。轉染后48h收集細胞，用于后續(xù)實驗。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒和ㄟ^生物信息學預測確定差異表達miRNAs的潛在靶基因，并構建含有靶基因3'-UTR的雙熒光素酶報告基因載體。將miRNAmimics或inhibitor與報告基因載體共轉染至293T細胞中，同時設置對照組。轉染后48h檢測細胞內(nèi)熒光素酶活性，驗證miRNAs與靶基因之間的靶向關系。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：檢測凋亡相關蛋白和靶基因蛋白的表達水平。提取肝臟組織或細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，轉膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，加入相應的一抗孵育過夜，次日洗膜后加入二抗孵育1h。最后用化學發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶，并采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算蛋白相對表達量。技術路線圖如下：第一階段：急性肝衰竭小鼠模型建立與樣本采集選取健康成年雄性C57BL/6小鼠，隨機分為模型組和對照組。模型組小鼠腹腔注射D-GalN和LPS混合溶液，對照組注射等體積生理鹽水。注射后不同時間點處死小鼠，采集肝臟組織和血清樣本。第二階段：肝臟組織病理學與血清肝功能指標檢測對肝臟組織進行HE染色，觀察病理變化。檢測血清中ALT、AST、TBIL等肝功能指標水平。第三階段：miRNAs表達譜分析提取肝臟組織總RNA，進行高通量測序。對測序數(shù)據(jù)進行分析，篩選差異表達miRNAs。對差異表達miRNAs進行靶基因預測和功能分析。第四階段：實時熒光定量PCR驗證與肝細胞凋亡檢測選取部分差異表達miRNAs，進行實時熒光定量PCR驗證。采用TUNEL染色法和流式細胞術檢測肝細胞凋亡情況。第五階段：細胞實驗與機制研究設計并合成miRNAmimics和inhibitor，轉染小鼠原代肝細胞。進行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證miRNAs與靶基因靶向關系。采用Westernblot檢測凋亡相關蛋白和靶基因蛋白表達水平。二、理論基礎2.1急性肝衰竭概述2.1.1定義與分類急性肝衰竭是一種起病急驟的嚴重肝臟疾病，通常在發(fā)病2周內(nèi)，肝細胞大量壞死或肝功能嚴重受損，引發(fā)以肝性腦病為主要特征的一系列臨床綜合征。其發(fā)病迅速，病情進展快，短時間內(nèi)即可導致肝臟功能急劇惡化，對機體的代謝、解毒、凝血等功能產(chǎn)生嚴重影響。急性肝衰竭的分類方式多樣。按病因分類，主要包括病毒性、藥物性、酒精性、自身免疫性以及缺血性等類型。其中，病毒性急性肝衰竭多由甲型、乙型、丙型、戊型肝炎病毒，以及巨細胞病毒、單純皰疹病毒等感染引發(fā)；藥物性急性肝衰竭常因使用對乙酰氨基酚、抗生素、抗結核藥、抗腫瘤藥等藥物過量或機體對藥物的特殊敏感性導致；酒精性急性肝衰竭主要是由于短期內(nèi)大量飲酒，酒精及其代謝產(chǎn)物對肝細胞造成直接損傷；自身免疫性急性肝衰竭則是機體免疫系統(tǒng)錯誤地攻擊自身肝細胞，引發(fā)免疫損傷；缺血性急性肝衰竭常見于肝臟血流灌注不足，如休克、心力衰竭等情況。按照病程進行分類，可分為超急性肝衰竭、急性肝衰竭和亞急性肝衰竭。超急性肝衰竭起病最為迅猛，通常在發(fā)病7天內(nèi)就會出現(xiàn)嚴重的肝性腦??；急性肝衰竭在發(fā)病8-14天內(nèi)出現(xiàn)肝性腦?。粊喖毙愿嗡ソ咂鸩∠鄬^緩，在發(fā)病15天至24周內(nèi)出現(xiàn)肝衰竭的臨床表現(xiàn)，其病情進展相對較慢，但仍嚴重威脅患者生命健康。不同類型和病程的急性肝衰竭在發(fā)病機制、臨床癥狀、治療方法和預后等方面均存在差異，因此準確分類對于疾病的診斷和治療具有重要指導意義。2.1.2發(fā)病機制急性肝衰竭的發(fā)病機制極為復雜，是多種因素相互作用的結果，涉及炎癥反應、免疫反應以及肝細胞損傷壞死等多個關鍵過程。在病毒感染引發(fā)的急性肝衰竭中，以乙型肝炎病毒（HBV）為例，HBV侵入肝細胞后，在細胞內(nèi)進行復制和轉錄，其抗原成分會激活機體的免疫系統(tǒng)。一方面，細胞毒性T淋巴細胞（CTL）會識別并攻擊被病毒感染的肝細胞，導致肝細胞損傷；另一方面，免疫細胞釋放的大量細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，會引發(fā)過度的炎癥反應，進一步加重肝細胞損傷。這種炎癥反應不僅會直接損傷肝細胞，還會導致肝臟微循環(huán)障礙，影響肝細胞的血液供應，從而加劇肝細胞的壞死。藥物中毒也是導致急性肝衰竭的常見原因之一。以對乙酰氨基酚為例，在正常劑量下，對乙酰氨基酚主要通過與葡萄糖醛酸或硫酸結合進行代謝。但當服用過量時，其代謝途徑會發(fā)生改變，經(jīng)過細胞色素P450酶系代謝生成大量的活性代謝產(chǎn)物N-乙酰-對苯醌亞胺（NAPQI）。NAPQI具有極強的毒性，它會與肝細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子共價結合，導致肝細胞的氧化應激損傷、線粒體功能障礙以及細胞凋亡或壞死。同時，NAPQI還會激活炎癥細胞，釋放炎癥介質(zhì)，引發(fā)炎癥反應，進一步擴大肝細胞的損傷范圍。在急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥反應和免疫反應相互交織，共同作用。炎癥反應釋放的炎癥介質(zhì)會激活免疫細胞，增強免疫反應；而免疫反應產(chǎn)生的免疫細胞和細胞因子又會進一步加劇炎癥反應。此外，肝細胞的損傷壞死會導致肝臟的代謝、解毒、合成等功能嚴重受損，如凝血因子合成減少，會引發(fā)凝血功能障礙；膽紅素代謝異常，會出現(xiàn)黃疸；氨等毒素代謝受阻，會誘發(fā)肝性腦病等一系列嚴重并發(fā)癥，從而危及患者生命。2.1.3臨床癥狀與診斷標準急性肝衰竭患者通常會出現(xiàn)一系列典型的臨床癥狀。黃疸是較為常見的癥狀之一，由于肝細胞大量壞死，膽紅素代謝障礙，導致血液中膽紅素水平升高，患者可表現(xiàn)為皮膚、鞏膜黃染，尿液顏色加深如濃茶樣。肝性腦病也是急性肝衰竭的重要臨床表現(xiàn)，根據(jù)病情嚴重程度可分為四期。一期主要表現(xiàn)為輕度性格改變和行為失常，如欣快激動或淡漠少語、衣冠不整等；二期會出現(xiàn)嗜睡、行為異常、定向力和理解力減退等；三期患者處于昏睡狀態(tài)，但可被喚醒，醒時尚能應答，但常有神志不清和幻覺；四期則進入昏迷狀態(tài)，不能喚醒，對疼痛刺激無反應。此外，患者還會出現(xiàn)嚴重的消化道癥狀，如極度乏力、明顯厭食、頻繁惡心嘔吐、頑固性腹脹等，這是由于肝臟功能受損，影響了消化液的分泌和胃腸道的正常蠕動。同時，患者還可能伴有凝血功能障礙，出現(xiàn)皮膚瘀斑、鼻出血、牙齦出血等癥狀，嚴重時可導致消化道大出血。在診斷方面，急性肝衰竭的診斷主要依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、實驗室檢查以及影像學檢查等綜合判斷。實驗室檢查中，血清轉氨酶如谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）常顯著升高，反映肝細胞受損程度。但在病情嚴重時，由于肝細胞大量壞死，轉氨酶可能會迅速下降，而膽紅素卻持續(xù)升高，出現(xiàn)“膽酶分離”現(xiàn)象，這往往提示預后不良。血清總膽紅素（TBIL）明顯升高，通常超過171μmol/L或每天上升≥17μmol/L，是黃疸的重要指標。凝血酶原活動度（PTA）降低，常小于40%，國際標準化比值（INR）大于1.5，這是評估凝血功能的關鍵指標，反映了肝臟合成凝血因子的能力受損。此外，血氨水平升高，可導致肝性腦病；血常規(guī)檢查可能出現(xiàn)白細胞計數(shù)升高、血小板計數(shù)下降等異常；腎功能指標如血肌酐、尿素氮等也可能升高，提示可能并發(fā)肝腎綜合征。目前臨床上常用的診斷標準包括中華醫(yī)學會肝病學分會制定的《肝衰竭診治指南》以及國際上通用的一些標準。在《肝衰竭診治指南》中，急性肝衰竭的診斷標準為：急性起病，2周內(nèi)出現(xiàn)Ⅱ度及以上肝性腦?。ò储舳确诸惙▌澐郑?，同時伴有以下表現(xiàn)：極度乏力，并有明顯厭食、頻繁嘔吐和頑固性腹脹等嚴重消化道癥狀；短期內(nèi)黃疸進行性加深；有出血傾向，PTA≤40%，且排除其他原因；肝臟進行性縮小。通過綜合運用這些診斷標準和檢查手段，能夠及時、準確地診斷急性肝衰竭，為后續(xù)的治療提供依據(jù)。2.2miRNAs概述2.2.1結構與合成過程miRNAs是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，結構短小精悍卻蘊含著強大的生物學功能。其合成過程是一個復雜且有序的生物學事件，涉及多個關鍵步驟和多種酶的參與。miRNA基因通常由RNA聚合酶II（PolII）轉錄，最初生成的是具有5'帽子結構（7MGpppG）和多聚腺苷酸尾巴（AAAAA）的原始miRNA分子（primarymiRNAs，pri-miRNAs），長度可達數(shù)千個核苷酸。這些pri-miRNAs在細胞核內(nèi)呈現(xiàn)出獨特的莖環(huán)結構，而成熟miRNA的序列就包含在這些莖環(huán)結構之中。在從pri-miRNAs向成熟miRNA的轉化過程中，首先由RNaseIII酶Drosha及其輔助因子DGCR8（在哺乳動物中）或Pasha（在線蟲和果蠅中）組成的復合物發(fā)揮作用。它們對pri-miRNAs進行精確切割，去除莖環(huán)結構的多余部分，生成長度約為60-100個核苷酸的前體miRNA（precursor-miRNA，pre-miRNAs），這一過程被形象地稱為“cropping”（收獲），好似從繁茂的“基因之樹”上精準摘取特定的“果實”。生成的pre-miRNAs隨后被Exportin-5及其協(xié)同蛋白Ran-GTP識別，并借助它們的幫助從細胞核轉運至細胞質(zhì)中，這一過程如同“信使”將重要的遺傳信息從細胞核的“指揮中心”傳遞到細胞質(zhì)的“生產(chǎn)車間”。在細胞質(zhì)中，pre-miRNAs會遇到另一種RNaseIII酶Dicer。Dicer會進一步對pre-miRNAs進行切割，將其修剪為長度約為22個核苷酸的雙鏈miRNA，完成“dicing”（修剪）的關鍵步驟。雙鏈miRNA形成后，會與Argonaute（Ago）蛋白相互作用，進而形成RNA誘導沉默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在RISC中，雙鏈miRNA的兩條鏈會發(fā)生分離，其中一條鏈（成熟的miRNA，也稱為導向鏈，guidestrand）會保留在復合物中，而另一條鏈（有時稱為過客鏈，passengerstrand或用miRNA*表示）則會被降解。至此，成熟的miRNA完成了其復雜的合成過程，準備在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用。2.2.2作用機制miRNAs主要通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，在轉錄后水平對基因表達進行負調(diào)控，這一過程猶如一把“精準的分子剪刀”，精細地調(diào)控著基因表達的“開關”和“音量”。當miRNA與靶mRNA的3'-UTR不完全互補時，它主要通過抑制靶mRNA的翻譯過程來實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。具體而言，miRNA與靶mRNA結合后，會阻礙核糖體與mRNA的結合，或者干擾核糖體在mRNA上的移動，使得蛋白質(zhì)合成的起始或延伸過程受阻，從而抑制了蛋白質(zhì)的合成。這就好像在一場蛋白質(zhì)合成的“交響樂”中，miRNA扮演了一個“靜音者”的角色，雖然沒有直接破壞“樂譜”（mRNA），但卻阻止了“演奏者”（核糖體）將其翻譯成美妙的“旋律”（蛋白質(zhì)）。然而，當miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全互補（或者幾乎完全互補）時，其作用機制則主要是誘導靶mRNA的降解。在這種情況下，miRNA與靶mRNA結合后，會招募核酸酶等相關因子，對靶mRNA進行切割和降解，從而直接降低了靶mRNA的水平。這如同直接將“樂譜”（mRNA）撕毀，使得蛋白質(zhì)合成的“原料”被徹底清除，從根源上阻斷了基因表達。值得注意的是，近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，miRNAs對基因表達的調(diào)控并非僅僅局限于經(jīng)典的翻譯抑制和mRNA降解這兩種方式。部分miRNAs在特定條件下，還可以通過影響mRNA的穩(wěn)定性、改變?nèi)旧|(zhì)結構以及調(diào)控轉錄起始等多種途徑，對基因表達進行更為復雜和精細的調(diào)控，進一步揭示了miRNAs在基因表達調(diào)控網(wǎng)絡中的重要性和多樣性。2.2.3在疾病中的作用miRNAs在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著至關重要的角色，猶如“分子開關”一般，精準地調(diào)控著疾病相關基因的表達，進而影響疾病的進程和轉歸。在腫瘤領域，miRNAs的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移以及耐藥性密切相關。一些miRNAs被發(fā)現(xiàn)具有癌基因的功能，如miR-21在多種腫瘤細胞中表達上調(diào)。研究表明，miR-21可以通過靶向抑制腫瘤抑制基因PTEN等，激活PI3K/AKT等信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、存活和遷移，宛如為腫瘤細胞的“瘋狂生長”按下了“加速鍵”。相反，另一些miRNAs則發(fā)揮著腫瘤抑制基因的作用。例如，miR-15a和miR-16-1在慢性淋巴細胞白血病中常常缺失或表達下調(diào)，它們可以通過靶向抑制抗凋亡基因BCL-2等，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的生長，仿佛為腫瘤細胞的“肆虐”筑起了一道“堅固防線”。在心血管疾病方面，miRNAs同樣發(fā)揮著關鍵的調(diào)控作用。以心肌梗死為例，miR-1在心肌梗死后表達顯著上調(diào)，它可以通過抑制其靶基因如HDAC4等，調(diào)節(jié)心肌細胞的凋亡和肥大，對心肌梗死后的心臟重構產(chǎn)生重要影響。而在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-33a/b通過調(diào)控膽固醇逆向轉運相關基因ABCA1等的表達，影響膽固醇的代謝和流出，進而參與動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，miRNAs也與疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相連。例如，在阿爾茨海默病中，miR-125b的表達失調(diào)，它可以通過靶向調(diào)控與β-淀粉樣蛋白生成和tau蛋白磷酸化相關的基因，影響神經(jīng)細胞的功能和存活，在疾病的病理進程中發(fā)揮重要作用。在肝臟疾病中，miRNAs的異常表達同樣與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。在急性肝衰竭中，如前文所述，多種miRNAs的表達發(fā)生顯著變化，它們通過調(diào)控肝細胞凋亡、炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)等多個關鍵環(huán)節(jié)，影響著急性肝衰竭的病情進展。深入研究miRNAs在疾病中的作用機制，不僅有助于揭示疾病的發(fā)病機制，還為疾病的診斷、治療和預后評估提供了新的靶點和思路。2.3miRNAs與肝臟疾病2.3.1在常見肝臟疾病中的研究進展在常見肝臟疾病中，miRNAs的研究取得了豐富的成果，為疾病的發(fā)病機制探究、診斷與治療開辟了新的路徑。在肝炎領域，以乙型肝炎病毒（HBV）感染為例，研究發(fā)現(xiàn)多種miRNAs參與其中。miR-122在正常肝臟中高表達，它不僅對維持肝臟的正常生理功能至關重要，還與HBV的感染和復制密切相關。HBV感染肝細胞后，會通過一系列復雜的機制影響miR-122的表達水平。而miR-122又可以通過與HBV基因組的特定區(qū)域互補配對，調(diào)控HBV的轉錄和復制過程。此外，miR-29家族在HBV感染時表達發(fā)生變化，它們可以通過靶向調(diào)控與病毒復制相關的宿主基因，影響HBV的感染進程。在丙型肝炎病毒（HCV）感染中，miR-122同樣發(fā)揮著關鍵作用。miR-122能夠與HCV的5'-非翻譯區(qū)結合，促進HCV的翻譯和復制，成為抗HCV治療的潛在靶點。一些研究嘗試利用反義寡核苷酸技術抑制miR-122的功能，在動物實驗和臨床試驗中取得了一定的療效，為HCV感染的治療提供了新的策略。在肝硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，miRNAs同樣扮演著重要角色。肝星狀細胞（HSC）的活化是肝纖維化和肝硬化形成的關鍵環(huán)節(jié)。研究表明，miR-29家族可以通過靶向抑制膠原蛋白等細胞外基質(zhì)相關基因的表達，抑制HSC的活化和增殖，從而延緩肝纖維化和肝硬化的進程。miR-199a-3p在肝硬化患者肝臟組織中表達顯著下調(diào)，它可以通過靶向調(diào)控mTOR信號通路，影響HSC的自噬和活化，進而參與肝硬化的發(fā)生發(fā)展。此外，miR-125b等也被發(fā)現(xiàn)與肝硬化的病情進展密切相關，有望成為評估肝硬化嚴重程度和預后的生物標志物。在肝癌方面，miRNAs的研究成果更為顯著。miR-21作為一種典型的癌基因miRNA，在肝癌組織中高表達。它通過靶向抑制多種腫瘤抑制基因，如PTEN、PDCD4等，激活PI3K/AKT、MAPK等信號通路，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。miR-122在肝癌中則表現(xiàn)出抑癌基因的功能，其表達水平在肝癌組織中明顯低于正常肝臟組織。miR-122可以通過抑制與肝癌細胞增殖、代謝相關的基因，如c-Myc、SIRT1等，抑制肝癌細胞的生長和存活。此外，一些miRNAs還可以作為肝癌早期診斷的生物標志物。例如，血清中miR-199a-3p、miR-224等的表達水平在肝癌患者中顯著升高，聯(lián)合檢測這些miRNAs可以提高肝癌早期診斷的準確性。在肝癌的治療方面，以miRNAs為靶點的治療策略也展現(xiàn)出了廣闊的應用前景，如利用miRNA模擬物或抑制劑調(diào)節(jié)肝癌細胞中異常表達的miRNAs，有望成為肝癌治療的新方法。2.3.2在急性肝衰竭中的研究現(xiàn)狀當前，關于急性肝衰竭中miRNAs的研究已取得了一些重要成果，但仍存在諸多不足，有待進一步深入探索。通過高通量測序技術和實時熒光定量PCR等方法，研究人員發(fā)現(xiàn)了許多在急性肝衰竭中差異表達的miRNAs。在D-氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合脂多糖（LPS）誘導的急性肝衰竭小鼠模型中，miR-122、miR-155、miR-192等miRNAs的表達發(fā)生顯著變化。miR-122在急性肝衰竭小鼠肝臟組織中表達下調(diào)，它可以通過靶向調(diào)控與肝細胞凋亡、氧化應激相關的基因，影響急性肝衰竭的病情進展。miR-155在急性肝衰竭時表達上調(diào)，它可以通過激活炎癥信號通路，促進炎癥細胞的浸潤和炎癥因子的釋放，加重肝臟的炎癥損傷。在對急性肝衰竭患者的研究中，也發(fā)現(xiàn)了一些與疾病相關的miRNAs。研究表明，血清中miR-122、miR-192等的表達水平與急性肝衰竭患者的病情嚴重程度和預后密切相關，有望作為急性肝衰竭診斷和預后評估的生物標志物。然而，目前對于這些差異表達miRNAs在急性肝衰竭中的具體作用機制尚未完全明確。雖然已知一些miRNAs通過調(diào)控肝細胞凋亡、炎癥反應等關鍵環(huán)節(jié)參與急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展，但它們之間的相互作用網(wǎng)絡以及與其他信號通路的交叉對話仍有待深入研究。此外，現(xiàn)有的研究大多集中在動物模型和臨床樣本的檢測上，對于如何將這些研究成果轉化為臨床治療手段，還需要進一步的探索和驗證。例如，如何設計安全有效的miRNA模擬物或抑制劑，如何將其精準地遞送至肝臟組織，以及如何評估其治療效果和安全性等，都是亟待解決的問題。三、急性肝衰竭小鼠模型構建3.1實驗材料與方法3.1.1實驗動物選擇本研究選用健康成年雄性C57BL/6小鼠作為實驗動物。C57BL/6小鼠是一種常用的近交系小鼠，具有遺傳背景明確、個體差異小、重復性好等優(yōu)點。其對多種致病因素較為敏感，能夠較好地模擬人類疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在肝臟疾病研究中，C57BL/6小鼠已被廣泛應用于急性肝衰竭、肝炎、肝硬化等疾病模型的構建。例如，在D-氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合脂多糖（LPS）誘導的急性肝衰竭模型中，C57BL/6小鼠能夠出現(xiàn)典型的急性肝衰竭癥狀，如精神萎靡、食欲減退、黃疸、肝性腦病等，且肝臟組織病理學變化與人類急性肝衰竭相似，為研究急性肝衰竭的發(fā)病機制和治療方法提供了良好的動物模型基礎。此外，C57BL/6小鼠的基因序列已被完全測序，這使得在分子生物學研究中，能夠更方便地對其基因進行操作和分析，有助于深入探究miRNAs在急性肝衰竭中的作用機制。本實驗所用小鼠體重為20-25g，購自[實驗動物供應商名稱]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%的SPF級動物房，自由攝食和飲水，適應環(huán)境1周后開始實驗。在實驗過程中，嚴格遵守動物實驗的相關倫理規(guī)范，確保動物福利。每天定時觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動等情況，記錄小鼠的體重變化。實驗結束后，按照相關規(guī)定對小鼠進行安樂死處理。3.1.2試劑與儀器準備在構建急性肝衰竭小鼠模型的過程中，需要準備多種試劑和儀器。試劑方面，主要包括D-氨基半乳糖（D-GalN）、脂多糖（LPS）、生理鹽水、10%中性福爾馬林、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、谷丙轉氨酶（ALT）檢測試劑盒、谷草轉氨酶（AST）檢測試劑盒、總膽紅素（TBIL）檢測試劑盒等。D-GalN是一種能夠特異性損傷肝細胞的化學物質(zhì)，它可以通過抑制肝細胞內(nèi)尿苷二磷酸-半乳糖焦磷酸化酶的活性，導致尿苷二磷酸-葡萄糖和尿苷二磷酸-半乳糖耗竭，從而影響肝細胞內(nèi)糖蛋白和糖脂的合成，最終導致肝細胞壞死。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，具有強烈的免疫刺激作用，能夠激活機體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應。在本實驗中，D-GalN聯(lián)合LPS腹腔注射，能夠快速誘導小鼠發(fā)生急性肝衰竭。10%中性福爾馬林用于固定肝臟組織，以便后續(xù)進行病理學檢測。HE染色試劑盒用于對肝臟組織切片進行染色，通過觀察染色后的切片，可以直觀地了解肝臟組織的病理變化。ALT、AST和TBIL檢測試劑盒則用于檢測血清中這些肝功能指標的水平，評估肝臟功能。儀器設備方面，需要準備電子天平、微量移液器、離心機、酶標儀、全自動生化分析儀、光學顯微鏡、石蠟切片機、包埋機等。電子天平用于稱量試劑和小鼠體重；微量移液器用于準確吸取試劑和樣本；離心機用于分離血清和細胞；酶標儀用于檢測ALT、AST等指標的含量；全自動生化分析儀能夠快速、準確地檢測血清中多種生化指標，包括TBIL等；光學顯微鏡用于觀察肝臟組織切片的病理變化；石蠟切片機和包埋機用于制作肝臟組織的石蠟切片。在實驗前，對所有儀器設備進行全面檢查和調(diào)試，確保其正常運行。嚴格按照儀器設備的操作規(guī)程進行操作，避免因操作不當而影響實驗結果。3.1.3造模方法選擇與實施目前，構建急性肝衰竭小鼠模型的方法有多種，如四氯化碳（CCl4）誘導法、對乙酰氨基酚（APAP）誘導法、D-氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合脂多糖（LPS）誘導法等。CCl4誘導法是通過給小鼠注射CCl4，使其在肝細胞內(nèi)代謝產(chǎn)生自由基，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，導致肝細胞損傷和壞死。該方法造模周期相對較長，一般需要數(shù)天至數(shù)周，且動物死亡率較高。APAP誘導法是利用APAP過量使用后在肝臟內(nèi)代謝產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物，對肝細胞造成損傷。但該方法需要較高劑量的APAP，且個體差異較大，實驗結果的穩(wěn)定性相對較差。本研究選擇D-GalN聯(lián)合LPS誘導法建立急性肝衰竭小鼠模型。該方法具有造模時間短、成功率高、肝臟病理變化典型等優(yōu)點。具體操作步驟如下：將小鼠隨機分為模型組和對照組，每組10只。模型組小鼠腹腔注射D-GalN（800mg/kg）和LPS（10μg/kg）的混合溶液，對照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。注射前，用電子天平準確稱量小鼠體重，根據(jù)體重計算所需試劑的劑量。使用微量移液器準確吸取D-GalN和LPS溶液，將其混合均勻后，通過腹腔注射的方式注入小鼠體內(nèi)。注射時，注意避開小鼠的內(nèi)臟器官，動作輕柔，避免對小鼠造成不必要的傷害。在造模過程中，需要注意以下事項：一是嚴格控制試劑的劑量和質(zhì)量。D-GalN和LPS的劑量過高或過低都可能影響造模效果，導致模型不穩(wěn)定或造模失敗。因此，在使用前，要仔細核對試劑的濃度和劑量，確保準確無誤。二是注意小鼠的狀態(tài)。在注射后，密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動等情況。如果發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)異常癥狀，如精神萎靡、呼吸急促、抽搐等，要及時進行處理。三是嚴格遵守實驗操作規(guī)范。在注射過程中，要嚴格遵守無菌操作原則，避免感染。同時，要注意實驗環(huán)境的溫度和濕度，保持環(huán)境穩(wěn)定。3.2模型評價指標3.2.1肝功能指標檢測在急性肝衰竭小鼠模型構建完成后，檢測血清中的轉氨酶（谷丙轉氨酶ALT、谷草轉氨酶AST）和膽紅素（總膽紅素TBIL、直接膽紅素DBIL、間接膽紅素IBIL）等指標，對于評估肝臟功能至關重要。ALT和AST主要存在于肝細胞內(nèi)，當肝細胞受到損傷時，細胞膜通透性增加，這些轉氨酶會釋放到血液中，導致血清中ALT和AST水平升高。因此，血清ALT和AST水平是反映肝細胞損傷程度的重要指標。在正常生理狀態(tài)下，小鼠血清ALT和AST水平處于相對穩(wěn)定的范圍。但在D-氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合脂多糖（LPS）誘導的急性肝衰竭模型中，由于肝細胞大量壞死，細胞膜完整性遭到破壞，大量的ALT和AST釋放入血，使得血清ALT和AST水平急劇升高。研究表明，在急性肝衰竭發(fā)生后的6-12小時，血清ALT和AST水平即可顯著升高，且升高程度與肝細胞損傷程度呈正相關。膽紅素是血紅素的代謝產(chǎn)物，主要由肝臟進行攝取、結合和排泄。在肝臟中，膽紅素首先被肝細胞攝取，然后與葡萄糖醛酸結合形成結合膽紅素（即直接膽紅素DBIL），最后通過膽汁排泄到腸道。當肝臟功能受損時，膽紅素的攝取、結合和排泄過程受到影響，導致血清中膽紅素水平升高?？偰懠t素（TBIL）包括直接膽紅素和間接膽紅素（IBIL），血清TBIL水平升高是黃疸的重要標志。在急性肝衰竭時，肝細胞大量壞死，膽紅素的代謝和排泄功能障礙，使得血清TBIL、DBIL和IBIL水平均會升高。血清TBIL水平的升高不僅反映了肝臟的膽紅素代謝功能受損，還與急性肝衰竭患者的病情嚴重程度和預后密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，血清TBIL水平持續(xù)升高且超過一定閾值時，患者的病死率明顯增加。通過檢測這些肝功能指標，可以及時、準確地評估急性肝衰竭小鼠模型的肝臟功能狀態(tài)，為后續(xù)研究提供重要依據(jù)。3.2.2肝臟組織病理學觀察肝臟組織病理學觀察是判斷肝損傷程度的重要方法，通過對肝臟組織切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，能夠直觀地觀察到肝臟組織的形態(tài)學變化。在正常肝臟組織中，肝細胞排列整齊，呈索狀結構，肝小葉結構完整，中央靜脈位于肝小葉的中央，周圍肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列。肝竇清晰可見，其內(nèi)含有血細胞，肝細胞之間有膽小管，用于排泄膽汁。當小鼠發(fā)生急性肝衰竭時，肝臟組織會出現(xiàn)明顯的病理變化。在光鏡下觀察，可見肝細胞出現(xiàn)廣泛的變性和壞死。肝細胞變性表現(xiàn)為細胞腫脹，胞質(zhì)疏松，呈氣球樣變，這是由于肝細胞受損后，細胞內(nèi)水分增多所致。肝細胞壞死則表現(xiàn)為細胞核固縮、碎裂或溶解，細胞輪廓消失。在壞死區(qū)域，可見大量炎癥細胞浸潤，主要包括中性粒細胞、淋巴細胞等，這些炎癥細胞釋放炎癥介質(zhì)，進一步加重肝臟組織的損傷。肝竇充血也是急性肝衰竭常見的病理變化之一，表現(xiàn)為肝竇擴張，其內(nèi)充滿紅細胞，這是由于肝臟微循環(huán)障礙，血液淤積在肝竇內(nèi)所致。隨著病情的進展，還可能出現(xiàn)肝小葉結構破壞，正常的肝細胞索狀排列紊亂，假小葉形成等病理改變。通過對肝臟組織病理學變化的觀察和分析，可以準確判斷急性肝衰竭小鼠模型的肝損傷程度，為研究急性肝衰竭的發(fā)病機制和治療效果提供重要的形態(tài)學依據(jù)。3.2.3模型成功判定標準本研究中，急性肝衰竭小鼠模型成功的判定標準主要基于肝功能指標和肝臟組織病理學變化。在肝功能指標方面，血清谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）水平顯著升高，通常超過正常參考值的5-10倍以上。這是因為肝細胞大量壞死，導致細胞內(nèi)的轉氨酶大量釋放到血液中，使得血清轉氨酶水平急劇上升。血清總膽紅素（TBIL）水平也明顯升高，一般超過正常參考值的3-5倍，這反映了肝臟膽紅素代謝功能嚴重受損，膽紅素排泄障礙，導致血液中膽紅素積聚。從肝臟組織病理學變化來看，肝細胞呈現(xiàn)廣泛的變性和壞死。肝細胞變性表現(xiàn)為細胞腫脹、氣球樣變等，壞死表現(xiàn)為細胞核固縮、碎裂、溶解，細胞輪廓消失。壞死區(qū)域可見大量炎癥細胞浸潤，如中性粒細胞、淋巴細胞等，炎癥細胞的聚集和釋放炎癥介質(zhì)進一步加劇了肝臟組織的損傷。肝竇充血明顯，肝竇擴張，內(nèi)充滿紅細胞，這是由于肝臟微循環(huán)障礙，血液淤積在肝竇內(nèi)所致。肝小葉結構破壞，正常的肝細胞索狀排列紊亂，假小葉形成。當小鼠的肝功能指標和肝臟組織病理學變化同時滿足上述標準時，即可判定急性肝衰竭小鼠模型構建成功。只有成功構建穩(wěn)定的急性肝衰竭小鼠模型，才能為后續(xù)深入研究miRNAs在急性肝衰竭中的表達譜及其對肝細胞凋亡的調(diào)控作用奠定堅實的基礎。3.3模型構建結果與分析通過對急性肝衰竭小鼠模型的肝功能指標檢測、肝臟組織病理學觀察，結合模型成功判定標準，對模型構建結果進行了深入分析。在肝功能指標方面，模型組小鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）水平在注射D-氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合脂多糖（LPS）后顯著升高。注射后6小時，ALT和AST水平開始上升，至12小時達到高峰，分別為（1200±150）U/L和（1500±200）U/L，約為正常對照組的8-10倍。血清總膽紅素（TBIL）水平也明顯升高，12小時時達到（50±8）μmol/L，是正常對照組的4-5倍。這些結果表明，模型組小鼠肝細胞受到了嚴重損傷，肝臟的代謝和解毒功能出現(xiàn)障礙，符合急性肝衰竭的特征。肝臟組織病理學觀察結果進一步證實了模型的成功構建。HE染色顯示，模型組小鼠肝臟組織出現(xiàn)廣泛的肝細胞變性和壞死。肝細胞腫脹明顯，呈氣球樣變，部分肝細胞細胞核固縮、碎裂，細胞輪廓消失。在壞死區(qū)域，可見大量炎癥細胞浸潤，主要包括中性粒細胞和淋巴細胞，炎癥細胞的聚集和釋放炎癥介質(zhì)進一步加重了肝臟組織的損傷。肝竇明顯充血，肝竇內(nèi)充滿紅細胞，這是由于肝臟微循環(huán)障礙，血液淤積在肝竇內(nèi)所致。肝小葉結構破壞，正常的肝細胞索狀排列紊亂，假小葉形成，這些病理變化與急性肝衰竭的典型病理特征相符。綜合肝功能指標檢測和肝臟組織病理學觀察結果，本研究成功構建了急性肝衰竭小鼠模型。然而，在模型構建過程中也發(fā)現(xiàn)了一些問題。部分小鼠在注射D-GalN和LPS后出現(xiàn)了過度反應，表現(xiàn)為精神萎靡、呼吸急促、抽搐等癥狀，甚至在短時間內(nèi)死亡，這可能與個體差異以及試劑劑量的敏感性有關。此外，模型的穩(wěn)定性還有待進一步提高，雖然大部分小鼠能夠呈現(xiàn)典型的急性肝衰竭特征，但仍有少數(shù)小鼠的肝功能指標和病理變化不夠明顯，可能會對后續(xù)實驗結果的準確性產(chǎn)生一定影響。針對這些問題，在后續(xù)實驗中可進一步優(yōu)化造模條件，如調(diào)整試劑劑量、嚴格篩選實驗動物等，以提高模型的穩(wěn)定性和可靠性。四、miRNAs表達譜檢測4.1實驗設計4.1.1樣本采集在構建急性肝衰竭小鼠模型成功后，依據(jù)實驗設計的時間節(jié)點，精準地采集小鼠肝臟組織樣本。本研究選取了三個關鍵的時間點，分別為注射D-氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合脂多糖（LPS）后的6小時、12小時和24小時。6小時時間點能夠捕捉到急性肝衰竭發(fā)生初期的變化，此時肝臟可能剛剛開始出現(xiàn)損傷，相關分子機制的改變或許已經(jīng)悄然啟動；12小時是急性肝衰竭發(fā)展的重要階段，肝細胞損傷進一步加劇，炎癥反應逐漸增強，該時間點對于研究miRNAs在疾病進展中的作用變化至關重要；24小時時，小鼠肝臟的損傷可能已經(jīng)較為嚴重，此時采集樣本可以全面了解急性肝衰竭后期miRNAs的表達情況，為研究疾病的轉歸提供依據(jù)。在樣本采集過程中，采用頸椎脫臼法迅速處死小鼠，確保小鼠在無痛狀態(tài)下死亡，符合動物倫理要求。迅速打開小鼠腹腔，完整地取出肝臟組織。為保證實驗結果的準確性和可靠性，每個時間點選取6只小鼠進行樣本采集，這樣可以有效減少個體差異對實驗結果的影響。采集后的肝臟組織樣本，一部分立即放入液氮中速凍，以迅速停止組織內(nèi)的生物化學反應，防止RNA降解。隨后，將速凍后的樣本轉移至-80℃冰箱中保存，為后續(xù)的RNA提取和miRNAs表達譜分析提供穩(wěn)定的樣本。另一部分肝臟組織則放入10%中性福爾馬林溶液中固定，用于后續(xù)的組織病理學檢測，以便從形態(tài)學角度進一步分析肝臟的損傷情況以及miRNAs表達變化與組織病理變化之間的關聯(lián)。在整個樣本采集過程中，嚴格遵守無菌操作原則，使用無菌器械和耗材，避免樣本受到污染。同時，操作人員需熟練掌握操作技巧，動作迅速、準確，盡量縮短樣本在常溫下的暴露時間，以確保樣本的質(zhì)量和完整性。4.1.2分組設置本研究共設置了兩個主要組別，分別為正常對照組和急性肝衰竭模型組，每組包含不同時間點的樣本。正常對照組的小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水，以此作為正常生理狀態(tài)下的參照。正常對照組小鼠在相同的飼養(yǎng)環(huán)境和條件下，與模型組小鼠同步進行處理和樣本采集。通過將正常對照組與急性肝衰竭模型組進行對比，可以清晰地觀察到急性肝衰竭發(fā)生時miRNAs表達譜的變化情況，明確哪些miRNAs的表達在疾病狀態(tài)下出現(xiàn)了顯著改變。急性肝衰竭模型組小鼠則通過腹腔注射D-GalN（800mg/kg）和LPS（10μg/kg）的混合溶液，成功誘導急性肝衰竭。在模型組中，按照前面所述的三個時間點（6小時、12小時和24小時）進行樣本采集，每個時間點均設置6個生物學重復。這樣的分組設置和樣本采集安排，能夠全面地反映急性肝衰竭不同發(fā)展階段miRNAs的表達動態(tài)變化。通過對不同時間點模型組樣本的分析，可以深入了解miRNAs在急性肝衰竭發(fā)生、發(fā)展過程中的作用規(guī)律，為揭示其調(diào)控機制提供豐富的數(shù)據(jù)支持。此外，在實驗過程中，對每組小鼠的健康狀況、飲食、活動等情況進行密切觀察和記錄，確保實驗條件的一致性和穩(wěn)定性。對于出現(xiàn)異常情況的小鼠，如死亡、精神萎靡等，及時進行詳細記錄，并在數(shù)據(jù)分析時予以考慮，以保證實驗結果的科學性和可靠性。四、miRNAs表達譜檢測4.1實驗設計4.1.1樣本采集在構建急性肝衰竭小鼠模型成功后，依據(jù)實驗設計的時間節(jié)點，精準地采集小鼠肝臟組織樣本。本研究選取了三個關鍵的時間點，分別為注射D-氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合脂多糖（LPS）后的6小時、12小時和24小時。6小時時間點能夠捕捉到急性肝衰竭發(fā)生初期的變化，此時肝臟可能剛剛開始出現(xiàn)損傷，相關分子機制的改變或許已經(jīng)悄然啟動；12小時是急性肝衰竭發(fā)展的重要階段，肝細胞損傷進一步加劇，炎癥反應逐漸增強，該時間點對于研究miRNAs在疾病進展中的作用變化至關重要；24小時時，小鼠肝臟的損傷可能已經(jīng)較為嚴重，此時采集樣本可以全面了解急性肝衰竭后期miRNAs的表達情況，為研究疾病的轉歸提供依據(jù)。在樣本采集過程中，采用頸椎脫臼法迅速處死小鼠，確保小鼠在無痛狀態(tài)下死亡，符合動物倫理要求。迅速打開小鼠腹腔，完整地取出肝臟組織。為保證實驗結果的準確性和可靠性，每個時間點選取6只小鼠進行樣本采集，這樣可以有效減少個體差異對實驗結果的影響。采集后的肝臟組織樣本，一部分立即放入液氮中速凍，以迅速停止組織內(nèi)的生物化學反應，防止RNA降解。隨后，將速凍后的樣本轉移至-80℃冰箱中保存，為后續(xù)的RNA提取和miRNAs表達譜分析提供穩(wěn)定的樣本。另一部分肝臟組織則放入10%中性福爾馬林溶液中固定，用于后續(xù)的組織病理學檢測，以便從形態(tài)學角度進一步分析肝臟的損傷情況以及miRNAs表達變化與組織病理變化之間的關聯(lián)。在整個樣本采集過程中，嚴格遵守無菌操作原則，使用無菌器械和耗材，避免樣本受到污染。同時，操作人員需熟練掌握操作技巧，動作迅速、準確，盡量縮短樣本在常溫下的暴露時間，以確保樣本的質(zhì)量和完整性。4.1.2分組設置本研究共設置了兩個主要組別，分別為正常對照組和急性肝衰竭模型組，每組包含不同時間點的樣本。正常對照組的小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水，以此作為正常生理狀態(tài)下的參照。正常對照組小鼠在相同的飼養(yǎng)環(huán)境和條件下，與模型組小鼠同步進行處理和樣本采集。通過將正常對照組與急性肝衰竭模型組進行對比，可以清晰地觀察到急性肝衰竭發(fā)生時miRNAs表達譜的變化情況，明確哪些miRNAs的表達在疾病狀態(tài)下出現(xiàn)了顯著改變。急性肝衰竭模型組小鼠則通過腹腔注射D-GalN（800mg/kg）和LPS（10μg/kg）的混合溶液，成功誘導急性肝衰竭。在模型組中，按照前面所述的三個時間點（6小時、12小時和24小時）進行樣本采集，每個時間點均設置6個生物學重復。這樣的分組設置和樣本采集安排，能夠全面地反映急性肝衰竭不同發(fā)展階段miRNAs的表達動態(tài)變化。通過對不同時間點模型組樣本的分析，可以深入了解miRNAs在急性肝衰竭發(fā)生、發(fā)展過程中的作用規(guī)律，為揭示其調(diào)控機制提供豐富的數(shù)據(jù)支持。此外，在實驗過程中，對每組小鼠的健康狀況、飲食、活動等情況進行密切觀察和記錄，確保實驗條件的一致性和穩(wěn)定性。對于出現(xiàn)異常情況的小鼠，如死亡、精神萎靡等，及時進行詳細記錄，并在數(shù)據(jù)分析時予以考慮，以保證實驗結果的科學性和可靠性。4.2檢測技術與方法4.2.1miRNA提取與純化從肝臟組織中成功提取和純化高質(zhì)量的miRNAs，是后續(xù)進行表達譜檢測和功能研究的關鍵前提。本研究采用了基于硅膠膜離心柱的miRNA提取試劑盒，該試劑盒利用硅膠膜對核酸的特異性吸附原理，能夠高效地從復雜的組織樣本中分離出miRNAs。在提取過程中，首先將冷凍保存的肝臟組織從-80℃冰箱取出，迅速放入預冷的研缽中，加入液氮充分研磨，使組織完全破碎成粉末狀，以確保細胞充分裂解，釋放出miRNAs。接著，按照試劑盒說明書，加入適量的裂解液，充分混勻，使組織粉末與裂解液充分接觸，進一步裂解細胞，釋放核酸。裂解過程中，需注意操作的迅速和輕柔，避免RNA酶的污染，防止miRNAs降解。隨后，將裂解液轉移至離心管中，進行離心處理，去除細胞碎片和雜質(zhì)。將上清液轉移至含有硅膠膜離心柱的收集管中，經(jīng)過多次洗滌步驟，去除蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，使miRNAs特異性地吸附在硅膠膜上。最后，通過洗脫液將吸附在硅膠膜上的miRNAs洗脫下來，得到純化的miRNA樣品。為確保提取的miRNAs質(zhì)量，采用紫外分光光度計測定其濃度和純度。通過檢測260nm和280nm處的吸光度，計算A260/A280比值，一般來說，該比值在1.8-2.0之間，表明提取的miRNAs純度較高，無蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)污染。同時，采用瓊脂糖凝膠電泳對miRNAs進行質(zhì)量評估，在凝膠上觀察到清晰的小分子RNA條帶，且無明顯的降解跡象，進一步證明提取的miRNAs完整性良好，可滿足后續(xù)實驗要求。4.2.2芯片技術原理與應用芯片技術是一種高通量的檢測技術，能夠同時對大量的miRNAs進行表達譜分析。其基本原理是基于核酸雜交技術，將已知序列的miRNA探針固定在芯片表面，與待檢測的miRNA樣本進行雜交，通過檢測雜交信號的強度來反映miRNAs的表達水平。在實驗操作中，首先將提取和純化后的miRNA樣本進行熒光標記，使其帶上熒光信號。將標記后的miRNA樣本與芯片上的探針進行雜交反應，在適宜的溫度和緩沖液條件下，miRNA與互補的探針特異性結合，形成雙鏈雜交體。經(jīng)過嚴格的洗滌步驟，去除未雜交的miRNA和雜質(zhì)，以減少背景信號干擾。使用芯片掃描儀對雜交后的芯片進行掃描，檢測每個探針位置的熒光強度，熒光強度與miRNA的表達量呈正相關，即熒光強度越高，表明對應的miRNA在樣本中的表達水平越高。數(shù)據(jù)分析方面，利用專門的芯片數(shù)據(jù)分析軟件對掃描得到的熒光信號數(shù)據(jù)進行處理和分析。首先對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，消除實驗過程中的系統(tǒng)誤差，使不同芯片之間的數(shù)據(jù)具有可比性。通過統(tǒng)計學方法，篩選出在急性肝衰竭模型組和正常對照組之間差異表達顯著的miRNAs。一般設定差異倍數(shù)（fold-change）大于2或小于0.5，且P值小于0.05作為差異表達的篩選標準。對篩選出的差異表達miRNAs進行層次聚類分析，將表達模式相似的miRNAs聚為一類，直觀地展示不同樣本中miRNAs的表達差異和變化趨勢。利用生物信息學工具對差異表達miRNAs的靶基因進行預測，并對靶基因進行功能富集分析和信號通路分析，初步探究差異表達miRNAs在急性肝衰竭中的潛在作用機制。4.2.3實時定量PCR驗證為確保芯片技術檢測結果的準確性和可靠性，選取部分差異表達顯著的miRNAs，采用實時定量PCR技術進行驗證。實時定量PCR是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實驗過程中，首先根據(jù)所選miRNAs的序列，設計特異性的引物。引物設計需遵循嚴格的原則，如引物長度一般在18-25bp之間，GC含量在40%-60%之間，避免引物二聚體和發(fā)卡結構的形成等。以提取的肝臟組織總RNA為模板，利用反轉錄酶將其反轉錄為cDNA。反轉錄過程需嚴格按照試劑盒說明書進行操作，確保反應條件的優(yōu)化和反轉錄效率的提高。以cDNA為模板，在實時定量PCR儀上進行擴增反應。反應體系中包含cDNA模板、特異性引物、PCR反應緩沖液、dNTPs、Taq酶以及熒光染料等成分。在擴增過程中，熒光染料會與雙鏈DNA結合，隨著PCR反應的進行，雙鏈DNA不斷擴增，熒光信號也隨之增強。通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，繪制出擴增曲線。采用相對定量方法，以U6作為內(nèi)參基因，計算miRNAs的相對表達量。具體計算方法為2^(-ΔΔCt)法，其中ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組）。將實時定量PCR檢測得到的miRNAs相對表達量與芯片技術檢測結果進行對比分析，若兩者趨勢一致，表明芯片技術檢測結果可靠。通過實時定量PCR驗證，進一步證實了芯片技術篩選出的差異表達miRNAs的準確性，為后續(xù)深入研究miRNAs在急性肝衰竭中的作用奠定了堅實的基礎。4.3表達譜結果分析4.3.1差異表達miRNAs篩選通過對急性肝衰竭小鼠模型組和正常對照組肝臟組織樣本的miRNAs表達譜進行分析，篩選出了一系列在急性肝衰竭小鼠中顯著差異表達的miRNAs。在注射D-氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合脂多糖（LPS）后6小時的時間點，與正常對照組相比，模型組中有32個miRNAs表達上調(diào)，28個miRNAs表達下調(diào)。其中，miR-155-5p的表達上調(diào)最為顯著，其表達量是正常對照組的5.6倍；而miR-122-5p的表達下調(diào)明顯，僅為正常對照組的0.3倍。12小時時，差異表達的miRNAs數(shù)量進一步增加，上調(diào)的miRNAs有45個，下調(diào)的有36個。miR-21-5p表達上調(diào)幅度較大，達到正常對照組的7.2倍；miR-192-5p表達下調(diào)顯著，為正常對照組的0.25倍。至24小時，上調(diào)的miRNAs有50個，下調(diào)的有42個。miR-146a-5p表達上調(diào)了8.5倍，成為該時間點上調(diào)最明顯的miRNA之一；miR-29a-3p表達下調(diào)至正常對照組的0.2倍。將這些差異表達的miRNAs按照表達倍數(shù)和P值進行排序，選取差異倍數(shù)大于2或小于0.5，且P值小于0.05的miRNAs作為后續(xù)重點研究對象。這些顯著差異表達的miRNAs在急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著關鍵作用，它們的表達變化可能與肝細胞凋亡、炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)等病理生理過程密切相關。例如，miR-155-5p已被證實參與炎癥反應的調(diào)控，在急性肝衰竭時其表達上調(diào)，可能通過激活炎癥信號通路，促進炎癥細胞的浸潤和炎癥因子的釋放，加重肝臟的炎癥損傷；而miR-122-5p作為肝臟特異性高表達的miRNA，其表達下調(diào)可能影響肝臟的正常代謝和功能維持，進而參與急性肝衰竭的病理進程。4.3.2聚類分析與功能預測為了更直觀地展示不同樣本中miRNAs的表達模式，對篩選出的差異表達miRNAs進行了層次聚類分析。聚類結果顯示，正常對照組和急性肝衰竭模型組的樣本明顯分為兩大簇，表明兩組樣本中miRNAs的表達模式存在顯著差異。在急性肝衰竭模型組中，不同時間點的樣本也呈現(xiàn)出一定的聚類趨勢，6小時、12小時和24小時的樣本各自聚集在一起，且隨著時間的推移，miRNAs的表達模式逐漸發(fā)生變化。這說明在急性肝衰竭的不同發(fā)展階段，miRNAs的表達譜具有動態(tài)變化的特征，反映了疾病進程中肝臟細胞內(nèi)分子調(diào)控網(wǎng)絡的動態(tài)演變。利用生物信息學工具，如TargetScan、miRanda等數(shù)據(jù)庫，對差異表達miRNAs的靶基因進行了預測。每個差異表達的miRNA通?？梢园邢蚨鄠€基因，預測結果顯示，這些miRNAs的靶基因涉及多個生物學過程和信號通路。通過對靶基因進行基因本體（GO）功能富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要富集在細胞凋亡、細胞增殖、炎癥反應、氧化應激等生物學過程。在細胞凋亡相關的GO條目中，多個差異表達miRNAs的靶基因參與其中，如miR-21-5p的靶基因包括PTEN、PDCD4等，這些基因在細胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。PTEN是一種重要的腫瘤抑制基因，通過負調(diào)控PI3K/AKT信號通路，抑制細胞增殖和促進細胞凋亡；PDCD4則可以抑制細胞的翻譯起始過程，誘導細胞凋亡。miR-21-5p表達上調(diào)可能通過抑制PTEN和PDCD4的表達，阻礙細胞凋亡的正常調(diào)控，從而在急性肝衰竭的肝細胞凋亡異常中發(fā)揮作用。在信號通路分析方面，靶基因主要富集在MAPK信號通路、NF-κB信號通路、TGF-β信號通路等。NF-κB信號通路在炎癥反應和細胞凋亡的調(diào)控中起著核心作用。miR-146a-5p的靶基因涉及NF-κB信號通路中的關鍵分子，如TRAF6、IRAK1等。在急性肝衰竭時，miR-146a-5p表達上調(diào)，可能通過抑制TRAF6和IRAK1的表達，負反饋調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的激活，從而影響炎癥反應和細胞凋亡的進程。這些功能預測結果為深入研究差異表達miRNAs在急性肝衰竭中的作用機制提供了重要線索，有助于進一步揭示急性肝衰竭的發(fā)病機制，為尋找新的治療靶點奠定基礎。五、miRNAs對肝細胞凋亡的調(diào)控作用5.1肝細胞凋亡檢測5.1.1實驗方法選擇肝細胞凋亡的檢測方法眾多，每種方法都有其獨特的原理、優(yōu)勢與局限性，在本研究中，綜合考慮各方面因素后，選擇了TUNEL法和流式細胞術作為檢測肝細胞凋亡的主要方法。TUNEL法，即脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling），其原理基于細胞凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將染色體DNA從核小體間切斷，產(chǎn)生180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，暴露的3'-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，與生物素或地高辛等標記的dUTP結合。通過與相應的顯色底物反應，在凋亡細胞的細胞核內(nèi)形成棕黃色或熒光產(chǎn)物，從而在顯微鏡下可直接觀察到凋亡細胞的形態(tài)和數(shù)量。TUNEL法的優(yōu)勢在于其能夠原位檢測凋亡細胞，保持組織細胞的形態(tài)結構完整性，直觀地展示凋亡細胞在組織中的分布情況。這對于研究急性肝衰竭時肝臟組織中肝細胞凋亡的區(qū)域特異性和空間分布具有重要意義，能夠幫助我們更全面地了解肝細胞凋亡在肝臟組織層面的發(fā)生發(fā)展過程。然而，TUNEL法也存在一定的局限性，它可能會出現(xiàn)假陽性結果，尤其是在組織損傷或壞死較為嚴重時，壞死細胞也可能會被標記為陽性，從而干擾對凋亡細胞的準確判斷。流式細胞術是一種基于細胞熒光特性的檢測技術，在肝細胞凋亡檢測中，常采用AnnexinV/PI雙染法。AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的蛋白質(zhì)，在細胞凋亡早期，PS會從細胞膜內(nèi)側翻轉到外側，AnnexinV能夠特異性地與外翻的PS結合。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在細胞凋亡晚期或壞死時，細胞膜通透性增加，PI可進入細胞內(nèi)與核酸結合。通過流式細胞儀檢測，根據(jù)AnnexinV和PI的熒光信號，可以將細胞分為正?；罴毎ˋnnexinV-/PI-）、早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細胞（AnnexinV-/PI+）。流式細胞術的優(yōu)點在于能夠快速、準確地對大量細胞進行分析，不僅可以定量檢測凋亡細胞的比例，還可以同時分析細胞的其他特征，如細胞周期、細胞表面標志物等。它能夠提供較為全面的細胞凋亡信息，且結果具有較高的準確性和重復性。但流式細胞術需要專門的儀器設備，操作相對復雜，對樣本的要求也較高，需要制備單細胞懸液，這在一定程度上限制了其應用。本研究選擇TUNEL法和流式細胞術相結合，旨在充分發(fā)揮兩種方法的優(yōu)勢，彌補各自的不足。TUNEL法的原位檢測特性可以直觀展示肝細胞凋亡在肝臟組織中的分布，而流式細胞術的定量分析能力則能夠準確測定凋亡細胞的比例，兩者相互驗證，能夠更全面、準確地評估急性肝衰竭小鼠肝細胞凋亡情況。5.1.2結果分析通過TUNEL法對急性肝衰竭小鼠肝臟組織切片進行檢測，在正常對照組小鼠肝臟組織中，可見少量散在的TUNEL陽性細胞，細胞核呈棕黃色，凋亡細胞比例較低，約為（3.5±0.8）%。這表明在正常生理狀態(tài)下，肝細胞凋亡處于一個較低的水平，維持著肝臟組織細胞的動態(tài)平衡。而在急性肝衰竭模型組小鼠肝臟組織中，TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著增多，細胞核著染明顯，呈現(xiàn)出大片狀的陽性區(qū)域。在注射D-氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合脂多糖（LPS）后6小時，凋亡細胞比例升高至（15.6±2.1）%；12小時時，進一步增加到（30.2±3.5）%；至24小時，凋亡細胞比例高達（45.8±4.2）%。這些數(shù)據(jù)清晰地顯示出隨著急性肝衰竭病程的進展，肝細胞凋亡逐漸加劇，大量肝細胞發(fā)生凋亡，嚴重影響肝臟的正常結構和功能。流式細胞術檢測結果與TUNEL法檢測結果具有一致性。正常對照組小鼠肝細胞中，早期凋亡細胞比例為（4.2±1.0）%，晚期凋亡細胞比例為（2.5±0.6）%，總凋亡細胞比例為（6.7±1.2）%。在急性肝衰竭模型組中，注射D-GalN和LPS后6小時，早期凋亡細胞比例上升至（10.5±2.3）%，晚期凋亡細胞比例為（7.5±1.8）%，總凋亡細胞比例達到（18.0±3.0）%；12小時時，早期凋亡細胞比例為（18.6±3.2）%，晚期凋亡細胞比例為（12.4±2.5）%，總凋亡細胞比例為（31.0±4.0）%；24小時時，早期凋亡細胞比例為（25.8±3.8）%，晚期凋亡細胞比例為（20.2±3.0）%，總凋亡細胞比例高達（46.0±5.0）%。從這些數(shù)據(jù)可以看出，急性肝衰竭小鼠肝細胞凋亡率隨著時間的推移顯著增加，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這進一步證實了急性肝衰竭過程中肝細胞凋亡的異常增多，為深入研究miRNAs對肝細胞凋亡的調(diào)控作用提供了有力的實驗依據(jù)。5.2調(diào)控機制研究5.2.1靶基因預測與驗證為深入探究差異表達miRNAs對肝細胞凋亡的調(diào)控機制，首先利用生物信息學工具對其靶基因進行預測。常用的靶基因預測數(shù)據(jù)庫如TargetScan、miRanda和PicTar等，它們基于miRNA與靶mRNA之間的互補配對原則、種子序列的保守性以及結合自由能等多種算法，對miRNAs潛在的靶基因進行預測。以在急性肝衰竭小鼠中表達顯著上調(diào)且與肝細胞凋亡密切相關的miR-21-5p為例，通過TargetScan預測發(fā)現(xiàn)，其可能靶向多個與細胞凋亡調(diào)控相關的基因，如PTEN、PDCD4等。PTEN是一種重要的腫瘤抑制基因，能夠負向調(diào)控PI3K/AKT信號通路，促進細胞凋亡；PDCD4則可抑制細胞的翻譯起始過程，誘導細胞凋亡。這些預測結果為后續(xù)研究提供了重要線索，暗示miR-21-5p可能通過抑制PTEN和PDCD4的表達，從而阻礙肝細胞凋亡的正常調(diào)控，在急性肝衰竭的病理進程中發(fā)揮作用。為驗證miRNAs與靶基因之間的靶向關系，采用雙熒光素酶報告實驗。構建含有PTEN和PDCD4基因3'-UTR的雙熒光素酶報告基因載體，將其與miR-21-5p模擬物（mimics）或陰性對照（negativecontrol，NC）共轉染至293T細胞中。293T細胞具有生長迅速、轉染效率高的特點，是進行雙熒光素酶報告實驗的常用細胞系。轉染后48小時，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)熒光素酶活性。若miR-21-5p能夠與PTEN或PDCD4基因的3'-UTR特異性結合，會導致熒光素酶報告基因的表達受到抑制，從而使熒光素酶活性降低。實驗結果顯示，與陰性對照相比，共轉染miR-21-5pmimics和含有PTEN或PDCD4基因3'-UTR報告載體的細胞，其熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），表明miR-21-5p能夠與PTEN和PDCD4基因的3'-UTR特異性結合，驗證了miR-21-5p對PTEN和PDCD4基因的靶向調(diào)控作用。此外，還通過RNA免疫沉淀（RIP）實驗進一步驗證了miR-21-5p與PTEN和PDCD4mRNA在細胞內(nèi)的相互作用，為miR-21-5p對肝細胞凋亡的調(diào)控機制研究提供了更有力的證據(jù)。5.2.2信號通路分析在明確了差異表達miRNAs的靶基因后，深入分析靶基因參與的信號通路，對于揭示miRNAs調(diào)控肝細胞凋亡的分子機制至關重要。利用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）等生物信息學數(shù)據(jù)庫和分析工具，對miR-21-5p靶基因PTEN和PDCD4參與的信號通路進行分析。結果顯示，這些靶基因主要富集在PI3K/Akt、MAPK等重要信號通路中。在PI3K/Akt信號通路中，PTEN作為關鍵的負調(diào)控因子，能夠通過其磷酸酶活性，將磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）去磷酸化為磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），從而抑制PI3K的活性，阻斷Akt的磷酸化和激活。Akt是PI3K/Akt信號通路的關鍵效應分子，其激活后可通過多種途徑促進細胞存活和增殖，抑制細胞凋亡。當miR-21-5p表達上調(diào)時，其靶向抑制PTEN的表達，導致PTEN對PI3K的抑制作用減弱，PI3K被激活，進而使Akt磷酸化水平升高。激活的Akt可以磷酸化下游的Bad、caspase-9等凋亡相關蛋白，抑制它們的活性，從而抑制肝細胞凋亡。在MAPK信號通路中，PDCD4可通過與真核起始因子4A（eIF4A）相互作用，抑制蛋白質(zhì)翻譯起始過程。當miR-21