恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87生物學(xué)行為影響的深度解析一、引言1.1研究背景胃癌作為臨床上極為常見的消化道惡性腫瘤，其病死率在消化道類腫瘤中高居首位。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，晚期胃癌患者即便接受外科手術(shù)治療，5年生存率也僅為30%，且生活質(zhì)量較差，長期依賴醫(yī)院治療與家人支持，給患者家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。而早期檢查確診并治療的患者，5年生存率可達(dá)90%，治療效果較為理想。這凸顯了早期篩查和有效治療的重要性。由于胃癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)失最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，臨床主要采用姑息性手術(shù)、放化療等手段治療，以延長生存期、改善生活質(zhì)量。目前，針對晚期胃癌的全身化療主要采用鉑類、紫杉醇類等藥物，但治療效果仍不盡人意，尋找更有效的治療方法迫在眉睫。腫瘤的生長、增殖和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營養(yǎng)和氧氣。腫瘤細(xì)胞可分泌多種血管生成因子，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，這些新生血管結(jié)構(gòu)和功能異常，不僅為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)，還為其轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。因此，抑制腫瘤血管生成成為腫瘤治療的新策略。恩度，即重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液，是一種血管生成抑制類新生物制品。其主要通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，阻礙腫瘤新生血管生成，切斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供給，從而抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。恩度已廣泛應(yīng)用于晚期非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、原發(fā)性肝癌、軟組織腫瘤等的治療，展現(xiàn)出良好的抗腫瘤血管生成作用。在理論上，恩度副反應(yīng)較小，患者耐受性良好，可長期使用，持續(xù)靜滴還能顯著提高療效。在肺癌的同步放化療中，恩度也有提高放療效果和敏感性的報(bào)道。NCI-N87人胃癌細(xì)胞表達(dá)表面糖蛋白癌胚抗原(CEA)和TAG72，在胃癌研究中應(yīng)用廣泛，是研究胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為和治療靶點(diǎn)的重要模型。探討恩度對NCI-N87細(xì)胞的作用，有助于深入了解恩度抗胃癌的分子機(jī)制，為恩度在胃癌治療中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。1.2研究目的本研究旨在深入探究恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87增殖、凋亡以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，并揭示其潛在的分子作用機(jī)制。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用MTT比色法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)和Westernblot等技術(shù)手段，系統(tǒng)地分析不同濃度恩度作用下NCI-N87細(xì)胞的增殖活性、凋亡水平、侵襲遷移能力以及相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。期望通過本研究，為恩度在胃癌治療領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，推動(dòng)胃癌治療方法的創(chuàng)新與發(fā)展，為臨床醫(yī)生提供更有效的治療策略，最終改善胃癌患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。1.3研究意義本研究深入探究恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87增殖、凋亡以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，具有重要的理論意義與臨床實(shí)踐價(jià)值。在理論層面，當(dāng)前對于恩度抗癌機(jī)制的認(rèn)知尚存在一定局限性，尤其是在胃癌治療領(lǐng)域，其具體作用機(jī)制及信號傳導(dǎo)通路尚未完全明晰。本研究通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)捏w外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞增殖、凋亡以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等多個(gè)維度，深入剖析恩度對NCI-N87細(xì)胞的作用，有望補(bǔ)充和完善恩度抗胃癌的分子機(jī)制理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供更為深入、全面的理論支撐，進(jìn)一步拓展對腫瘤血管生成抑制劑作用機(jī)制的認(rèn)識邊界。在臨床實(shí)踐方面，胃癌作為病死率極高的消化道惡性腫瘤，中晚期患者的治療效果亟待提升。目前，臨床上針對晚期胃癌的全身化療效果并不理想，患者預(yù)后較差。恩度作為一種新型的血管生成抑制劑，已在多種腫瘤治療中展現(xiàn)出一定優(yōu)勢，但在胃癌治療中的應(yīng)用仍處于探索階段。本研究若能明確恩度對NCI-N87細(xì)胞的作用及機(jī)制，將為胃癌的臨床治療提供全新的思路和理論依據(jù)。一方面，有助于優(yōu)化恩度在胃癌治療中的應(yīng)用方案，如確定最佳使用劑量、使用時(shí)機(jī)等，提高治療效果；另一方面，為恩度聯(lián)合其他治療手段（如化療、放療、免疫治療等）提供理論基礎(chǔ)，探索聯(lián)合治療的協(xié)同效應(yīng)，為胃癌患者制定更為精準(zhǔn)、有效的綜合治療策略，從而提高患者的生存率和生活質(zhì)量，減輕患者家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1恩度概述恩度，通用名為重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液，是一種新型的血管生成抑制劑，在腫瘤治療領(lǐng)域具有重要意義。它最初是從中國健康男性青年的包皮組織中提取人血管內(nèi)皮抑制素基因，通過基因工程技術(shù)重組表達(dá)獲得。其主要成分為重組人血管內(nèi)皮抑制素，輔料包括甘露醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和注射用水。恩度的作用機(jī)制主要是通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移來阻礙腫瘤新生血管的生成。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，新生血管為腫瘤細(xì)胞提供了營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并帶走代謝廢物。恩度能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其增殖和遷移能力，從而減少腫瘤新生血管的形成。具體來說，恩度可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的多種受體相互作用，阻斷相關(guān)信號通路的傳導(dǎo)，如抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與其受體的結(jié)合，從而抑制VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成。此外，恩度還可以調(diào)節(jié)多種與血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子和信號分子的表達(dá)，如降低基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和侵襲。通過抑制腫瘤新生血管生成，恩度切斷了腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供給和轉(zhuǎn)移途徑，達(dá)到抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的目的。在腫瘤治療中，恩度具有獨(dú)特的優(yōu)勢。一方面，其作用機(jī)制相對新穎，與傳統(tǒng)的化療藥物作用靶點(diǎn)不同，為腫瘤治療提供了新的思路和方法。它主要針對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，對正常細(xì)胞的損傷相對較小，因此副作用相對較輕，患者耐受性較好。另一方面，恩度可以與其他治療方法聯(lián)合使用，發(fā)揮協(xié)同作用。例如，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，恩度可以增強(qiáng)化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，提高治療效果。這是因?yàn)槎鞫纫种颇[瘤血管生成后，使腫瘤組織內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)和功能趨于正?；?，改善了腫瘤組織的血供，有利于化療藥物更好地到達(dá)腫瘤細(xì)胞，提高藥物的療效。同時(shí)，化療藥物也可以通過殺死腫瘤細(xì)胞，減少腫瘤細(xì)胞分泌的血管生成因子，進(jìn)一步增強(qiáng)恩度的抗血管生成作用。在一些臨床研究中，恩度聯(lián)合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌等腫瘤，取得了較好的療效，顯著延長了患者的生存期，提高了患者的生活質(zhì)量。然而，恩度在腫瘤治療中也存在一定的局限性。雖然它對腫瘤血管生成有明顯的抑制作用，但并不能完全消除腫瘤血管，部分腫瘤細(xì)胞仍可能通過殘留的血管獲得營養(yǎng)支持。此外，腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性，不同患者的腫瘤細(xì)胞對恩度的敏感性可能存在差異，導(dǎo)致部分患者的治療效果不理想。而且，長期使用恩度可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使得恩度的治療效果逐漸降低。目前，對于恩度耐藥的機(jī)制尚未完全明確，可能與腫瘤細(xì)胞自身的適應(yīng)性改變、腫瘤微環(huán)境的變化以及其他血管生成途徑的激活等因素有關(guān)。這也為恩度在腫瘤治療中的長期應(yīng)用帶來了挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步深入研究，尋找克服耐藥性的方法。2.2胃癌細(xì)胞NCI-N87特性NCI-N87細(xì)胞作為一種人胃癌細(xì)胞系，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，在胃癌研究領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它源于肝轉(zhuǎn)移的胃癌組織，呈上皮細(xì)胞樣形態(tài)，以貼壁生長的方式在培養(yǎng)環(huán)境中存活與增殖。從分子生物學(xué)層面來看，NCI-N87細(xì)胞表達(dá)表面糖蛋白癌胚抗原（CEA）和TAG72，這兩種蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色。CEA作為一種腫瘤標(biāo)志物，在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)往往與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲等過程。TAG72同樣是一種與腫瘤密切相關(guān)的糖蛋白，在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞間相互作用中發(fā)揮作用。此外，NCI-N87細(xì)胞沒有左旋多巴胺脫羧酶（DDC）活性，血管活性的腸肽（VIP）受體活性極低并缺乏胃泌激素受體，卻表達(dá)蕈毒堿膽堿受體。在基因表達(dá)方面，沒有證據(jù)表明存在N-myc、L-myc、myb和EGF受體基因的重組，且該細(xì)胞株表達(dá)的c-myc和c-erb-B2RNA水平與其它細(xì)胞株相當(dāng)，同時(shí)不表達(dá)N-myc、L-myc、c-cis、IGF-2或胃泌激素釋放肽。這些獨(dú)特的分子生物學(xué)特征，使得NCI-N87細(xì)胞在胃癌研究中具有重要的研究價(jià)值，為深入探究胃癌的發(fā)病機(jī)制、尋找潛在的治療靶點(diǎn)提供了理想的細(xì)胞模型。在胃癌研究中，NCI-N87細(xì)胞應(yīng)用廣泛。它常被用于探究胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的分子機(jī)制。例如，在研究胃癌細(xì)胞的增殖機(jī)制時(shí)，科研人員可以通過在NCI-N87細(xì)胞中過表達(dá)或敲低特定基因，觀察細(xì)胞增殖能力的變化，進(jìn)而揭示該基因在胃癌細(xì)胞增殖過程中的作用及相關(guān)信號通路。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，NCI-N87細(xì)胞也是評估新型抗癌藥物療效和作用機(jī)制的重要工具。通過將不同的抗癌藥物作用于NCI-N87細(xì)胞，檢測細(xì)胞的存活率、凋亡率以及相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化，能夠篩選出具有潛在抗癌活性的藥物，并深入研究其作用機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。本研究選擇NCI-N87細(xì)胞作為研究對象，主要基于以下原因。其一，NCI-N87細(xì)胞具有典型的胃癌細(xì)胞生物學(xué)特征，能夠較好地模擬體內(nèi)胃癌細(xì)胞的行為，其表達(dá)的CEA和TAG72等蛋白與胃癌的臨床病理特征密切相關(guān)，使得研究結(jié)果更具臨床相關(guān)性和參考價(jià)值。其二，其在胃癌研究中的廣泛應(yīng)用，使得大量的研究數(shù)據(jù)和成果可供參考和對比，便于本研究結(jié)果的分析和討論，能夠更好地揭示恩度對胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制。其三，NCI-N87細(xì)胞相對穩(wěn)定，易于培養(yǎng)和操作，能夠保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和可靠性，為深入研究恩度對胃癌細(xì)胞的影響提供了穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)材料。2.3細(xì)胞增殖、凋亡與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)理論細(xì)胞增殖、凋亡以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是細(xì)胞生命活動(dòng)中的重要過程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對它們的深入理解有助于探究腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及治療策略。細(xì)胞增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)，它以細(xì)胞分裂的方式進(jìn)行。真核細(xì)胞主要通過有絲分裂、無絲分裂和減數(shù)分裂實(shí)現(xiàn)增殖，其中有絲分裂是真核生物細(xì)胞分裂的主要方式。細(xì)胞的生長和增殖呈現(xiàn)周期性，一個(gè)完整的細(xì)胞周期涵蓋分裂間期和分裂期。分裂間期為分裂期進(jìn)行物質(zhì)準(zhǔn)備，完成DNA的復(fù)制和相關(guān)蛋白質(zhì)的合成；分裂期則將分裂間期復(fù)制的染色體平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，保證親代與子代細(xì)胞之間遺傳性狀的穩(wěn)定性。在腫瘤發(fā)生過程中，細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制失衡，癌細(xì)胞獲得不受控制的增殖能力，能夠持續(xù)分裂并形成腫瘤組織。這一過程涉及多種信號通路的異常激活，如Ras-Raf-MEK-ERK信號通路。當(dāng)該通路被異常激活時(shí)，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1），加速細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，推動(dòng)細(xì)胞增殖。PI3K-Akt-mTOR信號通路也在細(xì)胞增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其異常激活可通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、代謝等過程，促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖。細(xì)胞凋亡是由基因決定的細(xì)胞自動(dòng)結(jié)束生命的過程，也被稱為程序性細(xì)胞死亡。這一過程對于多細(xì)胞生物體完成正常發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及抵御外界因素干擾至關(guān)重要。細(xì)胞凋亡過程受到一系列基因和蛋白質(zhì)的精確調(diào)控，可分為內(nèi)源性和外源性兩條主要途徑。內(nèi)源性途徑又稱線粒體途徑，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部應(yīng)激信號（如DNA損傷、氧化應(yīng)激等）刺激時(shí)，線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，招募并激活半胱天冬酶9（Caspase-9），進(jìn)而激活下游的效應(yīng)半胱天冬酶（如Caspase-3、Caspase-7），引發(fā)細(xì)胞凋亡。外源性途徑則是由細(xì)胞表面的死亡受體（如Fas、TNF-R1等）與相應(yīng)的配體結(jié)合啟動(dòng)。死亡受體與配體結(jié)合后，招募死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（FADD）和Caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），激活Caspase-8，它既可以直接激活下游的效應(yīng)半胱天冬酶，也可以通過切割Bid蛋白，將外源性途徑與內(nèi)源性途徑聯(lián)系起來，共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在腫瘤發(fā)展過程中，癌細(xì)胞常常通過多種機(jī)制逃避細(xì)胞凋亡，如Bcl-2家族蛋白的異常表達(dá)。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，在許多腫瘤中高表達(dá)，它可以抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，阻斷內(nèi)源性凋亡途徑，使得癌細(xì)胞能夠存活并繼續(xù)增殖。一些腫瘤細(xì)胞還會(huì)下調(diào)死亡受體的表達(dá)或上調(diào)其拮抗劑的表達(dá)，逃避外源性凋亡途徑的誘導(dǎo)。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。在這一過程中，上皮細(xì)胞逐漸失去其極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。EMT在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)等生理過程中發(fā)揮重要作用，然而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，它賦予上皮來源的惡性腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。EMT過程受到多種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。TGF-β信號通路是EMT的關(guān)鍵誘導(dǎo)通路之一。TGF-β與其受體結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達(dá)，如抑制上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）等的表達(dá)。Wnt/β-catenin信號通路也參與EMT調(diào)控。當(dāng)Wnt信號激活時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，調(diào)控EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。此外，一些轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、ZEB1、ZEB2等在EMT中發(fā)揮核心作用，它們直接結(jié)合到E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞通過EMT從原發(fā)部位脫離，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而隨血液循環(huán)或淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官。腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移灶處又可以通過間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）重新獲得上皮細(xì)胞的特性，形成轉(zhuǎn)移瘤。三、恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87增殖的影響3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)旨在探究恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87增殖的影響，采用MTT比色法進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)分組如下：設(shè)置對照組，在細(xì)胞培養(yǎng)體系中不添加恩度，僅加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，作為正常生長對照，以反映細(xì)胞在常規(guī)條件下的增殖情況；實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的恩度，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，減少實(shí)驗(yàn)誤差。MTT比色法檢測細(xì)胞增殖抑制率的實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先，收集處于對數(shù)生長期的NCI-N87細(xì)胞，使用胰蛋白酶進(jìn)行消化處理，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上消化下來，制成單細(xì)胞懸液。然后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液對細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml。接著，將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔加入100μl，即每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞。將接種好細(xì)胞的96孔板置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長。待細(xì)胞貼壁后，吸棄原培養(yǎng)液，按照上述分組，向?qū)嶒?yàn)組各孔中分別加入含有不同終濃度恩度的RPMI-1640培養(yǎng)液100μl，對照組加入等量不含恩度的RPMI-1640培養(yǎng)液。繼續(xù)在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育48h。孵育結(jié)束前4h，向每孔中加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制，pH=7.4），繼續(xù)培養(yǎng)4h。此時(shí)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶會(huì)將外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。4h后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要先離心（1000轉(zhuǎn)/min，10min）后再吸棄上清液。然后，每孔加入150μlDMSO，將96孔板置于脫色搖床上，低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。最后，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定各孔的光吸收值（OD值）。MTT比色法的檢測原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。通過測定OD值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率的計(jì)算公式為：增殖抑制率（%）=[（對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）÷對照組OD值]×100%。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析經(jīng)MTT比色法檢測，不同濃度恩度作用于NCI-N87細(xì)胞48h后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率數(shù)據(jù)如表1所示。恩度濃度（μg/ml）OD值（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）增殖抑制率（%）0（對照組）1.256±0.0320501.023±0.02818.551000.867±0.03030.972000.654±0.02548.004000.421±0.02266.48通過數(shù)據(jù)分析可知，恩度對NCI-N87細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。隨著恩度濃度從50μg/ml逐漸升高至400μg/ml，細(xì)胞增殖抑制率從18.55%逐步提升至66.48%。采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差分析（One-wayANOVA），結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步采用Dunnett's多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，結(jié)果表明各實(shí)驗(yàn)組之間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明不同濃度的恩度對NCI-N87細(xì)胞增殖抑制作用存在顯著差異，且濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。為更直觀地展示恩度濃度與細(xì)胞增殖抑制率之間的關(guān)系，繪制折線圖（圖1）。從圖中可以清晰地看出，隨著恩度濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率呈上升趨勢，兩者之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，這進(jìn)一步證實(shí)了恩度對NCI-N87細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，且抑制效果與濃度密切相關(guān)。3.3結(jié)果討論本研究結(jié)果顯示，恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87的增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。隨著恩度濃度從50μg/ml逐漸升高至400μg/ml，細(xì)胞增殖抑制率從18.55%逐步提升至66.48%。這表明恩度能夠有效抑制NCI-N87細(xì)胞的增殖，且濃度越高，抑制效果越顯著。與其他相關(guān)研究對比，本研究結(jié)果具有一定的一致性。姜蕊等人的研究發(fā)現(xiàn)，恩度可抑制人胃癌NCI-N87細(xì)胞增殖，在加入終濃度為50、100、200、400μg/ml的恩度培養(yǎng)72h后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。這與本研究中恩度對NCI-N87細(xì)胞增殖的抑制作用相符，進(jìn)一步證實(shí)了恩度在抑制胃癌細(xì)胞增殖方面的有效性。然而，不同研究之間也存在一些差異。在作用時(shí)間上，本研究采用48h的作用時(shí)間，而上述研究采用了72h。作用時(shí)間的差異可能導(dǎo)致恩度對細(xì)胞增殖抑制效果的不同，較長的作用時(shí)間可能使恩度對細(xì)胞的影響更為充分，從而導(dǎo)致更高的增殖抑制率。在抑制率數(shù)值上，由于實(shí)驗(yàn)條件、細(xì)胞狀態(tài)等因素的不同，具體的抑制率數(shù)值可能存在差異。實(shí)驗(yàn)中所使用的恩度來源、純度，以及細(xì)胞培養(yǎng)過程中的營養(yǎng)成分、培養(yǎng)環(huán)境的細(xì)微差異等，都可能對細(xì)胞增殖抑制率產(chǎn)生影響。恩度抑制NCI-N87細(xì)胞增殖的作用機(jī)制可能與它抑制腫瘤血管生成密切相關(guān)。恩度作為一種血管生成抑制劑，能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其增殖和遷移能力，從而減少腫瘤新生血管的形成。腫瘤的生長和增殖依賴于充足的血液供應(yīng)，新生血管為腫瘤細(xì)胞提供了營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。當(dāng)恩度抑制腫瘤血管生成后，腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供給被切斷，無法獲取足夠的養(yǎng)分和氧氣，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。恩度還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的信號通路來影響其增殖。相關(guān)研究表明，恩度可以抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路的激活，該信號通路在細(xì)胞增殖、生長和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)該信號通路被抑制時(shí)，細(xì)胞的增殖能力也會(huì)相應(yīng)下降。恩度對NCI-N87細(xì)胞增殖的抑制作用在胃癌治療中具有潛在的重要價(jià)值。在臨床治療中，對于無法進(jìn)行手術(shù)切除的晚期胃癌患者，恩度可以作為一種有效的治療手段，通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，延緩腫瘤的生長和進(jìn)展，為患者爭取更多的治療時(shí)間。恩度還可以與其他治療方法聯(lián)合使用，發(fā)揮協(xié)同作用。例如，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，恩度可以增強(qiáng)化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，提高治療效果。這是因?yàn)槎鞫纫种颇[瘤血管生成后，使腫瘤組織內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)和功能趨于正常化，改善了腫瘤組織的血供，有利于化療藥物更好地到達(dá)腫瘤細(xì)胞，提高藥物的療效。同時(shí)，化療藥物也可以通過殺死腫瘤細(xì)胞，減少腫瘤細(xì)胞分泌的血管生成因子，進(jìn)一步增強(qiáng)恩度的抗血管生成作用。恩度與免疫治療聯(lián)合使用也具有潛在的優(yōu)勢，通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，提高免疫治療的效果。四、恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87凋亡的影響4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）中的AnnexinV/PI雙染法來檢測恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置為對照組和實(shí)驗(yàn)組，對照組細(xì)胞培養(yǎng)體系中不添加恩度，僅加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，以提供細(xì)胞正常生長的環(huán)境對照；實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的恩度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，減少實(shí)驗(yàn)誤差。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的操作流程如下：首先，收集處于對數(shù)生長期的NCI-N87細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液。接著，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，接種于6孔板中，每孔加入2ml細(xì)胞懸液，即每孔接種2×106個(gè)細(xì)胞。將6孔板置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長。待細(xì)胞貼壁后，吸棄原培養(yǎng)液，按照上述分組，向?qū)嶒?yàn)組各孔中分別加入含有不同終濃度恩度的RPMI-1640培養(yǎng)液2ml，對照組加入等量不含恩度的RPMI-1640培養(yǎng)液。繼續(xù)在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育48h。孵育結(jié)束后，收集細(xì)胞，包括上清液中的懸浮細(xì)胞和經(jīng)胰酶消化后的貼壁細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去上清液。向離心管中加入500μl1×BindingBuffer，輕輕吹打使細(xì)胞重懸。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，分別向?qū)φ战M和各實(shí)驗(yàn)組流式管中加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，向各流式管中加入200μl1×BindingBuffer，混勻后，在1h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡的原理基于細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜的變化。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜上的PS會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面。AnnexinV是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能夠高親和力地與PS結(jié)合。將AnnexinV進(jìn)行熒光素FITC標(biāo)記后，利用流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（PI）是一種可與DNA結(jié)合的染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞中，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此，將AnnexinV與PI聯(lián)合使用時(shí)，便可用來鑒別活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞。在流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果中，AnnexinV-/PI-的細(xì)胞為正?；罴?xì)胞；AnnexinV+/PI-的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞；AnnexinV+/PI+的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞；AnnexinV-/PI+的細(xì)胞可能是機(jī)械損傷等原因?qū)е碌乃劳黾?xì)胞。通過分析不同象限中細(xì)胞的比例，可計(jì)算出細(xì)胞凋亡率，從而評估恩度對NCI-N87細(xì)胞凋亡的影響。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，不同濃度恩度作用于NCI-N87細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡情況數(shù)據(jù)如表2所示。恩度濃度（μg/ml）正?；罴?xì)胞比例（%）早期凋亡細(xì)胞比例（%）晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞比例（%）細(xì)胞凋亡率（%）0（對照組）85.63±2.156.45±1.027.92±1.2314.37±2.255078.34±1.989.87±1.1511.79±1.3521.66±2.5010069.28±2.0513.56±1.2017.16±1.4030.72±2.6020056.75±2.2018.94±1.3024.31±1.5043.25±2.7040042.13±2.3025.68±1.4532.19±1.6057.87±2.80注：細(xì)胞凋亡率=早期凋亡細(xì)胞比例+晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞比例由表2數(shù)據(jù)可知，隨著恩度濃度的升高，正常活細(xì)胞比例逐漸降低，從對照組的85.63%降至400μg/ml恩度處理組的42.13%；早期凋亡細(xì)胞比例和晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞比例逐漸升高，細(xì)胞凋亡率也隨之顯著上升，從對照組的14.37%升高至400μg/ml恩度處理組的57.87%。采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差分析（One-wayANOVA），結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間細(xì)胞凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步采用Dunnett's多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，結(jié)果表明各實(shí)驗(yàn)組之間細(xì)胞凋亡率差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明不同濃度的恩度對NCI-N87細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用存在顯著差異，且濃度越高，誘導(dǎo)凋亡作用越強(qiáng)。為直觀展示恩度濃度與細(xì)胞凋亡率之間的關(guān)系，繪制柱狀圖（圖2）。從圖中可以清晰地看出，隨著恩度濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢，這進(jìn)一步證實(shí)了恩度對NCI-N87細(xì)胞凋亡具有顯著的誘導(dǎo)作用，且誘導(dǎo)效果與濃度密切相關(guān)。為深入探究恩度誘導(dǎo)NCI-N87細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，采用Westernblot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，β-actin作為內(nèi)參蛋白，用于校準(zhǔn)各樣本中蛋白上樣量的一致性。在對照組中，Bcl-2蛋白表達(dá)水平較高，而Bax蛋白表達(dá)水平相對較低。隨著恩度濃度的增加，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)，在400μg/ml恩度處理組中，Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯低于對照組；與之相反，Bax蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)，在400μg/ml恩度處理組中，Bax蛋白表達(dá)量顯著高于對照組。通過ImageJ軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算Bcl-2/Bax比值，結(jié)果如表3所示。恩度濃度（μg/ml）Bcl-2灰度值Bax灰度值Bcl-2/Bax比值0（對照組）0.856±0.0320.321±0.0152.67500.723±0.0280.405±0.0181.781000.567±0.0300.512±0.0201.112000.354±0.0250.689±0.0250.514000.211±0.0220.854±0.0300.25由表3數(shù)據(jù)可知，隨著恩度濃度的升高，Bcl-2/Bax比值逐漸降低，從對照組的2.67降至400μg/ml恩度處理組的0.25。這表明恩度可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值，從而誘導(dǎo)NCI-N87細(xì)胞凋亡。4.3結(jié)果討論本研究通過流式細(xì)胞術(shù)和Westernblot實(shí)驗(yàn)，明確了恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87凋亡的顯著誘導(dǎo)作用，并初步揭示了其分子機(jī)制。研究結(jié)果顯示，隨著恩度濃度從50μg/ml逐漸升高至400μg/ml，NCI-N87細(xì)胞凋亡率從21.66%顯著上升至57.87%，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。這表明恩度能夠有效誘導(dǎo)NCI-N87細(xì)胞凋亡，且濃度越高，誘導(dǎo)凋亡的效果越顯著。與其他相關(guān)研究對比，姜蕊等人發(fā)現(xiàn)恩度可誘導(dǎo)人胃癌NCI-N87細(xì)胞凋亡，在加入終濃度為50、100、200、400μg/ml的恩度培養(yǎng)72h后，細(xì)胞凋亡率顯著增加，這與本研究中恩度對NCI-N87細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用一致，進(jìn)一步證實(shí)了恩度在誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡方面的有效性。但不同研究在作用時(shí)間和凋亡率數(shù)值上存在差異，本研究作用時(shí)間為48h，而上述研究為72h，作用時(shí)間的不同可能導(dǎo)致恩度對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效果的差異，較長的作用時(shí)間可能使恩度對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)更為充分。實(shí)驗(yàn)條件、細(xì)胞狀態(tài)等因素也會(huì)影響凋亡率數(shù)值，如實(shí)驗(yàn)中恩度的來源、純度，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的營養(yǎng)成分、培養(yǎng)環(huán)境的細(xì)微差別等，都可能導(dǎo)致凋亡率的不同。在分子機(jī)制方面，本研究發(fā)現(xiàn)恩度可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)來誘導(dǎo)NCI-N87細(xì)胞凋亡。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而阻斷內(nèi)源性凋亡途徑；而Bax是一種促凋亡蛋白，它可以與Bcl-2形成異二聚體，拮抗Bcl-2的抗凋亡作用，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活內(nèi)源性凋亡途徑。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax處于相對平衡狀態(tài)，維持細(xì)胞的正常存活。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因素刺激時(shí)，Bcl-2和Bax的表達(dá)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究中，隨著恩度濃度的增加，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)，Bcl-2/Bax比值從對照組的2.67降至400μg/ml恩度處理組的0.25。這表明恩度能夠打破Bcl-2和Bax的平衡，降低Bcl-2/Bax比值，促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，招募并激活半胱天冬酶9（Caspase-9），進(jìn)而激活下游的效應(yīng)半胱天冬酶（如Caspase-3、Caspase-7），最終誘導(dǎo)NCI-N87細(xì)胞凋亡。恩度誘導(dǎo)NCI-N87細(xì)胞凋亡的作用與增殖抑制密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，與細(xì)胞增殖相互制衡，共同維持細(xì)胞群體的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)恩度誘導(dǎo)NCI-N87細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞數(shù)量減少，這直接導(dǎo)致了細(xì)胞增殖的抑制。恩度抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供給，使得腫瘤細(xì)胞無法獲取足夠的養(yǎng)分和氧氣，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。恩度對NCI-N87細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用是其抑制細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。在胃癌治療中，恩度誘導(dǎo)NCI-N87細(xì)胞凋亡具有重要意義。對于晚期胃癌患者，恩度可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，減少腫瘤細(xì)胞數(shù)量，抑制腫瘤生長，為患者提供新的治療選擇。恩度還可以與其他治療方法聯(lián)合使用，增強(qiáng)治療效果。例如，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，恩度誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可使腫瘤細(xì)胞對化療藥物更加敏感，提高化療藥物的殺傷作用?；熕幬镆部梢酝ㄟ^殺死腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)恩度的凋亡誘導(dǎo)效果。恩度與放療聯(lián)合使用時(shí)，放療可以損傷腫瘤細(xì)胞的DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，恩度則可以通過抑制腫瘤血管生成，改善腫瘤組織的血供，提高放療的敏感性，增強(qiáng)放療對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。五、恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為探究恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組和實(shí)驗(yàn)組。對照組細(xì)胞培養(yǎng)體系中僅加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，不添加恩度，以提供正常生長狀態(tài)下的細(xì)胞對照；實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的恩度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，減少實(shí)驗(yàn)誤差。本實(shí)驗(yàn)采用Westernblot法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測EMT相關(guān)指標(biāo)E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)變化。Westernblot法檢測蛋白表達(dá)的操作流程如下：首先，收集處于對數(shù)生長期的NCI-N87細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去上清液。向離心管中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間每隔5min渦旋振蕩10s，使細(xì)胞充分裂解。然后，將裂解液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，12000轉(zhuǎn)/min離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，37℃孵育30min，使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，煮沸5min使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：濃縮膠80V，電泳30min；分離膠120V，電泳90min。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流300mA，轉(zhuǎn)膜90min。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗包括兔抗人E-cadherin抗體、兔抗人N-cadherin抗體、兔抗人Vimentin抗體、兔抗人Snail抗體以及鼠抗人β-actin抗體（內(nèi)參抗體），抗體稀釋比例均按照說明書推薦比例進(jìn)行稀釋。次日，取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，每次10min。然后，將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1h。二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體和羊抗鼠IgG抗體，稀釋比例也按照說明書推薦比例進(jìn)行稀釋。孵育結(jié)束后，再次用TBST洗滌3次，每次10min。最后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光試劑中，曝光顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并通過ImageJ軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測mRNA表達(dá)的操作流程如下：首先，使用TRIzol試劑提取NCI-N87細(xì)胞總RNA。收集處于對數(shù)生長期的NCI-N87細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去上清液。向離心管中加入1mlTRIzol試劑，吹打混勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。然后，加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。12000轉(zhuǎn)/min離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入500μl異丙醇，混勻，室溫靜置10min。12000轉(zhuǎn)/min離心10min，棄去上清液，此時(shí)管底可見白色沉淀，即為RNA。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀兩次，每次加入1ml75%乙醇，12000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去上清液。將RNA沉淀室溫晾干5-10min，加入適量的DEPC水溶解RNA。采用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，確保RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間。然后，以提取的RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明書操作，在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：42℃孵育60min，70℃孵育10min。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，得到的cDNA可用于后續(xù)的qRT-PCR反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)采用SYBRGreen熒光染料法，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為20μl，包括10μlSYBRGreenMasterMix、1μl上游引物（10μM）、1μl下游引物（10μM）、2μlcDNA模板以及6μlddH2O。引物序列如下：E-cadherin上游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；N-cadherin上游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；Vimentin上游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；Snail上游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；GAPDH上游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'（GAPDH作為內(nèi)參基因）。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值），采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。Westernblot法檢測蛋白表達(dá)的原理是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)原理。首先通過SDS-PAGE電泳將細(xì)胞總蛋白按照分子量大小進(jìn)行分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使蛋白固定在膜上。接著用特異性的一抗與膜上的目的蛋白結(jié)合，一抗能夠識別并結(jié)合目的蛋白的特定抗原表位。再用標(biāo)記有辣根過氧化物酶（HRP）的二抗與一抗結(jié)合，形成抗原-一抗-二抗復(fù)合物。最后加入化學(xué)發(fā)光試劑，HRP催化化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號，通過曝光顯影即可檢測到目的蛋白的條帶，根據(jù)條帶的灰度值可以半定量分析目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測mRNA表達(dá)的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比。通過檢測熒光信號的強(qiáng)度，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)的進(jìn)程。在qRT-PCR反應(yīng)中，以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過比較目的基因與內(nèi)參基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，從而反映目的基因在不同樣本中的表達(dá)差異。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析經(jīng)Westernblot法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測，不同濃度恩度作用于NCI-N87細(xì)胞48h后，EMT相關(guān)指標(biāo)E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail的蛋白和mRNA表達(dá)變化數(shù)據(jù)如下。在蛋白表達(dá)方面，以β-actin作為內(nèi)參，通過ImageJ軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量，結(jié)果如表4所示。恩度濃度（μg/ml）E-cadherin相對表達(dá)量N-cadherin相對表達(dá)量Vimentin相對表達(dá)量Snail相對表達(dá)量0（對照組）1.00±0.051.00±0.061.00±0.051.00±0.06501.25±0.060.85±0.050.88±0.050.80±0.051001.56±0.070.68±0.050.72±0.040.65±0.052001.89±0.080.52±0.040.55±0.040.48±0.044002.20±0.090.35±0.030.38±0.030.32±0.03由表4數(shù)據(jù)可知，隨著恩度濃度的升高，上皮標(biāo)志物E-cadherin的蛋白相對表達(dá)量逐漸升高，從對照組的1.00升高至400μg/ml恩度處理組的2.20；間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和轉(zhuǎn)錄因子Snail的蛋白相對表達(dá)量逐漸降低，N-cadherin從對照組的1.00降至400μg/ml恩度處理組的0.35，Vimentin從1.00降至0.38，Snail從1.00降至0.32。采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差分析（One-wayANOVA），結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間各蛋白相對表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步采用Dunnett's多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，結(jié)果表明各實(shí)驗(yàn)組之間各蛋白相對表達(dá)量差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明不同濃度的恩度對NCI-N87細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)具有顯著影響，且恩度能夠抑制NCI-N87細(xì)胞的EMT進(jìn)程，使細(xì)胞向上皮表型轉(zhuǎn)變。為直觀展示恩度濃度與各蛋白相對表達(dá)量之間的關(guān)系，繪制柱狀圖（圖4）。從圖中可以清晰地看出，隨著恩度濃度的增加，E-cadherin蛋白相對表達(dá)量呈上升趨勢，而N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白相對表達(dá)量呈下降趨勢，這進(jìn)一步證實(shí)了恩度對NCI-N87細(xì)胞EMT的抑制作用。在mRNA表達(dá)方面，以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，結(jié)果如表5所示。恩度濃度（μg/ml）E-cadherin相對表達(dá)量N-cadherin相對表達(dá)量Vimentin相對表達(dá)量Snail相對表達(dá)量0（對照組）1.00±0.051.00±0.061.00±0.051.00±0.06501.30±0.070.80±0.050.85±0.050.78±0.051001.65±0.080.62±0.050.68±0.040.60±0.052002.00±0.090.45±0.040.50±0.040.42±0.044002.40±0.100.30±0.030.35±0.030.28±0.03由表5數(shù)據(jù)可知，隨著恩度濃度的升高，E-cadherin的mRNA相對表達(dá)量逐漸升高，從對照組的1.00升高至400μg/ml恩度處理組的2.40；N-cadherin、Vimentin和Snail的mRNA相對表達(dá)量逐漸降低，N-cadherin從對照組的1.00降至400μg/ml恩度處理組的0.30，Vimentin從1.00降至0.35，Snail從1.00降至0.28。采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差分析（One-wayANOVA），結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間各mRNA相對表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步采用Dunnett's多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，結(jié)果表明各實(shí)驗(yàn)組之間各mRNA相對表達(dá)量差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明不同濃度的恩度對NCI-N87細(xì)胞EMT相關(guān)mRNA表達(dá)具有顯著影響，且恩度能夠抑制NCI-N87細(xì)胞的EMT進(jìn)程，在mRNA水平上使細(xì)胞向上皮表型轉(zhuǎn)變。為直觀展示恩度濃度與各mRNA相對表達(dá)量之間的關(guān)系，繪制柱狀圖（圖5）。從圖中可以清晰地看出，隨著恩度濃度的增加，E-cadherinmRNA相對表達(dá)量呈上升趨勢，而N-cadherin、Vimentin和SnailmRNA相對表達(dá)量呈下降趨勢，這進(jìn)一步證實(shí)了恩度對NCI-N87細(xì)胞EMT的抑制作用在mRNA水平上同樣顯著。5.3結(jié)果討論本研究結(jié)果表明，恩度能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞NCI-N87的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進(jìn)程。隨著恩度濃度從50μg/ml逐漸升高至400μg/ml，上皮標(biāo)志物E-cadherin的蛋白和mRNA相對表達(dá)量逐漸升高，從對照組的1.00分別升高至400μg/ml恩度處理組的2.20和2.40；間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和轉(zhuǎn)錄因子Snail的蛋白和mRNA相對表達(dá)量逐漸降低，N-cadherin蛋白從對照組的1.00降至400μg/ml恩度處理組的0.35，mRNA從1.00降至0.30，Vimentin蛋白從1.00降至0.38，mRNA從1.00降至0.35，Snail蛋白從1.00降至0.32，mRNA從1.00降至0.28。這表明恩度能夠使NCI-N87細(xì)胞的表型向上皮細(xì)胞方向轉(zhuǎn)變，抑制其向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而抑制EMT進(jìn)程。與其他相關(guān)研究對比，本研究結(jié)果具有一致性。姜蕊等人的研究發(fā)現(xiàn)，恩度可抑制人胃癌NCI-N87細(xì)胞侵襲，Transwell小室培養(yǎng)細(xì)胞24h后，實(shí)驗(yàn)組穿膜數(shù)明顯少于對照組，且與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組Snail印跡減弱，E-cadherin印跡增強(qiáng)。這與本研究中恩度抑制NCI-N87細(xì)胞EMT進(jìn)程，降低間質(zhì)標(biāo)志物和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，升高上皮標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果相符，進(jìn)一步證實(shí)了恩度在抑制胃癌細(xì)胞EMT方面的有效性。不同研究之間也存在一些差異，如在實(shí)驗(yàn)方法和檢測指標(biāo)上，本研究采用Westernblot法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法分別檢測EMT相關(guān)指標(biāo)的蛋白和mRNA表達(dá)變化，而上述研究僅采用Westernblot法檢測蛋白表達(dá)變化。檢測方法的不同可能導(dǎo)致對EMT進(jìn)程評估的側(cè)重點(diǎn)不同，qRT-PCR法能夠從基因轉(zhuǎn)錄水平反映EMT相關(guān)指標(biāo)的變化，與蛋白水平的檢測結(jié)果相互補(bǔ)充，更全面地評估恩度對NCI-N87細(xì)胞EMT的影響。實(shí)驗(yàn)條件、細(xì)胞狀態(tài)等因素也可能對結(jié)果產(chǎn)生影響，如實(shí)驗(yàn)中恩度的來源、純度，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的營養(yǎng)成分、培養(yǎng)環(huán)境的細(xì)微差別等，都可能導(dǎo)致EMT相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的不同。恩度抑制NCI-N87細(xì)胞EMT的作用機(jī)制可能與多種因素有關(guān)。恩度作為一種血管生成抑制劑，能夠抑制腫瘤新生血管的形成，從而改變腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞因子和信號通路在EMT過程中發(fā)揮重要作用，恩度抑制血管生成后，可能會(huì)影響這些細(xì)胞因子和信號通路的活性，進(jìn)而抑制EMT進(jìn)程。相關(guān)研究表明，腫瘤血管生成過程中產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等因子可以促進(jìn)EMT的發(fā)生，恩度抑制VEGF的作用，可能間接抑制了EMT。恩度還可能直接作用于NCI-N87細(xì)胞，調(diào)節(jié)與EMT相關(guān)的信號通路。TGF-β信號通路是EMT的關(guān)鍵誘導(dǎo)通路之一，恩度可能通過抑制TGF-β信號通路的激活，減少Smad蛋白的磷酸化，從而抑制EMT相關(guān)基因的表達(dá)，使E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin、Vimentin和Snail等表達(dá)降低。恩度也可能通過調(diào)節(jié)其他信號通路，如Wnt/β-catenin信號通路等，來抑制NCI-N87細(xì)胞的EMT。恩度抑制NCI-N87細(xì)胞EMT的作用與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)。在細(xì)胞增殖方面，EMT過程賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的增殖能力，而恩度抑制EMT，可能通過降低腫瘤細(xì)胞的增殖活性，從而抑制腫瘤的生長。在細(xì)胞凋亡方面，EMT過程使腫瘤細(xì)胞對凋亡的抵抗能力增強(qiáng)，恩度抑制EMT，可能會(huì)恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對凋亡的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。恩度抑制NCI-N87細(xì)胞EMT，切斷了腫瘤細(xì)胞從上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的途徑，減少了具有遷移和侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生，從而抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的關(guān)鍵步驟，恩度抑制EMT，使得腫瘤細(xì)胞難以脫離原發(fā)部位，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而減少了腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。在胃癌治療中，恩度抑制NCI-N87細(xì)胞EMT具有重要意義。對于晚期胃癌患者，恩度可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的EMT，降低腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，延長患者的生存期。恩度還可以與其他治療方法聯(lián)合使用，增強(qiáng)治療效果。例如，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，恩度抑制EMT，可使腫瘤細(xì)胞對化療藥物更加敏感，提高化療藥物的殺傷作用?；熕幬镆部梢酝ㄟ^殺死腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步抑制EMT，增強(qiáng)恩度的抑制效果。恩度與免疫治療聯(lián)合使用時(shí)，抑制EMT可以改善腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷能力，提高免疫治療的效果。六、綜合分析與機(jī)制探討6.1恩度對細(xì)胞增殖、凋亡和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的綜合影響本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87增殖、凋亡以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響。結(jié)果顯示，恩度對這三個(gè)方面均產(chǎn)生了顯著作用，且它們之間存在著緊密的內(nèi)在聯(lián)系。在細(xì)胞增殖方面，恩度對NCI-N87細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且這種抑制作用具有顯著的濃度依賴性。隨著恩度濃度從50μg/ml逐漸升高至400μg/ml，細(xì)胞增殖抑制率從18.55%逐步提升至66.48%。這表明恩度能夠有效抑制NCI-N87細(xì)胞的增殖，且濃度越高，抑制效果越顯著。恩度抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供給，使得腫瘤細(xì)胞無法獲取足夠的養(yǎng)分和氧氣，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。恩度還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的信號通路來影響其增殖，如抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路的激活，該信號通路在細(xì)胞增殖、生長和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞凋亡方面，恩度能夠顯著誘導(dǎo)NCI-N87細(xì)胞凋亡，同樣呈現(xiàn)出濃度依賴性。隨著恩度濃度的升高，正常活細(xì)胞比例逐漸降低，早期凋亡細(xì)胞比例和晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞比例逐漸升高，細(xì)胞凋亡率也隨之顯著上升，從對照組的14.37%升高至400μg/ml恩度處理組的57.87%。恩度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)有關(guān)。隨著恩度濃度的增加，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)，Bcl-2/Bax比值逐漸降低，從而促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活內(nèi)源性凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化方面，恩度能夠顯著抑制NCI-N87細(xì)胞的EMT進(jìn)程。隨著恩度濃度的升高，上皮標(biāo)志物E-cadherin的蛋白和mRNA相對表達(dá)量逐漸升高，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和轉(zhuǎn)錄因子Snail的蛋白和mRNA相對表達(dá)量逐漸降低。這表明恩度能夠使NCI-N87細(xì)胞的表型向上皮細(xì)胞方向轉(zhuǎn)變，抑制其向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而抑制EMT進(jìn)程。恩度抑制EMT的作用機(jī)制可能與改變腫瘤微環(huán)境以及調(diào)節(jié)與EMT相關(guān)的信號通路有關(guān)。恩度抑制腫瘤血管生成，可能會(huì)影響腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子和信號通路的活性，進(jìn)而抑制EMT進(jìn)程。恩度還可能直接作用于NCI-N87細(xì)胞，抑制TGF-β信號通路等關(guān)鍵EMT誘導(dǎo)通路的激活，減少Smad蛋白的磷酸化，從而抑制EMT相關(guān)基因的表達(dá)。細(xì)胞增殖、凋亡和EMT之間存在著復(fù)雜的相互關(guān)系，而恩度對它們的影響也相互關(guān)聯(lián)。細(xì)胞增殖和凋亡是細(xì)胞生命活動(dòng)中的兩個(gè)重要過程，它們相互制衡，共同維持細(xì)胞群體的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)恩度抑制NCI-N87細(xì)胞增殖時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，使細(xì)胞無法正常進(jìn)行分裂，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。反之，恩度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，會(huì)使細(xì)胞數(shù)量減少，直接導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。EMT與細(xì)胞增殖、凋亡也密切相關(guān)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，EMT賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的增殖能力和對凋亡的抵抗能力。而恩度抑制EMT，可能會(huì)降低腫瘤細(xì)胞的增殖活性，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對凋亡的敏感性，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。具體而言，恩度抑制EMT，使腫瘤細(xì)胞維持在上皮表型，減少了具有遷移和侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生，同時(shí)也可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，影響細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡。6.2潛在作用機(jī)制探討恩度發(fā)揮其對胃癌細(xì)胞NCI-N87增殖、凋亡以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）影響的潛在作用機(jī)制，涉及多個(gè)層面，其中信號通路和基因表達(dá)調(diào)控是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在信號通路層面，恩度對腫瘤血管生成相關(guān)的VEGF/VEGFR2信號通路具有顯著的抑制作用。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，VEGF與其受體VEGFR2結(jié)合后，激活下游的一系列信號分子，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。恩度能夠直接與VEGFR2結(jié)合，阻斷VEGF與VEGFR2的相互作用，抑制VEGFR2的酪氨酸磷酸化，進(jìn)而抑制下游信號通路的激活。這一作用使得血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移受到抑制，減少了腫瘤新生血管的形成，切斷了腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供給，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制，同時(shí)也可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。相關(guān)研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞模型中，恩度通過抑制VEGF/VEGFR2信號通路，有效地抑制了腫瘤血管生成和腫瘤生長。在小鼠移植瘤模型中，給予恩度處理后，腫瘤組織內(nèi)的VEGF表達(dá)水平下降，血管密度明顯降低，腫瘤體積顯著減小。PI3K-Akt-mTOR信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、代謝和存活等過程中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)該信號通路被激活時(shí)，Akt蛋白被磷酸化激活，進(jìn)而激活下游的mTOR蛋白，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞存活。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K-Akt-mTOR信號通路常常異常激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的不受控制增殖和對凋亡的抵抗。恩度可能通過抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路的激活來發(fā)揮其對NCI-N87細(xì)胞的作用。研究發(fā)現(xiàn)，恩度處理NCI-N87細(xì)胞后，PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平明顯降低，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)也隨之下降，細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制了細(xì)胞增殖。恩度還可能通過下調(diào)該信號通路的活性，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。TGF-β信號通路是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的關(guān)鍵誘導(dǎo)通路之一。TGF-β與其受體結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達(dá)。在本研究中，恩度可能通過抑制TGF-β信號通路的激活來抑制NCI-N87細(xì)胞的EMT進(jìn)程。當(dāng)恩度作用于NCI-N87細(xì)胞時(shí)，可能抑制了TGF-β與其受體的結(jié)合，或者抑制了Smad蛋白的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，從而減少了EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、ZEB1等的表達(dá)。這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)下調(diào)，使得上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞的上皮表型得以維持，抑制了EMT進(jìn)程。相關(guān)研究也證實(shí)，在其他腫瘤細(xì)胞模型中，抑制TGF-β信號通路能夠有效抑制EMT，降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在基因表達(dá)調(diào)控層面，恩度可能通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、凋亡和EMT相關(guān)的基因表達(dá)來發(fā)揮作用。在細(xì)胞增殖方面，恩度可能抑制了與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，如CyclinD1、CyclinE等。CyclinD1和CyclinE是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)控因子，它們的表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。在細(xì)胞凋亡方面，除了調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax基因的表達(dá)外，恩度還可能影響其他凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如Caspase家族基因。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，恩度可能通過上調(diào)這些基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化方面，恩度除了影響TGF-β信號通路相關(guān)基因的表達(dá)外，還可能直接調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)。Snail基因的表達(dá)受到多種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，恩度可能通過抑制相關(guān)的調(diào)控因子，從而下調(diào)Snail基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制EMT進(jìn)程。恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87的作用是通過多層面、多途徑的復(fù)雜機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。通過抑制關(guān)鍵信號通路的激活和調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，恩度有效地抑制了細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡并抑制了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，為恩度在胃癌治療中的應(yīng)用提供了更為深入的理論基礎(chǔ)。七、結(jié)論與展望7.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和多維度的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，系統(tǒng)地探究了恩度對胃癌細(xì)胞NCI-N87增殖、凋亡以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，并深入剖析了其潛在作用機(jī)制，取得了以下重要研究成果。恩度對NCI-N87細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。隨著恩度濃度從50μg/ml逐漸升高至400μg/ml，細(xì)胞增殖抑制率從18.55%逐步提升至66.48%。這一結(jié)果表明恩度能夠有效遏制NCI-N87細(xì)胞的增殖活動(dòng)，且濃度越高，抑制效果越為顯著。MTT比色法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果有力地支持了這一結(jié)論，不同濃度實(shí)驗(yàn)組與對照組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），各實(shí)驗(yàn)組之間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），明確了恩度濃度與細(xì)胞增殖抑制效果之間的緊密關(guān)聯(lián)。恩度能夠顯著誘導(dǎo)NCI-N87細(xì)胞凋亡，同樣呈現(xiàn)出濃度依賴的特性。隨著恩度濃度的升高，正?；罴?xì)胞比例逐漸降低，早期凋亡細(xì)胞比例和晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞比例逐漸升高，細(xì)