免疫組化實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作流程免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）技術(shù)通過抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，結(jié)合顯色系統(tǒng)定位檢測(cè)組織或細(xì)胞中靶抗原的表達(dá)，廣泛應(yīng)用于病理診斷、基礎(chǔ)科研及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可重復(fù)的核心前提，以下結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，詳述免疫組化實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程及關(guān)鍵要點(diǎn)。一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：材料與環(huán)境（一）試劑準(zhǔn)備根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，提前配置或準(zhǔn)備以下試劑（以HRP-DAB顯色系統(tǒng)為例）：脫蠟與水化試劑：新鮮二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）、梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）、蒸餾水?？乖迯?fù)液：檸檬酸鹽修復(fù)液（pH6.0，適用于多數(shù)抗原）或EDTA修復(fù)液（pH8.0，適用于磷酸化蛋白等難修復(fù)抗原）。封閉液：與一抗種屬對(duì)應(yīng)的正常血清（如兔抗一抗用山羊血清）或牛血清白蛋白（BSA，5%）?？贵w：一抗（按說明書稀釋，如1:100-1:500）、二抗（HRP標(biāo)記，如goatanti-rabbitIgG-HRP，1:200-1:500）。顯色系統(tǒng)：DAB顯色液（底物液+顯色劑，現(xiàn)配現(xiàn)用）。復(fù)染試劑：蘇木精染液、1%鹽酸乙醇分化液、自來水（用于返藍(lán)）。封片試劑：中性樹膠、二甲苯（Ⅰ、Ⅱ，透明用）。（二）儀器與耗材儀器：60℃烤箱、微波爐/高壓鍋（抗原修復(fù)用）、恒溫孵育箱、水浴鍋、超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡、移液器（0.5-10μL、____μL）、濕盒（內(nèi)置浸濕濾紙保持濕度）。耗材：防脫載玻片、蓋玻片、染色缸、量筒、吸水紙、一次性滴管。二、操作流程：從切片預(yù)處理到結(jié)果觀察（一）組織切片預(yù)處理：脫蠟與水化1.脫蠟：將石蠟切片置于60℃烤箱烘烤30分鐘（厚切片可延長(zhǎng)至40分鐘），使石蠟融化。隨后依次放入新鮮二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分鐘（二甲苯需定期更換，避免脫蠟不徹底），去除切片中殘留的石蠟。2.水化：將脫蠟后的切片依次移入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各浸泡5分鐘，梯度降低乙醇濃度，使組織從有機(jī)相過渡到水相，為后續(xù)抗原修復(fù)創(chuàng)造條件。最后用蒸餾水沖洗2次，每次2分鐘。（二）抗原修復(fù)：暴露靶抗原表位抗原修復(fù)的目的是打破組織固定過程中形成的蛋白交聯(lián)，暴露被掩蓋的抗原表位。根據(jù)抗原特性選擇修復(fù)方式：微波修復(fù)（常用）：將切片放入修復(fù)液（檸檬酸鹽或EDTA）中，置于微波爐內(nèi)，高火加熱至液體沸騰后，調(diào)至中火保持微沸15-20分鐘（骨組織、纖維組織可延長(zhǎng)至25分鐘）。修復(fù)完成后，自然冷卻至室溫（避免冷水沖洗導(dǎo)致抗原重新封閉）。高壓鍋修復(fù)：將切片與修復(fù)液放入高壓鍋內(nèi)，上汽后計(jì)時(shí)2-3分鐘，自然放氣后冷卻。此方法修復(fù)效率高，適用于難修復(fù)抗原，但需注意防止切片脫落。酶修復(fù)：如胰蛋白酶（0.1%）或胃蛋白酶（0.4%），37℃孵育10-30分鐘，適用于特定抗原（需參考抗體說明書）。（三）內(nèi)源性過氧化物酶阻斷（HRP系統(tǒng)必做）為避免組織自身的過氧化物酶干擾顯色，需進(jìn)行阻斷：將切片放入3%過氧化氫溶液（甲醇或蒸餾水配制）中，室溫孵育10分鐘，隨后用PBS（含0.05%Tween-20，簡(jiǎn)稱PBS-T）沖洗3次，每次5分鐘。（四）封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)滴加封閉液（如5%正常山羊血清或BSA）于切片上，室溫封閉30分鐘（或4℃封閉1小時(shí)）。封閉液需覆蓋組織區(qū)域，避免切片干燥。封閉的目的是阻斷血清蛋白或BSA與非特異性IgG結(jié)合位點(diǎn)，減少背景染色。（五）一抗孵育：特異性結(jié)合靶抗原1.按說明書或預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果稀釋一抗（如1:200），用抗體稀釋液（含BSA和防腐劑）配制，避免反復(fù)凍融抗體。2.吸去封閉液，滴加稀釋后的一抗，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜（或室溫孵育2-3小時(shí)，過夜孵育更充分）。孵育期間需保持濕盒內(nèi)濕度，可在盒底放置浸濕的濾紙。3.孵育結(jié)束后，用PBS-T沖洗切片3次，每次5分鐘，洗去未結(jié)合的一抗。（六）二抗孵育：放大信號(hào)并偶聯(lián)酶分子1.選擇與一抗種屬對(duì)應(yīng)的二抗（如兔抗一抗用goatanti-rabbitIgG-HRP），用封閉液或PBS稀釋（1:200-1:500）。2.滴加二抗，室溫孵育30分鐘（避免光照，防止HRP失活）。3.用PBS-T沖洗切片3次，每次5分鐘，去除未結(jié)合的二抗。（七）顯色反應(yīng)：可視化抗原-抗體復(fù)合物1.現(xiàn)配DAB顯色液：將DAB底物液與顯色劑按1:100比例混合（如1mL底物液+10μL顯色劑），避光保存。2.滴加DAB顯色液于切片上，室溫避光顯色3-10分鐘，期間需在顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察：當(dāng)陽性區(qū)域出現(xiàn)清晰的棕黃色信號(hào)、背景未明顯加深時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)（過染會(huì)導(dǎo)致背景渾濁，欠染則信號(hào)弱）。（八）復(fù)染細(xì)胞核：區(qū)分組織結(jié)構(gòu)1.滴加蘇木精染液，室溫孵育3-5分鐘（淋巴組織可縮短至2分鐘，心肌組織延長(zhǎng)至5分鐘），使細(xì)胞核染成藍(lán)色。2.蒸餾水沖洗后，用1%鹽酸乙醇分化液處理10-20秒（輕晃切片，至細(xì)胞核藍(lán)色變淺、背景透明），自來水沖洗返藍(lán)5分鐘，最后用蒸餾水沖洗干凈。（九）脫水、透明與封片1.脫水：將切片依次放入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各脫水3分鐘，去除組織中的水分。2.透明：移入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各透明5分鐘，使組織透明，便于封片后觀察。3.封片：滴加1滴中性樹膠于切片中央，蓋上蓋玻片（避免氣泡），輕輕按壓使樹膠均勻分布，室溫晾干或37℃烤箱烘干后，即可在顯微鏡下觀察。三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)：保障實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的細(xì)節(jié)（一）試劑管理抗體需按說明書分裝（如5-10μL/管），-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融；稀釋后的抗體需在4℃短期使用（<1周），或-20℃分裝凍存。脫蠟用的二甲苯和乙醇需定期更換（如每周更換1次），防止雜質(zhì)積累導(dǎo)致脫蠟不徹底或背景污染。DAB顯色液為致癌試劑，需佩戴手套、口罩，在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，廢液需單獨(dú)收集處理。（二）操作環(huán)境與切片處理實(shí)驗(yàn)全程需在潔凈環(huán)境下進(jìn)行（如超凈臺(tái)），避免灰塵、毛發(fā)等污染切片，尤其是滴加抗體和顯色液時(shí)。使用防脫載玻片（或涂覆多聚賴氨酸/APES），防止孵育過程中切片脫落；若切片脫落，需重新實(shí)驗(yàn)。（三）孵育條件控制濕盒內(nèi)需放置浸濕的濾紙，保持濕度（濕度不足會(huì)導(dǎo)致切片干燥、非特異性染色）；孵育溫度需穩(wěn)定（4℃或室溫），避免溫度波動(dòng)影響抗原抗體結(jié)合。一抗孵育時(shí)間可根據(jù)抗體特性調(diào)整：高親和力抗體可縮短至2小時(shí)，低親和力抗體需延長(zhǎng)至過夜。（四）顯色與復(fù)染的靈活性顯色時(shí)間需“因片而異”：不同組織（如腫瘤vs正常組織）、不同抗體的顯色速度不同，需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳時(shí)間（如3分鐘、5分鐘、8分鐘分別顯色，對(duì)比效果）。復(fù)染時(shí)間需平衡細(xì)胞核與陽性信號(hào)的對(duì)比度：蘇木精過染會(huì)掩蓋陽性信號(hào)，欠染則細(xì)胞核不清晰，需根據(jù)組織類型微調(diào)（如上皮組織復(fù)染3分鐘，間質(zhì)組織復(fù)染5分鐘）。（五）結(jié)果穩(wěn)定性與重復(fù)性同一批次實(shí)驗(yàn)需使用相同的試劑、儀器和操作條件（如孵育時(shí)間、溫度），減少批次間差異。若需定量分析，建議采用圖像分析軟件（如ImageJ），并設(shè)置至少3個(gè)重復(fù)切片，取平均值。四、結(jié)果判讀：從信號(hào)定位到強(qiáng)度評(píng)估鏡下觀察時(shí)，需關(guān)注以下要點(diǎn)：信號(hào)定位：陽性信號(hào)的部位（細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核）可輔助判斷抗原的功能狀態(tài)（如細(xì)胞膜抗原提示受體表達(dá)，核抗原提示轉(zhuǎn)錄因子激活）。染色強(qiáng)度：分為陰性（無棕黃色信號(hào)）、弱陽性（淡黃色，低倍鏡下隱約可見）、中等陽性（棕黃色，高倍鏡下清晰）、強(qiáng)陽性（深棕褐色，信號(hào)濃郁）。背景評(píng)估：理想的結(jié)果應(yīng)背景清晰（無彌漫性棕黃色染色），若背景過深，需排查封閉不充分、抗體濃度