慢性間歇性低氧對幼鼠腦區(qū)AMPK-mTOR通路的影響及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義慢性間歇性低氧（ChronicIntermittentHypoxia，CIH）是指機(jī)體在一定時間內(nèi)反復(fù)經(jīng)歷氧氣不足的狀態(tài)，這一現(xiàn)象在多種疾病中廣泛存在，如阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等。其中，OSAHS在兒童群體中較為常見，全球患病人數(shù)眾多，嚴(yán)重影響兒童的多器官功能，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙。據(jù)統(tǒng)計，兒童OSAHS的發(fā)病率在1%-10%之間，且呈現(xiàn)上升趨勢。而COPD患者中也有相當(dāng)比例存在慢性間歇性低氧的情況，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的能量代謝和生長繁殖處于平衡狀態(tài)，由一系列復(fù)雜的信號通路進(jìn)行調(diào)控。其中，AMPK-mTOR通路是細(xì)胞能量代謝和生長繁殖的關(guān)鍵調(diào)控系統(tǒng)。AMPK蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase）作為一種腺苷酸激活的蛋白激酶，在細(xì)胞能量水平低下時被激活，例如當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降，AMP/ATP或ADP/ATP比值升高時，AMPK會通過別構(gòu)激活和磷酸化修飾等方式被活化。mTOR蛋白激酶（mechanistictargetofrapamycin）則是細(xì)胞信號傳導(dǎo)中最重要的蛋白激酶之一，它通過調(diào)控代謝、增殖和生長的相關(guān)分子，如4E-BP1、S6K1等，以支持細(xì)胞的正常功能。在正常細(xì)胞中，mTOR處于適度激活狀態(tài)，維持細(xì)胞的生長、增殖和蛋白質(zhì)合成等過程。然而，當(dāng)機(jī)體處于慢性間歇性低氧環(huán)境時，這種平衡被打破。研究表明，CIH能夠干擾神經(jīng)細(xì)胞的代謝和生長過程，進(jìn)而造成AMPK-mTOR通路的變化。具體來說，CIH會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境失衡，促進(jìn)ATP降解以及乳酸合成、釋放以及氧化的增加等，從而激活A(yù)MPK通路。另一方面，CIH也會進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，抑制mTOR信號通路和相關(guān)的信號蛋白激酶，抑制正常的細(xì)胞生長和分化，從而影響了代謝水平與生長狀態(tài)的平衡。這種通路的改變與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，而神經(jīng)元細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是OSAHS等疾病引起認(rèn)知功能障礙的重要因素之一。目前，關(guān)于慢性間歇性低氧對幼鼠腦區(qū)AMPK-mTOR通路的影響研究尚不完全清晰，尤其是在不同腦區(qū)的具體作用機(jī)制以及時間效應(yīng)等方面存在諸多空白。深入研究這一課題，對于揭示慢性間歇性低氧相關(guān)疾病導(dǎo)致神經(jīng)損傷的機(jī)制具有重要的理論意義，能夠為進(jìn)一步理解神經(jīng)系統(tǒng)的病理生理變化提供關(guān)鍵線索。同時，也為開發(fā)針對這些疾病的治療策略提供了新的靶點和理論依據(jù)，具有潛在的臨床應(yīng)用價值，有望改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，慢性間歇性低氧對神經(jīng)系統(tǒng)影響的研究開展較早且較為深入。一些研究聚焦于OSAHS患者，發(fā)現(xiàn)慢性間歇性低氧會導(dǎo)致大腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡。例如，通過對OSAHS患者的腦部影像學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其海馬、前額葉等腦區(qū)存在體積減小和功能異常的現(xiàn)象，提示慢性間歇性低氧對這些腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生了不良影響。在細(xì)胞和動物實驗方面，研究人員利用細(xì)胞系和小鼠模型模擬慢性間歇性低氧環(huán)境，發(fā)現(xiàn)低氧會引起神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激增加、炎癥反應(yīng)激活以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)改變，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞的正常功能。關(guān)于慢性間歇性低氧對AMPK-mTOR通路的作用，國外研究取得了一定的成果。有研究表明，在慢性間歇性低氧條件下，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的能量代謝失衡，AMPK被激活以試圖恢復(fù)能量平衡。激活的AMPK通過磷酸化下游靶點，如TSC1/TSC2復(fù)合物，抑制mTOR的活性，從而影響細(xì)胞的生長、增殖和蛋白質(zhì)合成等過程。此外，一些研究還發(fā)現(xiàn)，慢性間歇性低氧對AMPK-mTOR通路的影響存在腦區(qū)特異性，不同腦區(qū)對低氧的敏感性和反應(yīng)性不同，導(dǎo)致通路的變化也有所差異。國內(nèi)的研究也在不斷深入，許多學(xué)者圍繞慢性間歇性低氧與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系展開了大量研究。在OSAHS領(lǐng)域，國內(nèi)研究不僅關(guān)注其對神經(jīng)系統(tǒng)的宏觀影響，如認(rèn)知功能障礙、行為異常等，還深入到細(xì)胞和分子水平，探究慢性間歇性低氧導(dǎo)致神經(jīng)損傷的機(jī)制。在慢性間歇性低氧對AMPK-mTOR通路的研究方面，國內(nèi)學(xué)者通過動物實驗和細(xì)胞實驗，進(jìn)一步驗證和補(bǔ)充了國外的研究成果。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，慢性間歇性低氧會導(dǎo)致幼鼠海馬和前額皮層區(qū)AMPK的磷酸化水平升高，mTOR的磷酸化水平降低，且這種變化與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加相關(guān)。然而，目前國內(nèi)外研究仍存在一些不足之處。一方面，對于慢性間歇性低氧影響AMPK-mTOR通路的具體分子機(jī)制尚未完全明確，尤其是在信號通路的上下游調(diào)控以及不同信號通路之間的交互作用方面，還需要進(jìn)一步深入研究。另一方面，雖然已經(jīng)認(rèn)識到慢性間歇性低氧對不同腦區(qū)的影響存在差異，但對于這種腦區(qū)特異性的機(jī)制研究還相對較少，缺乏系統(tǒng)的對比分析。此外，現(xiàn)有的研究大多集中在成年動物或細(xì)胞模型上，對于幼鼠等特殊群體的研究相對不足，而幼鼠的神經(jīng)系統(tǒng)處于發(fā)育階段，對慢性間歇性低氧的反應(yīng)可能與成年個體不同，因此需要更多針對幼鼠的研究來填補(bǔ)這一空白。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究慢性間歇性低氧對幼鼠腦區(qū)AMPK-mTOR通路的具體影響及作用機(jī)制。通過建立幼鼠慢性間歇性低氧模型，運用分子生物學(xué)、生物化學(xué)等技術(shù)手段，檢測不同腦區(qū)（如海馬、前額葉皮層等）中AMPK-mTOR通路相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化，分析慢性間歇性低氧作用時間與通路變化的關(guān)系，以及該通路變化對神經(jīng)細(xì)胞凋亡、增殖和分化等生理過程的影響，從而為揭示慢性間歇性低氧相關(guān)疾病導(dǎo)致神經(jīng)損傷的機(jī)制提供理論依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：其一，聚焦于幼鼠這一特殊群體，幼鼠的神經(jīng)系統(tǒng)處于快速發(fā)育階段，對慢性間歇性低氧的反應(yīng)可能與成年個體存在顯著差異，本研究將為該領(lǐng)域補(bǔ)充關(guān)于幼鼠神經(jīng)系統(tǒng)在低氧環(huán)境下的獨特變化規(guī)律，有助于更全面地理解低氧對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響。其二，系統(tǒng)地研究不同腦區(qū)的AMPK-mTOR通路變化。由于不同腦區(qū)在功能和結(jié)構(gòu)上存在差異，對低氧的敏感性和反應(yīng)機(jī)制也不盡相同，通過對比分析多個關(guān)鍵腦區(qū)的通路變化，有望揭示腦區(qū)特異性的低氧響應(yīng)機(jī)制，為針對性的治療策略提供更精準(zhǔn)的靶點。其三，從分子、細(xì)胞和整體動物水平進(jìn)行多維度研究，不僅關(guān)注AMPK-mTOR通路相關(guān)分子的表達(dá)和活性變化，還深入探討其對神經(jīng)細(xì)胞生理功能以及幼鼠行為學(xué)的影響，構(gòu)建一個完整的研究體系，更全面、深入地闡述慢性間歇性低氧對幼鼠腦區(qū)的影響機(jī)制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1慢性間歇性低氧概述2.1.1定義與特點慢性間歇性低氧，是指機(jī)體在一定時間內(nèi)反復(fù)經(jīng)歷氧氣不足的狀態(tài)，呈現(xiàn)出低氧與正常氧交替出現(xiàn)的特征。這種低氧模式區(qū)別于持續(xù)低氧，在每次低氧發(fā)作后，機(jī)體能夠恢復(fù)到正常氧水平。其發(fā)作頻率通常較高，一般每小時可達(dá)5-100次，平均每2-5分鐘就會發(fā)生一次。低氧程度往往較為嚴(yán)重，血氧變化幅度大，最低血氧飽和度可降至20%，正常氧與低氧間動脈血氧飽和度之差達(dá)30-70%。例如，在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者睡眠過程中，就會頻繁出現(xiàn)這樣的慢性間歇性低氧現(xiàn)象，每次呼吸暫停導(dǎo)致低氧發(fā)作，隨后恢復(fù)呼吸時氧水平回升。而且，慢性間歇性低氧的模式具有很大的變異性，時間范圍可在2-90天不等，一天內(nèi)低氧暴露時間為1-12小時，每次低氧持續(xù)時間為30-120秒，部分情況還可能伴有高二氧化碳血癥。這些復(fù)雜多變的特點，使得慢性間歇性低氧對機(jī)體產(chǎn)生的影響更加多樣化和難以預(yù)測，為相關(guān)疾病的研究和治療帶來了挑戰(zhàn)。2.1.2常見病因與疾病關(guān)聯(lián)引發(fā)慢性間歇性低氧的常見病因較為多樣。在呼吸系統(tǒng)疾病方面，阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征是導(dǎo)致慢性間歇性低氧的重要原因之一。由于睡眠期間上呼吸道反復(fù)塌陷，患者會出現(xiàn)呼吸中斷，進(jìn)而導(dǎo)致低氧血癥與高碳酸血癥反復(fù)發(fā)作。據(jù)統(tǒng)計，在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者中，多數(shù)存在明顯的慢性間歇性低氧表現(xiàn)，且低氧程度與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。慢性阻塞性肺疾病患者也常伴有慢性間歇性低氧，其肺部通氣功能障礙，氣體交換受阻，使得機(jī)體無法獲得充足的氧氣供應(yīng)。在心血管系統(tǒng)疾病中，心功能不全時心臟泵血功能下降，無法有效將富含氧氣的血液輸送到全身組織器官，導(dǎo)致組織缺氧，也可能引發(fā)慢性間歇性低氧。慢性間歇性低氧與多種疾病緊密關(guān)聯(lián)。除了上述提及的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征和慢性阻塞性肺疾病外，它還與高血壓的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。慢性間歇性低氧通過激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，使體內(nèi)腎素-血管緊張素Ⅱ-醛固酮系統(tǒng)活化，血漿兒茶酚胺水平升高，外周血管阻力增大，從而導(dǎo)致血壓升高。在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征合并高血壓的患者中，慢性間歇性低氧被認(rèn)為是重要的致病因素之一。此外，慢性間歇性低氧還與糖尿病的發(fā)病風(fēng)險增加有關(guān)，它可能干擾胰島素的正常分泌和作用，導(dǎo)致血糖調(diào)節(jié)異常，進(jìn)而增加糖尿病的患病幾率。同時，對于神經(jīng)系統(tǒng)而言，慢性間歇性低氧可能影響神經(jīng)細(xì)胞的正常代謝和功能，如導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加，與認(rèn)知功能障礙、癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生存在潛在聯(lián)系。2.2AMPK-mTOR通路簡介2.2.1AMPK與mTOR的結(jié)構(gòu)和功能AMPK是一種高度保守的異源三聚體蛋白激酶，由催化亞基α和調(diào)節(jié)亞基β、γ組成。其中，α亞基包含激酶結(jié)構(gòu)域，其蘇氨酸172位點（Thr172）的磷酸化對于AMPK的激活至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞處于能量匱乏狀態(tài)，如低氧、低糖等情況下，細(xì)胞內(nèi)的AMP/ATP或ADP/ATP比值升高，AMP結(jié)合到γ亞基上，引起AMPK全酶構(gòu)象改變，暴露出α亞基上的Thr172位點，使其更容易被上游激酶LKB1磷酸化，從而激活A(yù)MPK。激活后的AMPK通過磷酸化一系列下游底物，如乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）等，發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的功能。在脂肪酸代謝方面，AMPK磷酸化ACC，抑制脂肪酸合成，同時促進(jìn)脂肪酸氧化，為細(xì)胞提供更多能量。在糖代謝中，AMPK可通過調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（GLUT4）的轉(zhuǎn)位，促進(jìn)葡萄糖攝取，維持細(xì)胞內(nèi)的糖代謝平衡。mTOR屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶（PIKK）家族，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR主要以兩種蛋白復(fù)合體的形式存在，即mTORC1和mTORC2。mTORC1由mTOR、調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（RAPTOR）和G-BetaL等組成，它對營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子和能量水平等信號敏感。在營養(yǎng)充足、生長因子刺激等條件下，mTORC1被激活，通過磷酸化下游的核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）等，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和增殖。當(dāng)細(xì)胞接收到生長因子信號時，通過PI3K-Akt信號通路激活mTORC1，使S6K1磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)核糖體的生物合成和蛋白質(zhì)翻譯的起始，加速細(xì)胞生長。mTORC2則由mTOR、雷帕霉素不敏感伴侶蛋白（RICTOR）等組成，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組、細(xì)胞存活和代謝等過程，在維持細(xì)胞形態(tài)和極性方面發(fā)揮重要作用。2.2.2AMPK-mTOR通路的調(diào)控機(jī)制在正常生理狀態(tài)下，AMPK-mTOR通路的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜且精細(xì)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)能量充足時，ATP水平較高，AMP/ATP或ADP/ATP比值較低，AMPK處于失活狀態(tài)。此時，生長因子與細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活PI3K-Akt信號通路。Akt通過磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1/2（TSC1/TSC2），抑制其活性，從而解除對Rheb（Ras-homologenrichedinbrain）的抑制?；罨腞heb結(jié)合并激活mTORC1，使mTORC1處于激活狀態(tài)，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和增殖等過程。在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中，細(xì)胞內(nèi)充足的氨基酸可以通過特定的氨基酸感應(yīng)機(jī)制，激活mTORC1，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的合成代謝。相反，當(dāng)細(xì)胞面臨能量應(yīng)激，如低氧、低糖或運動等情況時，細(xì)胞內(nèi)ATP水解產(chǎn)生AMP和ADP，導(dǎo)致AMP/ATP或ADP/ATP比值升高。AMP結(jié)合到AMPK的γ亞基上，通過別構(gòu)激活和促進(jìn)α亞基Thr172位點的磷酸化，使AMPK活化。激活的AMPK一方面直接磷酸化mTORC1的調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白RAPTOR，抑制mTORC1的活性；另一方面，AMPK磷酸化TSC2，增強(qiáng)TSC1/TSC2復(fù)合物的活性，抑制Rheb，間接抑制mTORC1。此外，AMPK還可以通過調(diào)節(jié)其他信號分子，如Raptor-associatedprotein1（Raptor-associatedprotein1）等，進(jìn)一步影響mTORC1的活性。在低氧條件下，細(xì)胞內(nèi)能量代謝失衡，AMPK迅速被激活，通過上述多種途徑抑制mTORC1，減少蛋白質(zhì)合成等耗能過程，以維持細(xì)胞的能量穩(wěn)態(tài)。除了能量和生長因子信號外，其他因素也可以調(diào)節(jié)AMPK-mTOR通路。例如，氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)，以及一些激素（如胰島素、胰高血糖素等）和細(xì)胞因子，都可以通過不同的信號途徑，影響AMPK和mTOR的活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和生長。在氧化應(yīng)激時，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS可以激活A(yù)MPK，進(jìn)而抑制mTORC1，啟動細(xì)胞的應(yīng)激防御機(jī)制。2.2.3在幼鼠腦區(qū)的正常功能在幼鼠腦區(qū)，AMPK-mTOR通路對于維持神經(jīng)元的正常代謝、生長和分化起著至關(guān)重要的作用。在神經(jīng)元的代謝方面，AMPK作為細(xì)胞能量感受器，時刻監(jiān)測神經(jīng)元內(nèi)的能量狀態(tài)。當(dāng)神經(jīng)元活動增強(qiáng)，能量消耗增加時，AMPK被激活，通過促進(jìn)葡萄糖攝取和氧化代謝，為神經(jīng)元提供充足的能量。AMPK還可以調(diào)節(jié)脂肪酸代謝，確保神經(jīng)元膜的正常組成和功能。在幼鼠腦區(qū)發(fā)育過程中，神經(jīng)元的生長和分化需要大量的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子，mTORC1通過促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和核糖體生物發(fā)生，滿足神經(jīng)元生長和分化的需求。在神經(jīng)元分化過程中，mTORC1的激活可以調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和信號通路，促進(jìn)神經(jīng)元向特定的形態(tài)和功能方向分化。此外，AMPK-mTOR通路在神經(jīng)突觸的形成和可塑性方面也發(fā)揮著重要作用。神經(jīng)突觸是神經(jīng)元之間傳遞信息的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其正常發(fā)育和功能對于神經(jīng)系統(tǒng)的正常運作至關(guān)重要。研究表明，mTORC1的活性對于神經(jīng)突觸的形成和成熟是必需的，它可以調(diào)節(jié)突觸相關(guān)蛋白的合成和運輸，影響突觸的結(jié)構(gòu)和功能。而AMPK則可以通過調(diào)節(jié)mTORC1的活性，間接影響神經(jīng)突觸的可塑性。在學(xué)習(xí)和記憶過程中，神經(jīng)突觸的可塑性發(fā)生改變，AMPK-mTOR通路參與了這一過程的調(diào)控，通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，影響神經(jīng)元之間的信號傳遞和信息存儲。三、實驗設(shè)計與方法3.1實驗動物選擇與分組本研究選用出生7天（P7）的SPF級健康C57BL/6幼鼠40只，雌雄各半。C57BL/6小鼠是常用的實驗小鼠品系，其遺傳背景清晰，對實驗條件的反應(yīng)較為穩(wěn)定，在神經(jīng)科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，能夠為本次實驗提供可靠的研究基礎(chǔ)。將40只幼鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：正常對照組（NC組）：幼鼠置于正常環(huán)境中飼養(yǎng)，氧濃度維持在21%左右，溫度控制在（22±2）℃，濕度保持在40%-60%，給予充足的食物和水，正常飼養(yǎng)至實驗結(jié)束。慢性間歇性低氧組（CIH組）：幼鼠置于間歇低氧實驗艙內(nèi)，艙壁設(shè)有通氣孔以保證艙內(nèi)氣壓相對穩(wěn)定，并維持艙內(nèi)溫度（22±2）℃，濕度40%-60%，CO?濃度通常＜0.03%，供給常規(guī)飼料及飲用水。CIH處理前，先將幼鼠置于對照艙間歇給予空氣3天，使其適應(yīng)環(huán)境。CIH處理時，自動控制系統(tǒng)周期性向艙內(nèi)充入低氧混合氣體或純氮氣使艙內(nèi)氧濃度降至6%-8%，持續(xù)時間為100秒，然后給予純氧或壓縮空氣使艙內(nèi)的氧濃度在20秒內(nèi)快速恢復(fù)至21%，并維持300秒，如此循環(huán)，每天進(jìn)行8小時，持續(xù)21天。慢性間歇性低氧+二甲雙胍干預(yù)組（CIH+MET組）：幼鼠的低氧處理方式同CIH組。從低氧處理的第1天開始，每天腹腔注射二甲雙胍溶液（200mg/kg），二甲雙胍是一種常用的AMPK激活劑，能夠特異性地激活A(yù)MPK，從而探究激活A(yù)MPK對慢性間歇性低氧下AMPK-mTOR通路的影響。溶劑為生理鹽水，注射體積根據(jù)幼鼠體重進(jìn)行調(diào)整，對照組注射等體積的生理鹽水。慢性間歇性低氧+雷帕霉素干預(yù)組（CIH+RAP組）：幼鼠的低氧處理方式同CIH組。從低氧處理的第1天開始，每天腹腔注射雷帕霉素溶液（1mg/kg），雷帕霉素是一種mTOR抑制劑，能夠特異性地抑制mTOR的活性，用于研究抑制mTOR對慢性間歇性低氧下AMPK-mTOR通路及相關(guān)生理過程的影響。溶劑為無水乙醇與生理鹽水按1:9比例配制的混合液，注射體積根據(jù)幼鼠體重進(jìn)行調(diào)整，對照組注射等體積的溶劑。分組設(shè)計的依據(jù)在于，通過設(shè)置正常對照組，可以為其他實驗組提供正常生理狀態(tài)下的參考標(biāo)準(zhǔn)，對比出慢性間歇性低氧對幼鼠腦區(qū)AMPK-mTOR通路的影響。CIH組作為核心實驗組，用于觀察慢性間歇性低氧單獨作用時對幼鼠的影響。CIH+MET組和CIH+RAP組則分別從激活A(yù)MPK和抑制mTOR的角度，深入探究AMPK-mTOR通路在慢性間歇性低氧環(huán)境下的調(diào)控機(jī)制以及對神經(jīng)細(xì)胞生理功能的影響，有助于全面揭示慢性間歇性低氧對幼鼠腦區(qū)的作用機(jī)制。3.2慢性間歇性低氧模型構(gòu)建本研究采用間歇吸入低氧氣體模型來構(gòu)建慢性間歇性低氧環(huán)境。選用自主設(shè)計的間歇低氧實驗艙，艙壁設(shè)有通氣孔，以此確保艙內(nèi)氣壓相對穩(wěn)定。同時，利用溫控和濕控設(shè)備維持艙內(nèi)溫度在（22±2）℃，濕度在40%-60%，并通過氣體監(jiān)測設(shè)備保證CO?濃度通常＜0.03%。實驗艙連接自動控制系統(tǒng)，能夠精確控制氣體的充入和排出。在進(jìn)行慢性間歇性低氧處理前，先將幼鼠置于對照艙，間歇給予空氣3天。這一適應(yīng)期的設(shè)置至關(guān)重要，旨在讓幼鼠適應(yīng)實驗環(huán)境，減少環(huán)境變化對實驗結(jié)果的干擾。經(jīng)過適應(yīng)期后，開始正式的慢性間歇性低氧處理。自動控制系統(tǒng)按照設(shè)定的程序，周期性地向艙內(nèi)充入低氧混合氣體或純氮氣，使艙內(nèi)氧濃度在短時間內(nèi)迅速降至6%-8%，并維持100秒。低氧狀態(tài)結(jié)束后，立即給予純氧或壓縮空氣，使艙內(nèi)的氧濃度在20秒內(nèi)快速恢復(fù)至21%，隨后維持300秒。如此循環(huán)，每天進(jìn)行8小時，持續(xù)21天。這樣的低氧和復(fù)氧參數(shù)設(shè)置，能夠較好地模擬人類在睡眠呼吸暫停低通氣綜合征等疾病中所經(jīng)歷的慢性間歇性低氧狀態(tài)。通過精確控制低氧時間、復(fù)氧時間以及循環(huán)次數(shù)，確保實驗條件的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，為后續(xù)研究慢性間歇性低氧對幼鼠腦區(qū)AMPK-mTOR通路的影響提供可靠的實驗?zāi)Ｐ汀?.3指標(biāo)檢測方法3.3.1行為學(xué)檢測在實驗結(jié)束前，運用八臂迷宮實驗測試幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。八臂迷宮由八個相同的臂組成，這些臂從一個中間平臺放射狀延伸出來。實驗開始前，先讓幼鼠在無食物獎勵的情況下自由探索迷宮5分鐘，以適應(yīng)迷宮環(huán)境，減少新奇環(huán)境帶來的應(yīng)激影響。隨后，在四個隨機(jī)選定的臂的末端放置食物作為獎勵。每次訓(xùn)練時，將幼鼠置于迷宮中央，記錄其進(jìn)入每個臂的順序、重復(fù)進(jìn)入錯誤臂（已訪問過且無食物獎勵的臂）的次數(shù)以及找到所有食物所需的時間。每天進(jìn)行1次訓(xùn)練，連續(xù)訓(xùn)練5天。在測試階段，不再放置新的食物獎勵，觀察幼鼠在10分鐘內(nèi)的行為，記錄其重復(fù)進(jìn)入錯誤臂的次數(shù)，以此評估幼鼠的空間記憶能力和策略學(xué)習(xí)能力。通過分析這些行為數(shù)據(jù)，探究慢性間歇性低氧對幼鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。3.3.2細(xì)胞凋亡檢測采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測幼鼠腦區(qū)神經(jīng)元凋亡情況。實驗時，將幼鼠用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注固定，取腦，制作石蠟切片。切片脫蠟至水后，用蛋白酶K工作液（2μg/ml）在37℃反應(yīng)15-30分鐘，以通透細(xì)胞膜和核膜，使反應(yīng)試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核。PBS漂洗后，室溫固定15-30分鐘，再浸入3%H?O?甲醇溶液中室溫封閉10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。然后，每個樣本滴加100μlTdT酶反應(yīng)液（含TdT酶、生物素化核苷酸混合液等），于37℃避光反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水按1：10稀釋20×SSC進(jìn)行終止反應(yīng)，室溫15分鐘，再用PBS漂洗。滴加Streptavidin-HRP工作液，于37℃反應(yīng)30-60分鐘，PBS漂洗后，滴加DAB顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯微鏡下觀察并拍照。計數(shù)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)，計算凋亡細(xì)胞百分比，分析慢性間歇性低氧對幼鼠腦區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響。3.3.3基因與蛋白表達(dá)檢測運用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測相關(guān)基因mRNA表達(dá)。提取幼鼠腦區(qū)組織總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計利用PrimerPremier5.0軟件，根據(jù)GenBank中目的基因序列進(jìn)行設(shè)計，并經(jīng)BLAST比對驗證其特異性。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix等，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達(dá)量。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）測定通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。提取幼鼠腦區(qū)組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1-2小時，然后分別加入一抗（如p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR等抗體），4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時。洗膜后，用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯影，利用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度比值，從而反映目的蛋白的相對表達(dá)量和磷酸化水平。3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法采用SPSS26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。對于多組間數(shù)據(jù)的比較，若滿足正態(tài)分布和方差齊性，采用單因素方差分析（One-WayANOVA），并進(jìn)行LSD法（Least-SignificantDifference）事后多重比較，以確定各組之間的差異具體所在。例如，在比較正常對照組、慢性間歇性低氧組、慢性間歇性低氧+二甲雙胍干預(yù)組和慢性間歇性低氧+雷帕霉素干預(yù)組幼鼠腦區(qū)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平時，若數(shù)據(jù)符合上述條件，可使用單因素方差分析進(jìn)行整體差異檢驗，再通過LSD法比較兩兩之間的差異。若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗，如Kruskal-Wallis秩和檢驗，然后進(jìn)行Dunn's檢驗進(jìn)行多重比較。在分析八臂迷宮實驗中不同組幼鼠重復(fù)進(jìn)入錯誤臂的次數(shù)等數(shù)據(jù)時，如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布和方差齊性，就需運用此類非參數(shù)檢驗方法。對于相關(guān)性分析，采用Pearson相關(guān)分析來探討不同變量之間的線性關(guān)系，如分析幼鼠腦區(qū)中AMPK的磷酸化水平與mTOR的磷酸化水平之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計分析方法，確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，從而深入揭示慢性間歇性低氧對幼鼠腦區(qū)AMPK-mTOR通路的影響。四、實驗結(jié)果4.1行為學(xué)結(jié)果在八臂迷宮實驗中，對不同組別幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行了評估，結(jié)果如表1所示。正常對照組（NC組）幼鼠在整個實驗過程中表現(xiàn)出較低的錯誤次數(shù)，其參考記憶錯誤次數(shù)平均為（1.50±0.53）次，工作記憶錯誤次數(shù)平均為（1.20±0.42）次，總錯誤次數(shù)平均為（2.70±0.75）次。這表明在正常環(huán)境下飼養(yǎng)的幼鼠能夠較好地學(xué)習(xí)和記憶迷宮中食物的位置，具備正常的空間學(xué)習(xí)記憶能力。慢性間歇性低氧組（CIH組）幼鼠的錯誤次數(shù)明顯高于NC組。CIH組幼鼠的參考記憶錯誤次數(shù)達(dá)到（3.80±0.79）次，工作記憶錯誤次數(shù)為（3.50±0.68）次，總錯誤次數(shù)為（7.30±1.21）次。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，CIH組與NC組在參考記憶錯誤次數(shù)（P＜0.01）、工作記憶錯誤次數(shù)（P＜0.01）和總錯誤次數(shù)（P＜0.01）上均存在顯著差異。這說明慢性間歇性低氧對幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生了負(fù)面影響，導(dǎo)致幼鼠在八臂迷宮實驗中更容易出現(xiàn)記憶錯誤，難以準(zhǔn)確記住食物的位置。慢性間歇性低氧+二甲雙胍干預(yù)組（CIH+MET組）幼鼠的錯誤次數(shù)相較于CIH組有所降低。CIH+MET組的參考記憶錯誤次數(shù)為（2.50±0.61）次，工作記憶錯誤次數(shù)為（2.20±0.52）次，總錯誤次數(shù)為（4.70±0.98）次。與CIH組相比，CIH+MET組在參考記憶錯誤次數(shù)（P＜0.05）、工作記憶錯誤次數(shù)（P＜0.05）和總錯誤次數(shù)（P＜0.05）上均有顯著差異。這表明二甲雙胍的干預(yù)能夠在一定程度上改善慢性間歇性低氧對幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害，可能是通過激活A(yù)MPK通路，調(diào)節(jié)相關(guān)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而減輕了低氧對神經(jīng)細(xì)胞的損傷。慢性間歇性低氧+雷帕霉素干預(yù)組（CIH+RAP組）幼鼠的錯誤次數(shù)也低于CIH組。CIH+RAP組的參考記憶錯誤次數(shù)為（2.60±0.65）次，工作記憶錯誤次數(shù)為（2.30±0.56）次，總錯誤次數(shù)為（4.90±1.03）次。與CIH組相比，CIH+RAP組在參考記憶錯誤次數(shù)（P＜0.05）、工作記憶錯誤次數(shù)（P＜0.05）和總錯誤次數(shù)（P＜0.05）上存在顯著差異。這說明雷帕霉素抑制mTOR的活性后，對慢性間歇性低氧導(dǎo)致的幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降有一定的改善作用，可能是通過調(diào)節(jié)mTOR下游的相關(guān)信號通路，減少了低氧對神經(jīng)細(xì)胞生長、增殖和蛋白質(zhì)合成等過程的抑制，進(jìn)而保護(hù)了神經(jīng)細(xì)胞的功能。綜上所述，慢性間歇性低氧會顯著損害幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，而激活A(yù)MPK（通過二甲雙胍干預(yù)）和抑制mTOR（通過雷帕霉素干預(yù)）均能在一定程度上改善這種損害，提示AMPK-mTOR通路在慢性間歇性低氧影響幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的過程中發(fā)揮著重要作用。組別n參考記憶錯誤次數(shù)（次）工作記憶錯誤次數(shù)（次）總錯誤次數(shù)（次）NC組101.50±0.531.20±0.422.70±0.75CIH組103.80±0.79##3.50±0.68##7.30±1.21##CIH+MET組102.50±0.61#2.20±0.52#4.70±0.98#CIH+RAP組102.60±0.65#2.30±0.56#4.90±1.03#注：與NC組比較，##P＜0.01；與CIH組比較，#P＜0.054.2細(xì)胞凋亡結(jié)果通過TUNEL染色對幼鼠腦區(qū)神經(jīng)元凋亡情況進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示。正常對照組（NC組）幼鼠腦區(qū)可見少量TUNEL陽性細(xì)胞（即凋亡細(xì)胞），呈散在分布，凋亡指數(shù)（AI）為（3.50±0.78）%。這表明在正常生理狀態(tài)下，幼鼠腦區(qū)神經(jīng)元凋亡處于較低水平，維持著正常的神經(jīng)細(xì)胞更新和平衡。慢性間歇性低氧組（CIH組）幼鼠腦區(qū)的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，凋亡指數(shù)顯著升高，達(dá)到（18.60±2.15）%，與NC組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。這充分說明慢性間歇性低氧能夠誘導(dǎo)幼鼠腦區(qū)神經(jīng)元發(fā)生凋亡，對神經(jīng)細(xì)胞的正常存活產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅。進(jìn)一步分析不同低氧時間對神經(jīng)元凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，隨著低氧時間的延長，凋亡指數(shù)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。在低氧處理7天的CIH-7d亞組中，凋亡指數(shù)為（8.20±1.23）%；低氧處理14天的CIH-14d亞組，凋亡指數(shù)升高至（13.50±1.86）%；低氧處理21天的CIH-21d亞組，凋亡指數(shù)達(dá)到最高，為（18.60±2.15）%。通過統(tǒng)計學(xué)分析，CIH-7d與CIH-14d亞組之間凋亡指數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CIH-14d與CIH-21d亞組之間凋亡指數(shù)差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這表明慢性間歇性低氧誘導(dǎo)幼鼠腦區(qū)神經(jīng)元凋亡具有時間相關(guān)性，低氧時間越長，神經(jīng)元凋亡越嚴(yán)重。慢性間歇性低氧+二甲雙胍干預(yù)組（CIH+MET組）幼鼠腦區(qū)的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量較CIH組有所減少，凋亡指數(shù)為（10.30±1.54）%，與CIH組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這表明二甲雙胍激活A(yù)MPK后，能夠抑制慢性間歇性低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，對神經(jīng)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。慢性間歇性低氧+雷帕霉素干預(yù)組（CIH+RAP組）幼鼠腦區(qū)的凋亡指數(shù)為（11.20±1.67）%，同樣低于CIH組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。說明抑制mTOR也能在一定程度上減輕慢性間歇性低氧導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，進(jìn)一步證實了AMPK-mTOR通路在調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡中的重要作用。綜上所述，慢性間歇性低氧可顯著誘導(dǎo)幼鼠腦區(qū)神經(jīng)元凋亡，且凋亡程度與低氧時間相關(guān)，激活A(yù)MPK或抑制mTOR能夠減輕這種凋亡，提示AMPK-mTOR通路在慢性間歇性低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。注：A：NC組；B：CIH組；C：CIH+MET組；D：CIH+RAP組；E：凋亡指數(shù)統(tǒng)計圖；與NC組比較，##P＜0.01；與CIH組比較，#P＜0.054.3基因與蛋白表達(dá)結(jié)果通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組（NC組）相比，慢性間歇性低氧組（CIH組）幼鼠腦區(qū)中AMPKα1和AMPKα2基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高，分別增加了（1.85±0.23）倍和（1.67±0.20）倍（P＜0.01）。mTOR基因的mRNA表達(dá)水平則顯著降低，下降至（0.56±0.08）倍（P＜0.01）。同時，下游基因4E-BP1和S6K1的mRNA表達(dá)水平也明顯下降，分別為（0.62±0.09）倍和（0.58±0.07）倍（P＜0.01）。這表明慢性間歇性低氧能夠上調(diào)AMPK基因表達(dá)，下調(diào)mTOR及其下游基因的表達(dá)，從而影響AMPK-mTOR通路的正常功能。在蛋白水平，Westernblot檢測結(jié)果如圖2所示。CIH組幼鼠腦區(qū)中p-AMPK/AMPK的蛋白表達(dá)比值較NC組顯著升高，增加了（1.78±0.21）倍（P＜0.01），表明慢性間歇性低氧促進(jìn)了AMPK的磷酸化激活。而p-mTOR/mTOR的蛋白表達(dá)比值則顯著降低，下降至（0.45±0.06）倍（P＜0.01），說明mTOR的磷酸化活性受到抑制。同樣，下游蛋白p-4E-BP1/4E-BP1和p-S6K1/S6K1的表達(dá)比值也明顯降低，分別為（0.55±0.08）倍和（0.52±0.07）倍（P＜0.01），進(jìn)一步證實了慢性間歇性低氧對mTOR下游信號通路的抑制作用。慢性間歇性低氧+二甲雙胍干預(yù)組（CIH+MET組）幼鼠腦區(qū)中，AMPKα1和AMPKα2基因的mRNA表達(dá)水平較CIH組進(jìn)一步升高，分別達(dá)到（2.56±0.30）倍和（2.34±0.25）倍（P＜0.01），p-AMPK/AMPK的蛋白表達(dá)比值也顯著增加，為（2.45±0.28）倍（P＜0.01）。mTOR基因的mRNA表達(dá)水平和p-mTOR/mTOR的蛋白表達(dá)比值則進(jìn)一步降低，分別為（0.35±0.05）倍和（0.28±0.04）倍（P＜0.01）。下游基因4E-BP1和S6K1的mRNA表達(dá)水平以及p-4E-BP1/4E-BP1和p-S6K1/S6K1的蛋白表達(dá)比值也相應(yīng)下降（P＜0.01）。這說明二甲雙胍激活A(yù)MPK后，加劇了慢性間歇性低氧對mTOR通路的抑制作用。慢性間歇性低氧+雷帕霉素干預(yù)組（CIH+RAP組）幼鼠腦區(qū)中，mTOR基因的mRNA表達(dá)水平和p-mTOR/mTOR的蛋白表達(dá)比值較CIH組顯著降低，分別為（0.38±0.06）倍和（0.31±0.05）倍（P＜0.01）。而AMPKα1和AMPKα2基因的mRNA表達(dá)水平以及p-AMPK/AMPK的蛋白表達(dá)比值與CIH組相比無顯著差異（P＞0.05）。下游基因4E-BP1和S6K1的mRNA表達(dá)水平以及p-4E-BP1/4E-BP1和p-S6K1/S6K1的蛋白表達(dá)比值也明顯下降（P＜0.01）。表明雷帕霉素抑制mTOR活性后，主要影響了mTOR通路及其下游信號分子的表達(dá)，對AMPK的激活無明顯影響。綜上所述，慢性間歇性低氧可激活幼鼠腦區(qū)AMPK，抑制mTOR及其下游信號通路，二甲雙胍激活A(yù)MPK可進(jìn)一步抑制mTOR通路，雷帕霉素抑制mTOR對AMPK激活無明顯影響，三者共同作用對AMPK-mTOR通路產(chǎn)生顯著影響。注：A：蛋白條帶圖；B：p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)比值統(tǒng)計圖；C：p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)比值統(tǒng)計圖；D：p-4E-BP1/4E-BP1蛋白表達(dá)比值統(tǒng)計圖；E：p-S6K1/S6K1蛋白表達(dá)比值統(tǒng)計圖；與NC組比較，##P＜0.01；與CIH組比較，#P＜0.01五、結(jié)果討論與分析5.1慢性間歇性低氧對幼鼠學(xué)習(xí)記憶的影響行為學(xué)實驗結(jié)果顯示，慢性間歇性低氧組（CIH組）幼鼠在八臂迷宮實驗中的錯誤次數(shù)顯著高于正常對照組（NC組），這明確表明慢性間歇性低氧對幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力造成了明顯的損害。在正常生理狀態(tài)下，幼鼠能夠通過正常的神經(jīng)細(xì)胞功能和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，有效地學(xué)習(xí)和記憶八臂迷宮中食物的位置。然而，當(dāng)幼鼠暴露于慢性間歇性低氧環(huán)境時，其神經(jīng)系統(tǒng)面臨著一系列的挑戰(zhàn)。從神經(jīng)生物學(xué)角度來看，慢性間歇性低氧可能通過多種機(jī)制影響幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。首先，慢性間歇性低氧可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。在本研究中，TUNEL染色結(jié)果顯示，CIH組幼鼠腦區(qū)的神經(jīng)元凋亡指數(shù)顯著高于NC組，且凋亡程度與低氧時間相關(guān)。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，神經(jīng)元凋亡會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，破壞神經(jīng)環(huán)路的完整性，進(jìn)而影響神經(jīng)信號的傳遞和處理。在學(xué)習(xí)記憶過程中，神經(jīng)元之間通過復(fù)雜的突觸連接形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，神經(jīng)元凋亡可能會切斷這些連接，使得神經(jīng)信號無法正常傳遞，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙。其次，慢性間歇性低氧可能干擾神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和代謝。神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）等在學(xué)習(xí)記憶中起著關(guān)鍵作用。谷氨酸是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)元之間的信號傳遞和突觸可塑性的調(diào)節(jié)。慢性間歇性低氧可能影響谷氨酸的合成和釋放，導(dǎo)致神經(jīng)元之間的興奮性傳遞異常，影響學(xué)習(xí)記憶能力。GABA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其水平的改變也會影響神經(jīng)環(huán)路的平衡，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶。研究表明，慢性間歇性低氧可能導(dǎo)致GABA能神經(jīng)元功能受損，使得抑制性神經(jīng)傳遞減弱，從而影響神經(jīng)信號的正常整合和處理。此外，慢性間歇性低氧還可能影響神經(jīng)可塑性。神經(jīng)可塑性是指神經(jīng)系統(tǒng)在環(huán)境刺激下發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變的能力，包括突觸可塑性、神經(jīng)元的增殖和分化等。在學(xué)習(xí)記憶過程中，神經(jīng)可塑性起著至關(guān)重要的作用。慢性間歇性低氧可能抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，減少新生神經(jīng)元的產(chǎn)生，從而影響神經(jīng)環(huán)路的重塑和學(xué)習(xí)記憶能力的提升。慢性間歇性低氧還可能破壞突觸的結(jié)構(gòu)和功能，降低突觸的可塑性，使得神經(jīng)元之間的信息傳遞效率降低。本研究中，CIH+MET組和CIH+RAP組幼鼠的錯誤次數(shù)相較于CIH組有所降低，說明激活A(yù)MPK或抑制mTOR能夠在一定程度上改善慢性間歇性低氧導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙。這進(jìn)一步提示了AMPK-mTOR通路在慢性間歇性低氧影響幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力過程中的重要作用。激活A(yù)MPK可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，為神經(jīng)元提供充足的能量，減少神經(jīng)元凋亡，從而改善學(xué)習(xí)記憶能力。抑制mTOR則可能通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長，減少慢性間歇性低氧對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，進(jìn)而保護(hù)學(xué)習(xí)記憶功能。5.2慢性間歇性低氧對AMPK-mTOR通路的調(diào)控機(jī)制基因和蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，慢性間歇性低氧可顯著激活幼鼠腦區(qū)AMPK，抑制mTOR活性。在正常生理狀態(tài)下，幼鼠腦區(qū)細(xì)胞內(nèi)能量代謝處于平衡狀態(tài)，AMPK-mTOR通路維持著正常的調(diào)控功能。當(dāng)幼鼠暴露于慢性間歇性低氧環(huán)境時，細(xì)胞內(nèi)的能量代謝平衡被打破，這是導(dǎo)致AMPK-mTOR通路發(fā)生改變的重要原因。從能量代謝角度來看，慢性間歇性低氧導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境失衡。低氧狀態(tài)下，細(xì)胞的有氧呼吸受到抑制，ATP生成減少，而細(xì)胞代謝仍在持續(xù)進(jìn)行，導(dǎo)致ATP降解加速。為了維持細(xì)胞的能量平衡，細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑發(fā)生改變，如無氧糖酵解增強(qiáng)，乳酸合成、釋放以及氧化增加。這些變化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP或ADP/ATP比值升高，作為細(xì)胞能量感受器的AMPK被激活。在本研究中，慢性間歇性低氧組幼鼠腦區(qū)中AMPKα1和AMPKα2基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高，p-AMPK/AMPK的蛋白表達(dá)比值也明顯增加，這充分表明慢性間歇性低氧促進(jìn)了AMPK的激活。AMPK激活后，通過多種途徑對mTOR信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。一方面，AMPK可以直接磷酸化mTORC1的調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白RAPTOR，抑制mTORC1的活性。另一方面，AMPK磷酸化TSC2，增強(qiáng)TSC1/TSC2復(fù)合物的活性，抑制Rheb，間接抑制mTORC1。在本研究中，慢性間歇性低氧組幼鼠腦區(qū)mTOR基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低，p-mTOR/mTOR的蛋白表達(dá)比值也明顯下降，下游基因4E-BP1和S6K1的mRNA表達(dá)水平以及p-4E-BP1/4E-BP1和p-S6K1/S6K1的蛋白表達(dá)比值也相應(yīng)下降，這表明mTOR信號通路受到了抑制。慢性間歇性低氧對AMPK-mTOR通路的調(diào)控對細(xì)胞代謝和生長產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。在細(xì)胞代謝方面，激活的AMPK通過調(diào)節(jié)一系列代謝相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運體，促進(jìn)細(xì)胞的分解代謝，抑制合成代謝。AMPK磷酸化ACC，抑制脂肪酸合成，同時促進(jìn)脂肪酸氧化，為細(xì)胞提供更多能量。AMPK還可以調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運體，促進(jìn)葡萄糖攝取，維持細(xì)胞內(nèi)的糖代謝平衡。然而，由于mTOR信號通路的抑制，蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和增殖等過程受到阻礙。mTORC1通過磷酸化下游的S6K1和4E-BP1等，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和核糖體生物發(fā)生，當(dāng)mTORC1活性被抑制時，這些過程受到抑制，影響了細(xì)胞的正常生長和分化。這種代謝和生長狀態(tài)的失衡，可能是導(dǎo)致幼鼠腦區(qū)神經(jīng)元凋亡增加的重要原因之一。細(xì)胞生長和增殖受到抑制，無法滿足神經(jīng)細(xì)胞正常的更新和修復(fù)需求，而分解代謝的增強(qiáng)可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增加，進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞。在本研究中，慢性間歇性低氧組幼鼠腦區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)顯著升高，且凋亡程度與低氧時間相關(guān)，這與AMPK-mTOR通路的變化密切相關(guān)。5.3AMPK-mTOR通路與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系在本研究中，慢性間歇性低氧組幼鼠腦區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)顯著升高，同時AMPK-mTOR通路發(fā)生明顯改變，這表明AMPK-mTOR通路與神經(jīng)元凋亡之間存在緊密聯(lián)系。當(dāng)幼鼠腦區(qū)處于慢性間歇性低氧環(huán)境時，AMPK被激活，mTOR活性受到抑制。激活的AMPK通過多種途徑影響細(xì)胞的代謝和生存。一方面，AMPK激活后，可通過磷酸化下游底物，抑制mTORC1的活性，從而抑制蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長。這使得神經(jīng)元無法正常合成維持其生存和功能所需的蛋白質(zhì)，影響了神經(jīng)元的正常生長和修復(fù)。另一方面，AMPK的激活還可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝途徑的改變，如促進(jìn)脂肪酸氧化和糖酵解，以維持細(xì)胞的能量供應(yīng)。然而，過度的代謝改變可能會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增加，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。ROS具有強(qiáng)氧化性，能夠損傷細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。mTOR作為細(xì)胞生長和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其活性抑制會對神經(jīng)元的生存產(chǎn)生負(fù)面影響。mTORC1通過磷酸化下游的4E-BP1和S6K1等，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和核糖體生物發(fā)生，維持神經(jīng)元的正常生長和功能。當(dāng)mTORC1活性被抑制時，蛋白質(zhì)合成減少，神經(jīng)元的生長和增殖受到阻礙，無法滿足神經(jīng)細(xì)胞正常的更新和修復(fù)需求。mTOR還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬過程，自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種自我保護(hù)機(jī)制，能夠清除受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集物。mTOR活性降低會抑制自噬的啟動，使得細(xì)胞內(nèi)的有害物質(zhì)積累，進(jìn)一步損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加。在慢性間歇性低氧+二甲雙胍干預(yù)組中，二甲雙胍激活A(yù)MPK后，雖然進(jìn)一步抑制了mTOR通路，但神經(jīng)元凋亡指數(shù)卻有所降低。這可能是因為二甲雙胍激活A(yù)MPK后，除了抑制mTOR通路外，還通過其他途徑對神經(jīng)元起到了保護(hù)作用。AMPK的激活可能促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)和活性，減少了ROS的產(chǎn)生，從而減輕了氧化應(yīng)激對神經(jīng)元的損傷。AMPK還可能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，維持神經(jīng)元的正常電生理活動，減少神經(jīng)元凋亡。慢性間歇性低氧+雷帕霉素干預(yù)組中，抑制mTOR也能在一定程度上減輕慢性間歇性低氧導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡。這說明mTOR通路在慢性間歇性低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡中起關(guān)鍵作用，抑制mTOR可以阻斷其下游的一些促凋亡信號通路，從而減少神經(jīng)元凋亡。雷帕霉素抑制mTOR后，可能會調(diào)節(jié)一些與凋亡相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)，如抑制Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)元凋亡。綜上所述，慢性間歇性低氧通過激活A(yù)MPK和抑制mTOR，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加，而激活A(yù)MPK或抑制mTOR對神經(jīng)元凋亡的影響具有復(fù)雜性，涉及多種細(xì)胞內(nèi)信號通路和代謝途徑的調(diào)節(jié)。5.4研究結(jié)果的臨床意義與潛在應(yīng)用本研究結(jié)果具有重要的臨床意義，為理解相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制提供了關(guān)鍵線索。在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征等疾病中，慢性間歇性低氧是一個重要的病理特征。本研究發(fā)現(xiàn)慢性間歇性低氧可激活幼鼠腦區(qū)AMPK，抑制mTOR活性，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加和學(xué)習(xí)記憶能力下降，這為解釋此類疾病患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的機(jī)制提供了有力的實驗依據(jù)。研究表明，阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者中，有相當(dāng)比例存在認(rèn)知功能障礙，如注意力不集中、記憶力減退等，這可能與慢性間歇性低氧導(dǎo)致的AMPK-mTOR通路異常以及神經(jīng)元凋亡增加密切相關(guān)。從潛在應(yīng)用角度來看，本研究結(jié)果為臨床治療提供了新的靶點和思路。激活A(yù)MPK或抑制mTOR能夠減輕慢性間歇性低氧對幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害和神經(jīng)元凋亡，這提示在臨床治療中，可以開發(fā)針對AMPK-mTOR通路的藥物。通過激活A(yù)MPK或抑制mTOR，有望