ICS65.020.30

CCSB44

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CAAA×××—2022

馬鹿冷凍胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

Frozenembryoproductiontechnicalcodeofpracticeforwapitideer

（征求意見(jiàn)稿）

2022-××-××發(fā)布2022-××-××實(shí)施

中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布

XX/TXXXXX—XXXX

馬鹿冷凍胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了馬鹿胚胎冷凍生產(chǎn)基本要求、超數(shù)排卵、采胚、檢胚及凍前處理、胚胎冷

凍與貯存。

本文件適用于馬鹿的凍胚生產(chǎn)和胚胎遺傳資源的保存。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB/T25881牛胚胎

NY/T1900畜禽細(xì)胞與胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范

NY/T1674牛羊胚胎質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語(yǔ)定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4基本要求

4.1人員

4.1.1由鹿保定人員、操作助手、采胚人員、胚胎檢測(cè)人員組成。

4.1.2應(yīng)具有一定的專業(yè)理論基礎(chǔ)或現(xiàn)場(chǎng)工作經(jīng)驗(yàn)，無(wú)人獸共患傳染病。

4.1.3操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格消毒，戴手套，穿工作服。

4.1.4應(yīng)事先分工，操作過(guò)程須密切配合。

4.2操作室

4.2.1應(yīng)有采胚、檢胚、凍胚的功能分區(qū)。

4.2.2應(yīng)安全、通風(fēng)、保溫和衛(wèi)生，設(shè)照明、電源插座和操作臺(tái)，面積15m2～25m2為宜。

4.2.3墻壁、地面應(yīng)采用便于消毒、防水的材質(zhì)。

4.2.4操作前應(yīng)采用無(wú)刺激性氣味的消毒液和紫外線燈進(jìn)行消毒殺菌。

4.3藥品器械

4.3.1操作前應(yīng)備齊藥品與器械，具體參見(jiàn)附錄A。

4.3.2接觸胚胎的器皿應(yīng)清潔衛(wèi)生。

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4.3.3消毒后的器械應(yīng)用鋁箔紙或封口紙封好備用。

4.4供體鹿

4.4.1健康無(wú)傳染性疾病。

4.4.2無(wú)繁殖性疾病。

4.4.3生殖器官、機(jī)能正常。

4.4.4體況良好，中上等體況。

4.4.5經(jīng)產(chǎn)、產(chǎn)后120天以上的母鹿。

5超數(shù)排卵

5.1宜9月份～12月份。

5.2超數(shù)排卵前應(yīng)補(bǔ)飼20天以上，主要補(bǔ)飼VA、VD、VE、Se、Zn等維生素和微量元素。

5.3程序

5.3.1宜采用CIDR+FSH方案，具體程序參見(jiàn)附錄B。

5.3.2埋栓和取栓。埋置陰道栓CIDR（孕酮含量500mg），埋置當(dāng)天記為第0天，第9天

開(kāi)始注射促卵泡素（FSH），每天早晚各注射1次，間隔12小時(shí)，4天8次等量或減量注射，

共注射FSH640mg，第7次注射FSH時(shí)取栓。

5.3.3人工輸精。取栓后50小時(shí)、58小時(shí)進(jìn)行兩次定時(shí)輸精?；蚪Y(jié)合試情方法進(jìn)行，母

鹿從接受試情公鹿爬跨到拒絕爬跨行為變的較安穩(wěn)時(shí)進(jìn)行第1次輸精，間隔6小時(shí)~8小時(shí)

進(jìn)行第2次輸精。

6采胚

6.1應(yīng)在人工輸精后6天～7天采集胚胎。

6.2采胚前應(yīng)檢查沖卵管氣囊是否漏氣，沖胚液預(yù)熱到35℃~37℃。

6.3對(duì)采胚鹿麻醉保定后運(yùn)回采胚室，放于保定架上，呈前高后低的仰臥姿勢(shì)。

6.4宜采用非手術(shù)法進(jìn)行胚胎采集。

6.4.1掏出直腸糞便，用溫水清洗陰部及外陰，75%酒精消毒，生理鹽水沖洗，最后用滅

菌的棉巾擦拭干凈。

6.4.2把握直腸用子宮頸擴(kuò)張棒擴(kuò)張子宮頸，插入粘液吸除器至宮頸處吸取粘液，反復(fù)操

作2次~3次將粘液吸凈。

6.4.3將帶有內(nèi)芯的沖胚管經(jīng)過(guò)子宮頸輕輕地插入一側(cè)子宮角大彎處，抽出約4cm內(nèi)芯，

再把沖胚管往子宮角前端推進(jìn)，當(dāng)內(nèi)芯再次抵達(dá)子宮角彎曲處時(shí)，再向外抽出內(nèi)芯4cm~8

cm，直到?jīng)_胚管到達(dá)子宮角前端小彎基部為止。

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6.4.4用20mL注射器由助手給氣囊充氣，先充一定量氣，待確定氣囊位置后，再根據(jù)母

鹿子宮大小和沖胚管的深度確定充氣量，一般充氣8mL~10mL，固定沖胚管，抽出內(nèi)芯，

連接三通管。

6.4.5將預(yù)熱到35℃~37℃采胚液吊瓶掛在距母鹿外陰部1.0m高處，接通三通管、采

胚管及集卵杯。根據(jù)子宮角的膨脹程度確定采胚液的注入量，一般每次注入30mL~50mL

采胚液，視液體回流情況，反復(fù)多次沖灌，每側(cè)子宮角用液量300mL~500mL。

6.4.6沖完一側(cè)子宮角后將內(nèi)芯再插入采胚管并放氣，固定內(nèi)芯，把采胚管退到子宮體，

轉(zhuǎn)向插入另一側(cè)子宮角，重復(fù)7.4.5條款的操作。

6.4.7兩側(cè)子宮角胚胎采集完畢，將集卵杯快速送至檢胚室，將氣囊空氣放出，沖卵管抽

至子宮體。向子宮體灌注抗生素，一般青霉素80萬(wàn)IU、鏈霉素100萬(wàn)IU，肌注PG0.4mg。

7檢胚及凍前處理

7.1檢前處理

檢胚前濾去多余的回收液，將過(guò)濾杯中留下的20mL~30mL回收液倒入平皿，再用少

量沖卵液沖洗過(guò)濾杯2次~3次，一并倒入平皿待檢。

7.2鏡檢

7.2.1將回收沖胚液的平皿在10倍~20倍體視顯微鏡下，從上到下、從左到右或從外到內(nèi)

Z字形移動(dòng)，用吸胚管將找到的胚胎移入培養(yǎng)皿中的保存液小滴中。

7.2.2再將同一供體母鹿的胚胎從液滴中全部吸出移到新液滴，反復(fù)洗滌胚胎3次~5次。

7.2.3將體視鏡放大至50倍以上，進(jìn)行胚胎質(zhì)量鑒定和分級(jí)。

7.3胚胎等級(jí)鑒定

7.3.1胚胎發(fā)育階段分類參見(jiàn)附錄C或NY/T1674。

7.3.2胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)參見(jiàn)附錄D或GB/T25881。

7.3.3胚胎等級(jí)達(dá)到A級(jí)、B級(jí)的可用于冷凍。

7.4胚胎洗滌

用于冷凍的胚胎應(yīng)用保存液洗滌5次，每次洗滌不少于200uL，每組清洗胚胎數(shù)不能

超過(guò)10枚，每次清洗應(yīng)更換吸管，每次清洗胚胎帶入平皿中的液體量不能超過(guò)1%。

8胚胎冷凍

8.1乙二醇冷凍法

8.1.1平衡。將胚胎放入1.5mol/L或1.8mol/L乙二醇冷凍保護(hù)液中，平衡10min。

8.1.2裝管。平衡后應(yīng)迅速將胚胎裝入0.25mL細(xì)管，每支細(xì)管以裝1枚胚胎為宜，裝管

順序應(yīng)按乙二醇液、氣泡、含有胚胎的乙二醇液、氣泡、乙二醇液進(jìn)行，裝管后，用標(biāo)簽塞

插入封口端進(jìn)行封口。

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8.1.3標(biāo)記。細(xì)管應(yīng)進(jìn)行明確的標(biāo)記，注明生產(chǎn)單位、生產(chǎn)時(shí)間、品種、供體鹿號(hào)、發(fā)育

階段、等級(jí)、質(zhì)量級(jí)別、數(shù)量等。

8.1.4植冰。將冷凍儀的程序調(diào)到“0”程序時(shí)，等溫度達(dá)到-6℃或~7℃時(shí)將胚胎放入冷

凍儀平衡5min后，用經(jīng)過(guò)液氮冷卻后的鑷子夾住遠(yuǎn)離胚胎端的細(xì)管封口端植冰。

8.1.5程序冷凍。植冰后，平衡10min，以0.3℃/min~0.5℃/min速率進(jìn)行降溫，達(dá)到

-32℃~-35℃時(shí)，平衡10min，把細(xì)管投入液氮中。

8.2甘油冷凍法

應(yīng)按NY/T1900的附錄操作進(jìn)行。

9貯存

細(xì)管無(wú)破損，標(biāo)記清晰、完整、準(zhǔn)確后貯存，并進(jìn)行記錄（見(jiàn)附錄E）。

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附錄A

（資料性）

冷凍胚胎生產(chǎn)常用器材藥品表

A.1冷凍胚胎生產(chǎn)常用器材藥品表

冷凍胚胎生產(chǎn)常用器材藥品見(jiàn)表A.1。

A.1冷凍胚胎生產(chǎn)常用器材藥品表

項(xiàng)目序號(hào)器材藥品

1CIDRFSH

2埋栓器PMSG

3吹管/吹彈促排3號(hào)

4輸精槍麻醉、蘇醒藥

超數(shù)排卵

5工作服、乳膠手套75%酒精

6紫外線消毒燈0.9%生理鹽水

7恒溫水浴鍋

8注射器

9保定架Holding胚胎保護(hù)液

10子宮頸擴(kuò)張棒PG氯前列烯醇

11子宮頸粘液吸除器抗生素

沖胚

12沖卵管

13集卵杯

14過(guò)濾器

15體視顯微鏡

16培養(yǎng)皿

檢胚

17吸胚管

18移液器

19胚胎冷凍儀1.5mol/L或1.8mol/L乙二醇冷凍保護(hù)液（自配）

20液氮罐1.4mol/L（10%）甘油冷凍保護(hù)液（自配）

210.25mL細(xì)管

胚胎冷凍

22細(xì)管棉塞

23指拇管

24油性號(hào)筆

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附錄B

（資料性）

超數(shù)排卵用藥程序

B.1超數(shù)排卵用藥程序

超數(shù)排卵用藥程序見(jiàn)表B.1。

B.1超數(shù)排卵用藥程序表

項(xiàng)目埋栓、取栓輸精

第0天....第9天第10天第11天第12天

時(shí)間取栓后

公鹿試情輸

精或50小時(shí)、

58小時(shí)各輸

埋栓第7次注射FSH時(shí)取栓

精1次

早：80IU早：80IU早：80IU早：80IU

等量法

晚：80IU晚：80IU晚：80IU晚：80IU

處理注射FSH

早：100IU早：90IU早：70IU早：60IU

遞減法

晚：100IU晚：90IU晚：70IU晚：60IU

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附錄C

（資料性）

胚胎發(fā)育階段分類

C.1胚胎發(fā)育階段分類

胚胎發(fā)育階段分類見(jiàn)表C.1。

表C.1胚胎發(fā)育階段分類表

胚胎發(fā)育階段形態(tài)特征

含有16個(gè)細(xì)胞以上，卵裂球緊界限清晰，沒(méi)有形成致密細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)占據(jù)透明帶

早期桑椹胚/EB

內(nèi)的50%~60%空間。

卵裂球進(jìn)一步分裂變小，緊縮為團(tuán)塊狀，看不清卵裂球界限，細(xì)胞團(tuán)占據(jù)透明帶內(nèi)的

致密桑椹胚/CM

60%~70%空間。

早期囊胚/EM細(xì)胞團(tuán)中出現(xiàn)散在的囊腔，細(xì)胞團(tuán)占據(jù)透明帶內(nèi)的70%~80%空間。

已經(jīng)分化的滋養(yǎng)層和內(nèi)部致密的、顏色發(fā)暗的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和囊胚腔明顯是主要特征。滋

囊胚/BL

養(yǎng)層與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)比較容易區(qū)別。此時(shí)的胚胎細(xì)胞充滿整個(gè)透明帶內(nèi)。

整個(gè)胚胎直徑增大，囊胚腔充分?jǐn)U張，與透明帶之間無(wú)間隙，透明帶變薄，大約是原

擴(kuò)張囊胚/EXB

來(lái)厚度的1/3。

孵化囊胚/HB正處于孵化階段的胚胎透明帶破裂或胚胎細(xì)胞團(tuán)正在脫出或者已脫離透明帶。

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附錄D

（資料性）

胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)

D.1胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)

胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)見(jiàn)表D.1。

表D.1胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)

等級(jí)特征

胚胎發(fā)育階段與胚齡一致，透明帶光滑無(wú)缺陷，胚胎細(xì)胞團(tuán)形態(tài)完整，輪廓清晰，卵

A級(jí)裂球大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊、色澤和透明度適中，無(wú)游離細(xì)胞或很少，變性細(xì)胞比例少

于10%。

胚胎發(fā)育階段與胚齡基本一致，輪廓清晰，胚胎細(xì)胞團(tuán)形態(tài)較完整，卵裂球大小基本

B級(jí)

一致，色澤和細(xì)胞透明度良好，變性及游離細(xì)胞約占10%~30%。

胚胎發(fā)育階段與胚齡不太一致，且胚胎細(xì)胞團(tuán)輪廓不清，色澤和透明度變暗，卵裂球

C級(jí)

較松散，游離，變性及游離細(xì)胞約占30%~50%。

D級(jí)未受精卵，或發(fā)育停滯變性、卵裂球不規(guī)則、少而散。

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附錄E

（資料性）

冷凍胚胎生產(chǎn)記錄

E.1冷凍胚胎生產(chǎn)記錄表

冷凍胚胎生產(chǎn)記錄見(jiàn)表E.1。

表E.1冷凍胚胎生產(chǎn)記錄表

品種制作地點(diǎn)日期

供體號(hào)母畜：公畜：

超排情況黃體數(shù)——左側(cè)：右側(cè)：卵泡數(shù)——左側(cè)：右側(cè)：其他：

可用胚胎數(shù)不可用胚胎數(shù)

未受精

2-8退

總數(shù)等級(jí)EMMCMEBBLEXB總數(shù)

細(xì)胞化

鮮胚數(shù)及A

質(zhì)量評(píng)定

B

C

D

合計(jì)

細(xì)管號(hào)數(shù)量階段級(jí)別小筒號(hào)提漏號(hào)儲(chǔ)存罐號(hào)備注

______________________________

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前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草

規(guī)則》的規(guī)定起草。

請(qǐng)注意本文件中的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì)提出并歸口。

本文件起草單位：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)、哈爾濱工業(yè)大學(xué)、哈爾濱博蒙生物科技有限公

司、黑龍江普惠特產(chǎn)有限公司、黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院哈爾濱特產(chǎn)研究所、新疆畜牧科學(xué)院畜

牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所、黑

河市吉駿鹿業(yè)有限公司、烏魯木齊綠洲綠島牲畜養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社。

本文件主要起草人：韓歡勝、趙列平、趙曉靜、許艷麗、孫東波、道楞、庫(kù)爾班·吐拉

克、馬強(qiáng)、郭喜明、王雪、王敏、孫義樂(lè)、許紅喜、鄭家三、張愛(ài)忠、史文清、柴孟龍、徐

馨、黃翠、肖洪梅、韓志強(qiáng)、李寧、韓彥、張震、曲鳳玲、孟慶超、白偉忠、李勇、宋吉駿。

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馬鹿冷凍胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了馬鹿胚胎冷凍生產(chǎn)基本要求、超數(shù)排卵、采胚、檢胚及凍前處理、胚胎冷

凍與貯存。

本文件適用于馬鹿的凍胚生產(chǎn)和胚胎遺傳資源的保存。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB/T25881牛胚胎

NY/T1900畜禽細(xì)胞與胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范

NY/T1674牛羊胚胎質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語(yǔ)定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4基本要求

4.1人員

4.1.1由鹿保定人員、操作助手、采胚人員、胚胎檢測(cè)人員組成。

4.1.2應(yīng)具有一定的專業(yè)理論基礎(chǔ)或現(xiàn)場(chǎng)工作經(jīng)驗(yàn)，無(wú)人獸共患傳染病。

4.1.3操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格消毒，戴手套，穿工作服。

4.1.4應(yīng)事先分工，操作過(guò)程須密切配合。

4.2操作室

4.2.1應(yīng)有采胚、檢胚、凍胚的功能分區(qū)。

4.2.2應(yīng)安全、通風(fēng)、保溫和衛(wèi)生，設(shè)照明、電源插座和操作臺(tái)，面積15m2～25m2為宜。

4.2.3墻壁、地面應(yīng)采用便于消毒、防水的材質(zhì)。

4.2.4操作前應(yīng)采用無(wú)刺激性氣味的消毒液和紫外線燈進(jìn)行消毒殺菌。

4.3藥品器械

4.3.1操作前應(yīng)備齊藥品與器械，具體參見(jiàn)附錄A。

4.3.2接觸胚胎的器皿應(yīng)清潔衛(wèi)生。

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4.3.3消毒后的器械應(yīng)用鋁箔紙或封口紙封好備用。

4.4供體鹿

4.4.1健康無(wú)傳染性疾病。

4.4.2無(wú)繁殖性疾病。

4.4.3生殖器官、機(jī)能正常。

4.4.4體況良好，中上等體況。

4.4.5經(jīng)產(chǎn)、產(chǎn)后120天以上的母鹿。

5超數(shù)排卵

5.1宜9月份～12月份。

5.2超數(shù)排卵前應(yīng)補(bǔ)飼20天以上，主要補(bǔ)飼VA、VD、VE、Se、Zn等維生素和微量元素。

5.3程序

5.3.1宜采用CIDR+FSH方案，具體程序參見(jiàn)附錄B。

5.3.2埋栓和取栓。埋置陰道栓CIDR（孕酮含量500mg），埋置當(dāng)天記為第0天，第9天

開(kāi)始注射促卵泡素（FSH），每天早晚各注射1次，間隔12小時(shí)，4天8次等量或減量注射，

共注射FSH640mg，第7次注射FSH時(shí)取栓。

5.3.3人工輸精。取栓后50小時(shí)、58小時(shí)進(jìn)行兩次定時(shí)輸精?；蚪Y(jié)合試情方法進(jìn)行，母

鹿從接受試情公鹿爬跨到拒絕爬跨行為變的較安穩(wěn)時(shí)進(jìn)行第1次輸精，間隔6小時(shí)~8小時(shí)

進(jìn)行第2次輸精。

6采胚

6.1應(yīng)在人工輸精后6天～7天采集胚胎。

6.2采胚前應(yīng)檢查沖卵管氣囊是否漏氣，沖胚液預(yù)熱到35℃~37℃。

6.3對(duì)采胚鹿麻醉保定后運(yùn)回采胚室，放于保定架上，呈前高后低的仰臥姿勢(shì)。

6.4宜采用非手術(shù)法進(jìn)行胚胎采集。

6.4.1掏出直腸糞便，用溫水清洗陰部及外陰，75%酒精消毒，生理鹽水沖洗，最后用滅

菌的棉巾擦拭干凈。

6.4.2把握直腸用子宮頸擴(kuò)張棒擴(kuò)張子宮頸，插入粘液吸除器至宮頸處吸取粘液，反復(fù)操

作2次~3次將粘液吸凈。