合成生物基因編輯效率評(píng)估師崗位招聘考試試卷及答案一、填空題（每空1分，共10分）1.CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，引導(dǎo)Cas9蛋白切割靶DNA的關(guān)鍵元件是______。2.檢測(cè)DNA雙鏈錯(cuò)配的常用核酸酶是______（或T7E1）。3.基因編輯中，通過同源供體修復(fù)實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)編輯的途徑是______。4.評(píng)估基因編輯脫靶效應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之一是______。5.熒光報(bào)告系統(tǒng)中，若靶位點(diǎn)編輯后導(dǎo)致熒光蛋白移碼突變，可通過______變化反映編輯效率。6.計(jì)算基因編輯效率時(shí)，通常以NGS測(cè)序中______占總有效reads的比例表示。7.鋅指核酸酶（ZFN）和TALEN均通過______結(jié)構(gòu)域識(shí)別靶DNA序列。8.常用于體內(nèi)基因編輯的病毒載體是______（或慢病毒）。9.影響sgRNA活性的核心因素是其與靶DNA的______及二級(jí)結(jié)構(gòu)。10.基因編輯效率評(píng)估中，需提取細(xì)胞的______作為檢測(cè)模板。答案：1.sgRNA；2.Surveyor；3.HDR（同源定向修復(fù)）；4.GUIDE-seq；5.熒光強(qiáng)度；6.編輯reads；7.特異性DNA結(jié)合；8.AAV（腺相關(guān)病毒）；9.互補(bǔ)性；10.基因組DNA二、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共20分）1.以下哪種方法可同時(shí)檢測(cè)編輯效率和脫靶位點(diǎn)？A.SurveyorassayB.T7E1assayC.NGSD.熒光報(bào)告系統(tǒng)答案：C2.CRISPR/Cas9編輯中，NHEJ途徑的主要產(chǎn)物是：A.精準(zhǔn)插入B.缺失/插入（indel）C.同源重組D.基因敲入答案：B3.提升HDR效率的常用策略不包括：A.加入ssODN供體B.抑制NHEJ途徑C.延長(zhǎng)sgRNA長(zhǎng)度D.細(xì)胞周期同步化答案：C4.以下哪種載體更適合瞬時(shí)基因編輯？A.質(zhì)粒B.AAVC.慢病毒D.腺病毒答案：A5.sgRNA設(shè)計(jì)時(shí)，PAM序列通常位于靶序列的：A.5’端B.3’端C.中間D.任意位置答案：B6.檢測(cè)脫靶效應(yīng)時(shí)，Digenome-seq的原理是：A.識(shí)別錯(cuò)配DNAB.捕獲整合的標(biāo)簽DNAC.全基因組測(cè)序分析D.熒光標(biāo)記答案：C7.基因編輯效率評(píng)估中，以下哪種樣本可直接檢測(cè)蛋白水平變化？A.基因組DNAB.RNAC.細(xì)胞裂解液D.培養(yǎng)基答案：C8.TALEN與CRISPR/Cas9相比，優(yōu)勢(shì)在于：A.設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單B.特異性更高C.效率更高D.成本更低答案：B9.細(xì)胞周期中，HDR效率最高的時(shí)期是：A.G1期B.S期C.G2/M期D.G0期答案：C10.以下哪種情況會(huì)降低基因編輯效率？A.高GC含量的sgRNAB.sgRNA無二級(jí)結(jié)構(gòu)C.靶位點(diǎn)位于基因編碼區(qū)D.脫靶位點(diǎn)多答案：A三、多項(xiàng)選擇題（每題2分，共20分，多選或少選均不得分）1.基因編輯效率評(píng)估的核心指標(biāo)包括：A.編輯效率B.特異性C.穩(wěn)定性D.遺傳毒性答案：ABCD2.常用的脫靶檢測(cè)技術(shù)有：A.GUIDE-seqB.Digenome-seqC.CIRCLE-seqD.ChIP-seq答案：ABC3.提升HDR效率的策略包括：A.使用Cas9nickaseB.加入RAD51抑制劑C.細(xì)胞周期同步于S/G2期D.增加供體DNA濃度答案：ACD4.基因編輯載體的類型包括：A.病毒載體（AAV、慢病毒）B.非病毒載體（質(zhì)粒、脂質(zhì)體）C.病毒樣顆粒D.人工染色體答案：ABCD5.影響sgRNA活性的因素有：A.GC含量（40%-60%為宜）B.靶位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)C.PAM序列類型D.sgRNA長(zhǎng)度（18-22nt）答案：ABCD6.基因編輯效率的檢測(cè)方法包括：A.SurveyorassayB.T7E1assayC.NGSD.熒光報(bào)告系統(tǒng)答案：ABCD7.基因編輯后需評(píng)估的細(xì)胞表型指標(biāo)有：A.蛋白表達(dá)水平B.細(xì)胞生長(zhǎng)速率C.熒光強(qiáng)度D.細(xì)胞存活率答案：ABCD8.CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成元件包括：A.Cas9蛋白B.sgRNAC.PAM序列D.供體DNA（HDR時(shí)）答案：ABCD9.脫靶效應(yīng)的潛在后果包括：A.基因組不穩(wěn)定B.細(xì)胞毒性C.表型異常D.遺傳變異傳遞答案：ABCD10.基因編輯效率評(píng)估的樣本類型包括：A.基因組DNAB.RNAC.蛋白D.細(xì)胞答案：ABCD四、判斷題（每題2分，共20分，正確打√，錯(cuò)誤打×）1.Surveyor酶可特異性切割錯(cuò)配的DNA雙鏈。√2.HDR效率通常高于NHEJ效率。×3.sgRNA的最佳長(zhǎng)度為20nt左右。√4.GUIDE-seq是檢測(cè)脫靶的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之一。√5.AAV載體僅可用于體內(nèi)基因編輯?！?.NGS可同時(shí)定量編輯效率和檢測(cè)脫靶位點(diǎn)。√7.啟動(dòng)子強(qiáng)度不影響Cas9蛋白的表達(dá)量及編輯效率?！?.TALEN的特異性比CRISPR/Cas9高?！?.細(xì)胞周期G2/M期HDR效率更高。√10.脫靶效應(yīng)僅由sgRNA與基因組的同源性導(dǎo)致。×五、簡(jiǎn)答題（每題5分，共20分）1.簡(jiǎn)述CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效率的常用檢測(cè)方法及原理。答案：常用方法包括：①Surveyor/T7E1assay：利用核酸酶識(shí)別并切割錯(cuò)配DNA雙鏈，電泳后通過條帶強(qiáng)度計(jì)算編輯效率；②熒光報(bào)告系統(tǒng)：如EGFP移碼報(bào)告，編輯后移碼突變導(dǎo)致熒光消失，通過熒光強(qiáng)度變化定量；③NGS：對(duì)靶區(qū)域測(cè)序，統(tǒng)計(jì)編輯reads（indel/HDR）占總reads比例，可同時(shí)檢測(cè)脫靶；④qPCR：針對(duì)編輯位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，通過Ct值變化反映編輯后序列改變。2.如何提升基因編輯中HDR的效率？答案：提升策略包括：①使用ssODN作為供體（比dsDNA更易整合）；②抑制NHEJ途徑（如加入NU7441等抑制劑）；③細(xì)胞周期同步化（將細(xì)胞阻滯于S/G2期，HDR依賴同源重組，此時(shí)同源臂更易結(jié)合）；④使用Cas9nickase（僅切割單鏈，減少NHEJ競(jìng)爭(zhēng)）；⑤優(yōu)化供體DNA濃度（過高易導(dǎo)致毒性，過低效率低）；⑥添加RAD51輔助因子（促進(jìn)同源重組）。3.基因編輯效率評(píng)估中需考慮哪些關(guān)鍵指標(biāo)？答案：關(guān)鍵指標(biāo)包括：①編輯效率：靶位點(diǎn)發(fā)生編輯的細(xì)胞比例（如NGS檢測(cè)的編輯reads占比）；②特異性：脫靶位點(diǎn)數(shù)量及比例（避免非靶位點(diǎn)編輯）；③穩(wěn)定性：編輯后細(xì)胞傳代過程中編輯狀態(tài)的保持情況；④遺傳毒性：編輯后細(xì)胞的存活率、基因組穩(wěn)定性（如染色體異常）；⑤表型一致性：編輯后細(xì)胞的功能表型是否符合預(yù)期（如蛋白表達(dá)、代謝活性）。4.脫靶效應(yīng)的檢測(cè)方法有哪些？各有何特點(diǎn)？答案：常用方法：①GUIDE-seq：捕獲整合的標(biāo)簽DNA，靈敏度高，可檢測(cè)低豐度脫靶；②Digenome-seq：全基因組測(cè)序分析，覆蓋廣，可發(fā)現(xiàn)新脫靶位點(diǎn)；③CIRCLE-seq：體外篩選，快速高效，適合預(yù)實(shí)驗(yàn)；④ChIP-seq：檢測(cè)Cas9結(jié)合位點(diǎn)，反映潛在脫靶；⑤Surveyor/T7E1：簡(jiǎn)單快速，但僅能檢測(cè)已知位點(diǎn)的脫靶。六、討論題（每題5分，共10分）1.如何平衡基因編輯效率與特異性？請(qǐng)結(jié)合實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景說明。答案：平衡需分場(chǎng)景：①臨床治療（如CAR-T）：優(yōu)先特異性，可通過優(yōu)化sgRNA設(shè)計(jì)（避免同源序列）、使用高保真Cas9（如SpCas9-HF1）、降低Cas9/sgRNA濃度，減少脫靶風(fēng)險(xiǎn)；②工業(yè)菌株構(gòu)建（如生產(chǎn)代謝物）：可適當(dāng)提升效率，通過短時(shí)間高表達(dá)Cas9、使用高效載體（如慢病毒），同時(shí)結(jié)合NGS檢測(cè)脫靶，確保菌株穩(wěn)定性；③基礎(chǔ)研究：可根據(jù)需求調(diào)整，如篩選突變體時(shí)優(yōu)先效率，驗(yàn)證功能時(shí)兼顧特異性。核心是根據(jù)應(yīng)用場(chǎng)景的風(fēng)險(xiǎn)耐受度，選擇合適的編輯工具和條件。2.合成生物中，基因編輯效率評(píng)估在工業(yè)菌株構(gòu)建中的重要性是什么？答案：重要性體現(xiàn)在：①菌株性能：高效編輯可快速獲得高產(chǎn)突變體，減少篩選成本；