2025年pcr上崗考試題及答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共30分）1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的基本原理模仿的是以下哪種生物學(xué)過程？A.DNA損傷修復(fù)B.基因轉(zhuǎn)錄C.DNA半保留復(fù)制D.蛋白質(zhì)翻譯答案：C2.設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，若目標(biāo)基因GC含量為65%，引物的Tm值宜控制在？A.50-55℃B.55-60℃C.60-65℃D.65-70℃答案：C（引物Tm值通常比模板GC含量低5-10℃，且需保證引物與模板特異性結(jié)合）3.TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度是？A.55℃B.72℃C.95℃D.60℃答案：B（Taq酶在72℃時(shí)活性最高，此時(shí)延伸效率最佳）4.熒光定量PCR擴(kuò)增曲線的“指數(shù)期”對(duì)應(yīng)的是？A.熒光信號(hào)剛超過基線的階段B.熒光信號(hào)與模板濃度呈對(duì)數(shù)關(guān)系的階段C.酶活性開始下降的階段D.產(chǎn)物積累達(dá)到平臺(tái)的階段答案：B（指數(shù)期是PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長(zhǎng)的時(shí)期，此時(shí)熒光信號(hào)與初始模板量線性相關(guān)）5.以下哪項(xiàng)是PCR實(shí)驗(yàn)室最主要的物理污染防控措施？A.使用高壓滅菌鍋處理廢棄物B.設(shè)置獨(dú)立的試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)C.定期更換實(shí)驗(yàn)服D.采用紫外燈照射工作臺(tái)答案：B（分區(qū)操作是防止不同階段產(chǎn)物交叉污染的核心措施）6.內(nèi)參基因在PCR檢測(cè)中的主要作用是？A.提高目標(biāo)基因擴(kuò)增效率B.校正樣本處理及擴(kuò)增過程中的誤差C.增加熒光信號(hào)強(qiáng)度D.驗(yàn)證引物特異性答案：B（內(nèi)參基因用于評(píng)估樣本質(zhì)量和反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，減少實(shí)驗(yàn)誤差）7.熔解曲線分析中，若出現(xiàn)兩個(gè)峰值，最可能的原因是？A.引物二聚體形成B.模板濃度過高C.退火溫度過低D.探針標(biāo)記錯(cuò)誤答案：A（引物二聚體與目標(biāo)產(chǎn)物的Tm值不同，會(huì)導(dǎo)致熔解曲線出現(xiàn)雙峰）8.PCR反應(yīng)中模板變性的典型溫度和時(shí)間是？A.95℃30秒B.72℃1分鐘C.55℃30秒D.60℃1分鐘答案：A（雙鏈DNA在95℃下30秒可充分解鏈為單鏈）9.以下哪種熒光探針依賴于Taq酶的5'→3'外切酶活性？A.SYBRGreenIB.TaqMan探針C.分子信標(biāo)D.熒光引物答案：B（TaqMan探針在擴(kuò)增時(shí)被Taq酶切割，釋放熒光基團(tuán)）10.臨床PCR檢測(cè)中，若陽性對(duì)照Ct值明顯高于預(yù)期，最可能的原因是？A.引物濃度過高B.陽性對(duì)照模板降解C.退火溫度過低D.擴(kuò)增循環(huán)數(shù)不足答案：B（模板降解會(huì)導(dǎo)致有效模板量減少，Ct值升高）11.進(jìn)行RNA的RT-PCR時(shí)，需特別注意避免以下哪種酶的干擾？A.DNA酶B.蛋白酶C.RNA酶D.連接酶答案：C（RNA酶廣泛存在且穩(wěn)定，易導(dǎo)致RNA模板降解）12.以下哪種情況不屬于PCR實(shí)驗(yàn)室生物安全范疇？A.樣本中含傳染性病原體B.擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染C.試劑泄漏后的化學(xué)處理D.實(shí)驗(yàn)人員未佩戴手套答案：C（化學(xué)處理屬于實(shí)驗(yàn)室安全，但非生物安全核心）13.定量PCR中“基線”的設(shè)定通常是？A.前1-3個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)均值B.指數(shù)期起始點(diǎn)的熒光信號(hào)C.平臺(tái)期前的熒光信號(hào)均值D.前15-20個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)均值答案：D（基線一般取擴(kuò)增早期未進(jìn)入指數(shù)期的熒光信號(hào)均值，通常為前15-20個(gè)循環(huán)）14.引物設(shè)計(jì)時(shí)，避免3'端互補(bǔ)的主要目的是？A.減少引物二聚體形成B.提高Tm值C.增加與模板的結(jié)合力D.降低GC含量答案：A（3'端互補(bǔ)易導(dǎo)致引物相互結(jié)合形成二聚體）15.判定PCR結(jié)果為“陰性”時(shí)，需同時(shí)滿足？A.無擴(kuò)增曲線且陰性對(duì)照無信號(hào)B.擴(kuò)增曲線Ct值>35且內(nèi)參Ct值正常C.擴(kuò)增曲線呈S型且Ct值<30D.熔解曲線單峰且陽性對(duì)照Ct值正常答案：B（臨床檢測(cè)中通常設(shè)定Ct值>35為陰性，同時(shí)需內(nèi)參正常以排除樣本質(zhì)量問題）二、多項(xiàng)選擇題（每題3分，共30分，至少2個(gè)正確選項(xiàng)）1.PCR反應(yīng)體系的基本組成包括？A.模板DNAB.引物C.dNTPD.TaqDNA聚合酶E.熒光染料答案：ABCD（熒光染料為定量PCR額外添加，非基本體系必需）2.引物設(shè)計(jì)的基本原則包括？A.長(zhǎng)度18-25bpB.GC含量40-60%C.3'端避免連續(xù)G/CD.引物間避免互補(bǔ)E.必須包含限制性酶切位點(diǎn)答案：ABCD（限制性酶切位點(diǎn)非必需，僅克隆實(shí)驗(yàn)需要）3.PCR實(shí)驗(yàn)室可能的污染來源有？A.擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠B.樣本間交叉污染C.試劑中殘留的DNAD.實(shí)驗(yàn)人員體表攜帶的DNAE.實(shí)驗(yàn)室空調(diào)系統(tǒng)氣流答案：ABCDE（所有可能導(dǎo)致外源DNA進(jìn)入反應(yīng)體系的途徑均為污染來源）4.熒光定量PCR的質(zhì)量控制指標(biāo)包括？A.陽性對(duì)照Ct值范圍B.陰性對(duì)照無擴(kuò)增C.標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（-3.1~-3.6）D.內(nèi)參基因Ct值變異系數(shù)E.擴(kuò)增效率（90%-110%）答案：ABCDE（以上均為評(píng)估實(shí)驗(yàn)可靠性的關(guān)鍵指標(biāo)）5.以下哪些情況會(huì)導(dǎo)致PCR產(chǎn)物電泳條帶弱或無條帶？A.模板濃度過低B.引物退火溫度過高C.Taq酶失活D.dNTP濃度過高E.循環(huán)數(shù)不足答案：ABCE（dNTP濃度過高可能抑制反應(yīng)，但通常不會(huì)導(dǎo)致條帶完全消失）6.熒光定量PCR可應(yīng)用于？A.病原體載量檢測(cè)B.基因表達(dá)差異分析C.基因突變檢測(cè)D.蛋白質(zhì)濃度測(cè)定E.染色體核型分析答案：ABC（定量PCR用于核酸檢測(cè)，無法直接檢測(cè)蛋白質(zhì)或染色體形態(tài)）7.提取RNA作為PCR模板時(shí)，需采取的措施有？A.使用DEPC水處理實(shí)驗(yàn)器材B.在冰上操作C.添加RNA酶抑制劑D.延長(zhǎng)變性時(shí)間至5分鐘E.用75%乙醇洗滌沉淀答案：ABCE（RNA提取需嚴(yán)格抑制RNA酶，變性時(shí)間通常為1-2分鐘，過長(zhǎng)可能導(dǎo)致降解）8.PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)應(yīng)滿足？A.試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴(kuò)增區(qū)單向流動(dòng)B.各區(qū)物品嚴(yán)格專用C.樣本處理區(qū)需生物安全柜D.擴(kuò)增區(qū)可使用紫外燈消毒E.各區(qū)壓力梯度為正壓→常壓→負(fù)壓答案：ABCD（壓力梯度通常為試劑準(zhǔn)備區(qū)正壓，樣本處理區(qū)常壓，擴(kuò)增區(qū)負(fù)壓，防止氣溶膠擴(kuò)散）9.TaqMan探針的特點(diǎn)包括？A.5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)B.3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)C.與模板完全互補(bǔ)D.擴(kuò)增時(shí)被引物替代E.熒光信號(hào)隨擴(kuò)增循環(huán)遞增答案：ABCE（TaqMan探針與模板特異性結(jié)合，擴(kuò)增時(shí)被Taq酶切割，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)累積）10.PCR擴(kuò)增失敗的可能原因有？A.模板中含有PCR抑制物（如血紅蛋白）B.引物與模板錯(cuò)配C.Mg2+濃度過低D.熱循環(huán)儀溫度不準(zhǔn)確E.反應(yīng)體積過大答案：ABCDE（以上均可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低或完全失?。┤⑴袛囝}（每題1分，共10分，正確填“√”，錯(cuò)誤填“×”）1.PCR產(chǎn)物電泳出現(xiàn)多條非特異性條帶，一定是引物設(shè)計(jì)不當(dāng)導(dǎo)致的。（）答案：×（可能原因包括退火溫度過低、模板不純、酶量過高等）2.UNG酶（尿嘧啶糖基化酶）可降解含dUTP的PCR產(chǎn)物，但不能降解天然DNA。（）答案：√（UNG酶特異性識(shí)別尿嘧啶，用于防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染）3.熒光定量PCR無需電泳即可對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析。（）答案：√（通過熒光信號(hào)和Ct值可直接判斷結(jié)果）4.內(nèi)參基因只需在實(shí)驗(yàn)樣本中表達(dá)，無需在所有組織中穩(wěn)定表達(dá)。（）答案：×（內(nèi)參基因需在不同樣本中穩(wěn)定表達(dá)，用于校正誤差）5.PCR變性溫度越高（如100℃），模板解鏈越徹底，擴(kuò)增效率越高。（）答案：×（過高溫度會(huì)導(dǎo)致Taq酶失活，影響擴(kuò)增）6.實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)污染后，只需更換新的PCR試劑即可消除污染。（）答案：×（需同時(shí)進(jìn)行環(huán)境消毒、設(shè)備清潔及流程排查）7.RNA提取時(shí)，使用普通蒸餾水不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（）答案：×（普通蒸餾水含RNA酶，會(huì)降解RNA模板）8.引物二聚體的存在會(huì)導(dǎo)致定量PCR的Ct值偏低（提前出現(xiàn)）。（）答案：√（二聚體擴(kuò)增會(huì)消耗dNTP和引物，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物Ct值異常）9.熔解曲線呈單峰，說明PCR產(chǎn)物為單一特異性片段。（）答案：×（可能存在不同片段但Tm值相近的情況，需結(jié)合電泳驗(yàn)證）10.臨床PCR結(jié)果判讀時(shí)，只需觀察樣本的Ct值即可，無需關(guān)注陰陽性對(duì)照。（）答案：×（必須通過對(duì)照驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的有效性）四、簡(jiǎn)答題（每題6分，共30分）1.簡(jiǎn)述PCR反應(yīng)體系的主要成分及其作用。答案：主要成分包括：①模板DNA/RNA（提供擴(kuò)增的起始序列）；②引物（引導(dǎo)DNA聚合酶結(jié)合，決定擴(kuò)增特異性）；③dNTP（脫氧核苷酸，作為合成新鏈的原料）；④TaqDNA聚合酶（催化dNTP沿模板鏈延伸）；⑤緩沖液（維持反應(yīng)體系pH，含Mg2+作為酶激活劑）；⑥Mg2+（影響酶活性和引物退火效率）。2.引物設(shè)計(jì)的基本原則有哪些？答案：①長(zhǎng)度18-25bp（過短特異性差，過長(zhǎng)擴(kuò)增效率低）；②GC含量40-60%（避免過高導(dǎo)致非特異性結(jié)合或過低導(dǎo)致Tm值不足）；③Tm值55-65℃（上下游引物Tm值差異≤2℃）；④3'端避免連續(xù)G/C（防止錯(cuò)配）及互補(bǔ)（防止二聚體）；⑤避免內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)）；⑥特異性（通過BLAST比對(duì)確保無同源序列）。3.列舉PCR實(shí)驗(yàn)室常見的污染來源及預(yù)防措施。答案：污染來源：①擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠（最主要）；②樣本間交叉污染（如加樣時(shí)飛濺）；③試劑污染（如水、dNTP中殘留DNA）；④實(shí)驗(yàn)人員攜帶（如皮膚脫落細(xì)胞）。預(yù)防措施：①分區(qū)操作（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)嚴(yán)格分開）；②使用專用器材（各區(qū)物品不混用）；③設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照；④使用UNG酶+dUTP體系（降解前次擴(kuò)增產(chǎn)物）；⑤定期紫外消毒（30分鐘以上）；⑥規(guī)范操作（如使用帶濾芯槍頭，避免反復(fù)開蓋）。4.熒光定量PCR中Ct值的定義是什么？其臨床意義有哪些？答案：Ct值（循環(huán)閾值）是指熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。臨床意義：①定量依據(jù)（Ct值與初始模板量的對(duì)數(shù)呈反比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算模板濃度）；②判斷陰陽性（設(shè)定Ct值cutoff值，如Ct>35為陰性）；③評(píng)估樣本質(zhì)量（若內(nèi)參Ct值異常，提示樣本降解或抑制物存在）；④監(jiān)測(cè)療效（如抗病毒治療中病原體載量的動(dòng)態(tài)變化）。5.擴(kuò)增曲線出現(xiàn)“平臺(tái)期不明顯”的異?，F(xiàn)象，可能的原因及處理方法有哪些？答案：可能原因：①模板濃度過低（擴(kuò)增未達(dá)到平臺(tái)期）；②dNTP或引物耗盡（濃度不足）；③Taq酶活性下降（保存不當(dāng)或反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)）；④熱循環(huán)儀溫度不準(zhǔn)確（延伸溫度過低導(dǎo)致合成效率低）；⑤反應(yīng)體積過大（熱量傳遞不均）。處理方法：①增加模板量或濃縮樣本；②優(yōu)化反應(yīng)體系（提高dNTP/引物濃度）；③更換新鮮酶或調(diào)整酶量；④校準(zhǔn)熱循環(huán)儀溫度；⑤減少反應(yīng)體積（如20μl改為15μl）。五、案例分析題（20分）某醫(yī)院PCR實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)新冠病毒核酸時(shí)，出現(xiàn)以下情況：陽性對(duì)照Ct=28（預(yù)期25±2）陰性對(duì)照無擴(kuò)增曲線3份臨床樣本中，2份Ct=32，1份無擴(kuò)增曲線但內(nèi)參Ct=24（正常范圍22-26）問題：1.陽性對(duì)照Ct值偏高的可能原因是什么？2.無擴(kuò)增曲線的樣本是否可直接判為陰性？為什么？3.針對(duì)上述情況，應(yīng)采取哪些改進(jìn)措施？答案：1.陽性對(duì)照Ct值偏高的可能原因：①陽性對(duì)照模板降解（保存不當(dāng)或反復(fù)凍融）；②加樣誤差（實(shí)際加入的模板量少于標(biāo)準(zhǔn)量）；③反應(yīng)體系成分失效（如Taq酶活性下降、引物/探針降解）；④熱循環(huán)儀溫度偏差（退火/延伸溫度過高導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低）。2.不可直接判為陰性。該樣本內(nèi)參Ct值正