1、基因治療的原理,武漢工程大學環(huán)境與城市建設學院 采礦工程01班黃杰 二零一零年十一月七號,基因治療分類,體細胞(somatic cell)基因治療 生殖細胞(germline)基因治療,只限于某一體細胞的基因的改變 只限于某個體的當代 對缺陷的生殖細胞進行矯正 當代及子代,一、基因治療的策略,內(nèi)容提要,二、基因轉移技術,三、基因干預,一、基因治療的策略,（一）基因置換（gene replacement）,定義：指將特定的目的基因導入特定細胞，通過定位重組，以導入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。,目的：將缺陷基因的異常序列進行橋正。 對缺陷基因的缺陷部位進行精確的原位修復，不涉及基因組的任

2、何改變。,要實現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組技術使相應的正常基因定向導入受體細胞的基因缺陷部位。,定向導入的發(fā)生率約1/100萬，采用胚胎干細胞培養(yǎng)的方法，這種同源重組的檢出率最高可達1/10。,（二） 基因添加,基因添加或稱基因增補（gene augmentation）: 通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。,類型: 在有缺陷基因的細胞中導入相應的正?；?，而細胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導入正常基因的表達產(chǎn)物，補償缺陷基因的功能； 向靶細胞中導入靶細胞本來不表達的基因，利用其表達產(chǎn)物達到治療疾病的目的。,（三）基因干預 基因干預（gene interference）: 采用特定的

3、方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因的結構而使之不能表達，以達到治療疾病的目的。,（四）自殺基因治療 自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。 原理:將“自殺”基因導入宿主細胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產(chǎn)生“自殺”效應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。,（五）基因免疫治療,通過將抗癌免疫增強細胞因子或MHC基因導入腫瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應。,二、基因轉移技術,基因治療的兩種途徑,載體,目的基因,in vivo,ex vivo,靶細胞,基因轉移(gene transfer)技術,1.病毒介導的基因轉移系統(tǒng)。 2.非病毒介導

4、的基因轉移系統(tǒng)。,1.病毒介導的基因轉移系統(tǒng),病毒載體介導的基因轉移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計，有72%的臨床實驗計劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉錄病毒載體。,Retrovirus,逆轉錄病毒,逆轉錄病毒介導的基因轉移系統(tǒng) 由兩部分組成：,(1) 逆轉錄病毒載體,(2) 輔助細胞株(如PA317),逆轉錄病毒載體的特點,逆轉錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細胞膜上的特異性受體識別，從而使逆轉錄病毒攜帶的遺傳物質高效地進入靶細胞。,逆轉錄病毒結構基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。,前病毒可以高效整合至靶細胞基因

5、組中，有利于外源基因在靶細胞中的永久表達。,包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。,逆轉錄病毒載體的主要缺點,隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險； 逆轉錄病毒載體的容量較小，只能容納7 kb以下的外源基因。,（2）腺病毒(adenovirus，AV)載體 腺病毒是一種大分子(36 kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉移至細胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中。 腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關聯(lián)。宿主細胞范圍廣，可感染分裂和非分

6、裂終末分化細胞，如神經(jīng)元等。,腺病毒的優(yōu)點,1.基因導入效率高，對人類安全；,2.宿主范圍廣；,3.基因轉導與細胞分裂無關；,4.重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；,5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5 kb外源基因；,腺病毒載體缺點,2.宿主的免疫反應導致腺病毒載體表達短暫。,3.有兩個環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復制型腺病毒。,4.靶向性差。,1.不能整合到靶細胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細胞，導入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機會增多，表達時間相對較短。,(1)腺病毒產(chǎn)生過程中與293輔助細胞內(nèi)E1區(qū)序列發(fā)生同源重組； (2)腺病毒載體與被治療的患者體內(nèi)已感染的野生型腺病毒，甚

7、至乳頭瘤病毒、巨細胞病毒發(fā)生重組。,（3）腺病毒相關病毒載體 腺病毒相關病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5 kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時，才能進行復制和溶細胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。,AAV的特點, 以潛伏感染為主； 病毒基因組與細胞共存； 只要宿主細胞正常，AAV基因表達就處于抑制而維持潛伏狀態(tài)； 若細胞受刺激，表達應激基因，AAV基因表達從而使AAV病毒復制； 產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細胞，建立新的

8、潛伏狀態(tài)。,AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對人類無致病性。 AAV可以高效定點整合至人19號染色體的特定區(qū)域19q13.4中，并能較穩(wěn)定地存在。這種靶向定點整合可以避免隨機整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達，并可受到周圍基因的調控，兼具逆轉錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點。,AAV載體的缺陷：,2.非病毒載體介導的基因轉移系統(tǒng) （1）脂質體介導的基因轉移技術 脂質體介導的基因轉移技術使用方便、成本低廉。 基本原理:利用陽離子脂質體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質體，然后與細胞一起孵育，即可通過細胞內(nèi)吞作用將外源

9、DNA（即目的基因）轉移至細胞內(nèi)，并進行表達。,（2）受體介導轉移技術,將DNA與細胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價連接后，又通過電荷相互作用與帶負電荷的DNA結合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復合物可被帶有特異性受體的靶細胞吞飲，從而將外源DNA導入靶細胞。,（3）基因直接注射技術 不需要進行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi)。 動物實驗表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應的蛋白質，并能維持數(shù)月之久。 1.將促進心臟血管生長的基因直接注入

10、實驗鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細血管增加30%40%； 2.將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素； 3.肌內(nèi)注射凝血因子基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等。,基因直接注射法的優(yōu)點,1.制備具有調控部件的質粒DNA重組體的技術較容易； 2.排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用； 3.導入的基因不需整合即可表達，避免了逆轉錄病毒載體導入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉的缺點； 4.基因直接注射法可反復使用，而病毒載體則可能誘導體內(nèi)免疫應答，致使反復治療效果下降。,三、基因干預,基因干預的種類：,1.反義RNA (antisense RNA) 2.干擾RNA (RN

11、A interference) 3.核酶 (ribozyme),（一）反義RNA 1. 反義RNA與基因表達調控 利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細胞進行基因表達調控，通常采用的方法有兩種： （1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細胞，細胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。 （2）構建能轉錄反義RNA的重組質粒，將質粒轉入細胞，轉錄出反義RNA而發(fā)揮作用。,2.受體介導反義RNA技轉移術,受體介導的RNA轉移十分專一，而且效率高； 被轉移的RNA是被保護的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護層, 可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。,將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價連接，得到ASGP

12、-PL復合物，成為運載核酸的工具。ASGP-PL反義RNA復合物可以專一性地被肝細胞表面的ASGP受體所識別，并吞噬到肝細胞中，反義RNA進入肝細胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。,借助受體介導DNA轉移方法把DNA換成反義RNA，就可以實現(xiàn)受體介導的反義RNA的轉移。,3. 反義RNA的應用前景,受體介導的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點，而在 一定程度上補充了轉基因治療的不足。,（l）安全性高,（2）反義RNA設計和制備方便,（3）具有劑量調節(jié)效應,（4）能直接作用于一些RNA病毒,反義RNA只作用于特異的mRNA分子，不改變所調節(jié)基因的結構。反義RNA分子無論怎樣修飾，最終將在細胞內(nèi)部被降

13、解，不留“殘渣”。,在治療RNA病毒感染性疾病時，受體介導的反義RNA基因治療比一般的DNA基因治療有更大的優(yōu)勢。利用反義RNA可以直接作用于病毒RNA，阻斷RNA病毒的繁殖。,（二）干擾RNA,實驗結果顯示，有義鏈RNA（sense RNA）或反義鏈RNA（antisense RNA）均能抑制線蟲基因的表達，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。將特異的雙鏈RNA注入線蟲體內(nèi)可抑制有同源序列的基因的表達。得到的結果是有義鏈RNA和反義鏈RNA都同樣阻斷基因表達途徑。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術的解釋正好相反。而且其抑制基因表達的效率比反義RNA至少高2個數(shù)量級。,1.RNA干擾現(xiàn)象,RNA干擾（RN

14、A interference， RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達。,對RNA干擾的認識來源于用線蟲（C. elegans）和果蠅所進行的實驗。,2.RNA干擾的機制,RNA干擾過程主要有2個步驟：,（1）小干擾性RNA（siRNA）,（2）siRNA與細胞內(nèi)的某些酶和蛋白質形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex, RISC)。,該復合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。,長雙鏈RNA被細胞內(nèi)的雙鏈

15、RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small interfering RNA，siRNA）。,3.RNA干擾的應用前景 RNA干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學研究、微生物學研究、基因治療和信號轉導等廣泛領域取得了令人矚目的進展，使其在醫(yī)學、生物學領域的應用有著廣闊的前景。,（1） 研究基因功能的新工具,由于 RNA干擾技術具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。,RNA干擾技術能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，建立多種表型；抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段，

16、產(chǎn)生類似基因敲除的效應。,（2） 腫瘤的基因治療,傳統(tǒng)反義RNA技術誘發(fā)的單一癌基因的阻斷，不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長，而RNA干擾技術可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設計針對這一區(qū)段序列的雙鏈RNA分子，只使用一種雙鏈RNA即可以產(chǎn)生多個基因同時剔除的表型，也可以同時使用多種雙鏈RNA而將多個序列不相關的基因同時剔除。RNA干擾技術可用于治療有異?；虮磉_的惡性腫瘤。,K-RAS蛋白為腫瘤發(fā)生所必需，bcr/ab1融合基因與人白血病有關，用RNA干擾技術可以阻礙K-RAS蛋白的表達從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死有bcr/ab1的人白血病細胞系。 通過RNA干

17、擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達，能促進白血病細胞系的細胞凋亡或增加其對化療藥物的反應性。 應用RNA干擾技術成功地阻斷了MCF-7乳腺癌細胞中一種異常表達的與細胞增殖分化相關的核轉錄因子基因Sp1的功能。,（3） 病毒性疾病的基因治療 RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機制。用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表達，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細胞內(nèi)復制。用RNA干擾技術抑制HIV的受體（CD4）或輔助受體（CXCR4或CCR5）在細胞內(nèi)表達，可阻礙HIV感染細胞。也可通過RNA干擾抑制其他病毒在細胞內(nèi)復制，如脊髓灰質炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、乙

18、型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。,siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復制，病毒感染能被針對病毒基因和相關宿主基因的siRNA所阻斷，RNA干擾技術將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對于許多嚴重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意義。,（三）核酶(ribozyme),天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由兩個RNA分子組成。,在基因治療時，利用核酶分子結合到靶RNA分子中適當?shù)泥徫?，形成錘頭核酶結構，將靶RNA分子切斷，通過破壞靶RNA分子達到治療疾?。ㄈ缜宄《净蚪MRNA）的目的。 只要兩個RNA分子通過互補序列相結合，形成錘頭狀的二級結構（3個螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個或11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應。,1. 核酶的設計,核酶是通過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結構域，要從靶分子和核酶分子兩個