1、微生物檢驗項目性能驗證,Com.30550：Instrument/Equipment Performance Verification The performance of all instruments and equipment is verified upon installation and after major maintenance or service to ensure that they run according to expectations.2015/07/28 儀器/設備性能驗證 所有儀器和設備在安裝后以及重要維護保養(yǎng)服務后應進行性能驗證，以確保其可以按照預期運行。

2、 NOTE：Performance verification is necessary after repairs or replacement of critical components of an instrument or item of equipment. 維修或更換儀器，或者更換儀器關(guān)鍵部件后必須進行性能驗證,Why？,CNAS-CL042：5.5.1.2: 新的鑒定系統(tǒng)使用前，應查閱已發(fā)表的完整、科學的系統(tǒng)評估文獻作為性能驗證 的初級證據(jù)，再按優(yōu)先順序依次選擇標準菌株、質(zhì)控菌株或其它已知菌株對商業(yè)鑒定 系統(tǒng)（包括自動、半自動、手工）每種板（條/卡/管）的鑒定/藥敏結(jié)果的符合性進

3、行 驗證。 CNAS-CL042：5.3.1.5 如果設備故障影響了方法學性能，在設備修復、校準后，實驗室可通過檢測質(zhì)控 菌株或已知結(jié)果的樣品的方式進行性能驗證。,why,CNAS-GL41：臨床微生物檢驗程序驗證指南， 在常規(guī)應用前，應由實驗室對未加修改而使用的已確認的檢驗程序進行獨立驗證。實驗室應從制造商或方法開發(fā)者獲得相關(guān)信息，以確定檢驗程序的性能特征。 2016/5/30,why,微生物檢驗程序包括：顯微鏡檢查、分離培養(yǎng)和鑒定、藥物敏感試驗，血清學檢查，抗原檢查等各項檢驗活動，,實驗室應根據(jù)分析類型和用途進行驗證程序的設計、驗證結(jié)果的統(tǒng)計學分析、建立新檢驗程序的可接受性能標準。 驗證結(jié)

4、果應證明該檢驗程序可用于檢測或準確分析待測物的特點，通常驗證計劃和可接受標準應在驗證開始前確定。,CNAS-GL41:4.2,驗證計劃和可接受標 準應與該分析物相關(guān)的國家/行業(yè)標準/權(quán)威出版物等保持一致。 定義可接受標準的方法之一是根據(jù)醫(yī)學和臨床要求確定總允許誤差，但通常應用于定量檢測。定性檢測的可接受標準可以用一致性（符合率）表達。,CNAS-GL41:4.2,檢驗程序驗證所使用的標本應為合格的臨床標本或從回顧性/前瞻性臨床標本中分離的菌株。 標本的采集應符合國家、地區(qū)法規(guī)要求。 已通過一種或多種方式確定性能的標準菌株或質(zhì)控品（如國家或地方臨床檢驗中心使用過的質(zhì)控菌株）也適用。,標本,CNA

5、S-GL41:4.2,顯微鏡檢查,CNAS-GL41:4.3,涂片制備 染色鏡檢 染色方法包括手工染片和自動化儀器染片 結(jié)果報告 應在檢驗項目開展前進行性能驗證，并由有經(jīng)驗的實驗人員操作 所有樣品及容器應當作具有傳染性的物質(zhì)，應按照實驗室生物安全要求進行操作。,顯微鏡檢查,CNAS-GL41:4.3,包括能力驗證/實驗室間比對，實驗室內(nèi)人員比對, 實驗室如果開展手工染片和自動化染片，應該對兩種方法進行實驗室內(nèi)比對。,驗證要求,CNAS-GL41:4.3,樣品數(shù)量 1.每項檢查至少5份樣本 2.需覆蓋全部樣本類型 3.無菌樣本類型應包含陽性和陰性結(jié)果 4.應優(yōu)先選擇使用已知結(jié)果的留樣 樣本，不可

6、獲取時采用模擬樣本,比對方案,CNAS-GL41:4.3,按照臨床標本常用檢驗方式處理，由工作人員進行操作 進行手工染片和自動化儀器染片時涂片需同時制備兩份 進行實驗室間比對和能力驗證時，需由當日在崗人員進行涂片，染色，鏡檢，結(jié)果報告 進行實驗室內(nèi)人員比對時，由本崗位人員負責制片，染色，所有從事顯微鏡檢查的人員 進行鏡檢，結(jié)果報告，由專人進行結(jié)果統(tǒng)計。,比對方案,CNAS-GL41:4.3,結(jié)果報告 根據(jù)實驗室程序文件規(guī)定進行結(jié)果報告?？顾崛旧凑找筮M行分級報告。 可接受標準 每項檢查結(jié)果符合率80%。,比對方案,CNAS-GL41:4.3,一般培養(yǎng)（非血液標本）,CNAS-GL41:4.4

7、.2,一般培養(yǎng)包括各類標本的細菌、真菌、支原體的培養(yǎng)。 標本類型包括痰液、尿液、糞便、分泌物、組織等 細菌包括厭氧菌和分枝桿菌等 培養(yǎng)程序包括標本處理、接種、培養(yǎng)基選擇、培養(yǎng)條件選擇等,一般培養(yǎng),CNAS-GL41:4.4.2,每項檢查，每種樣本至少1份標本 無論商品化培養(yǎng)基還是自配培養(yǎng)基，都需要在使用前對培養(yǎng)基性能進行驗證，驗證菌株可選擇質(zhì)控菌株或臨床菌株。 標準菌株、能力驗證/室間質(zhì)評活動使用的菌株、從臨床病人標本分離的具有穩(wěn)定表型的菌株均可用做驗證菌株，實驗室對其生化特征及鑒定結(jié)果應做好相關(guān)記錄。,驗證要求,CNAS-GL41:4.4.2,直接接種法 按照實驗室細菌分離培養(yǎng)的SOP，將待

8、測標本接種到相應的培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況。 注意：在直接接種法驗證不合格的情況下要采用標準化菌懸液進行驗證。,驗證方案,CNAS-GL41:4.4.2,標準化菌懸液法 1.菌懸液制備 1）直接菌落法：挑取培養(yǎng)18-24h的菌落，在生理鹽水中制備成0.5Mcf的菌懸液 2）生長法：從培養(yǎng)24h的培養(yǎng)物中挑取3-5個菌落至無菌肉湯中，孵育數(shù)小時使其達到0.5Mcf,驗證方案,CNAS-GL41:4.4.2,標準化菌懸液法 2.接種 1）驗證非選擇培養(yǎng)基 用無菌肉湯或生理鹽水將配置好的菌懸液進行1:100稀釋，每個平板接種10uL，均勻涂布接種。如生長過密則進行1:1000稀釋 2）驗證選擇性培

9、養(yǎng)基 用無菌肉湯或生理鹽水將配置好的菌懸液進行1:10稀釋，每個平板接種10uL，均勻涂布接種。如生長過密則進行1:100稀釋 3）驗證培養(yǎng)管 用10uL未經(jīng)稀釋的菌懸液進行接種。,驗證方案,CNAS-GL41:4.4.2,在選擇性培養(yǎng)基上驗證菌株長勢良好、菌落大小與預期相符、菌落形態(tài)典 型，并且能夠抑制特定微生物的生長，可判定性能符合要求，驗證合格。 在非選擇性培養(yǎng)基上驗證菌株長勢良好、菌落大小與預期相符、菌落形態(tài)典 型，血培養(yǎng)基上的溶血類型符合，可判定非選擇性培養(yǎng)基驗證合格。,可接受標準,CNAS-GL41:4.4.2,血培養(yǎng),CNAS-GL41:4.4.1,臨床微生物室血培養(yǎng)系統(tǒng)驗證的目

10、的是評估系統(tǒng)使用的培養(yǎng)基能否用于培養(yǎng)臨床常見微生物，以及儀器是否能及時檢測出血液中大部分的微生物。,CNAS-GL41:4.4.1,血培養(yǎng)性能驗證常用留樣驗證和血培養(yǎng)系統(tǒng)平行比對兩種方法。 本實驗室采用的是留樣驗證的方法，操作過程參照XJ-SOP-006細菌室檢驗項目性能驗證,CNAS-GL41:4.4.1,驗證應覆蓋臨床常見微生物 需氧成人/兒童血培養(yǎng)瓶驗證菌株應包括:需氧/兼性 厭氧革蘭陽性菌、需氧/兼性厭氧革蘭陰性菌、苛養(yǎng)菌（如：流感嗜血桿菌、肺炎鏈球 菌等）和真菌， 厭氧血培養(yǎng)瓶驗證菌株應包括兼性厭氧革蘭陽性菌、兼性厭氧革蘭陰 性菌、專性厭氧菌， 其他特殊用途血培養(yǎng)瓶參照廠家要求選擇合

11、適類型菌株進行驗 證。,驗證要求,CNAS-GL41:4.4.1,每種類型至少株，總體不少于 15 株。應盡可能使用真實患者的臨床分離菌株 （性能驗證用臨床留樣菌株宜經(jīng)質(zhì)譜或 DNA 序列分析確認）。對于特殊、苛養(yǎng)菌可使 用標準菌株或質(zhì)控菌株。 某些特殊菌株需要在培養(yǎng)瓶中加入無菌、未使用抗生素的廠 家推薦血液標本，如不加可能不生長，如流感嗜血桿菌。,驗證要求,CNAS-GL41:4.4.1,模擬臨床血流感染患者的細菌含量。 若苛養(yǎng)菌需添加適量的新鮮無菌血液（成人瓶 5-10ml，兒童瓶 1-3ml）后置于血培養(yǎng)系統(tǒng)上進行培養(yǎng)、檢測。,驗證方案,CNAS-GL41:4.4.1,挑取培養(yǎng)18-24

12、h的新鮮培養(yǎng)物，在生理鹽水中調(diào)整為0.5麥氏濁度的菌懸液，然后倍比稀釋。如圖所示,驗證方案,0.5Mcf 108CFU/ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,106CFU/ml,104CFU/ml,102CFU/ml,0.5ml,#4 10CFU/ml,從#4號試管里取3ml菌懸液注入血培養(yǎng)瓶內(nèi)，同時取1ml菌懸液在平板上進行涂布接種，確認接種數(shù)量。 將接種好的血培養(yǎng)瓶放入儀器進行監(jiān)測， 待陽性報警后移種平板，涂片染色，確認是否為接種菌,驗證方案,在廠家說明書規(guī)定時間內(nèi)檢測出所有菌株則該方法通過驗證。 3 天時間應足以 檢測出至少 95%的臨床相關(guān)細菌，須具備苛養(yǎng)菌、真菌、厭氧菌等的檢出能

13、力。 若未能 檢出應使用相同菌株進行重復試驗來驗證。若仍不能檢測，實驗室和/或制造商應在臨 床使用該系統(tǒng)前采取糾正措施。,可接受標準,CNAS-GL41:4.4.1,如果血培養(yǎng)儀升級，原系統(tǒng)和新系統(tǒng)的差別不大，使用的培養(yǎng)瓶也沒有改變，那么由供應商技術(shù)代表核查儀器性能即可，無需再次驗證。功能核 查將對孵育系統(tǒng)和光學系統(tǒng)以及軟件是否按照制造商規(guī)定運行進行評價。,可接受標準,CNAS-GL41:4.4.1,微生物鑒定試驗,CNAS-GL41:4.5,按優(yōu)先順序依次選擇標準菌株、質(zhì)控菌株或其它已知菌株，試驗應覆蓋實驗室使 用的全部卡片種類和/或方法。,驗證要求,CNAS-GL41:4.5,菌株種類的選

14、擇： 首先參照廠商說明書，覆蓋革蘭陽性和革蘭陰性非苛養(yǎng)菌、苛養(yǎng)菌、 厭氧菌、念珠菌、隱球菌等。包括臨床留樣菌株和標準/質(zhì)控菌株。每種類型應至少 1 株，總體不少于 20 株。 參照實驗室SOP規(guī)定對驗證菌株進行檢測，一 般要求鑒定至種水平。對于特殊類型的微生物（如棒狀桿菌、厭氧菌，芽孢桿菌），可將鑒定到屬的水平作為可以接受的性能標準。,驗證方案,CNAS-GL41:4.5,標準/質(zhì)控菌株符合率應為 100%，臨床菌株的符合率應在 90以上。,可接受標準,CNAS-GL41:4.5,本實驗室采用了連續(xù)20天檢測待測菌株的方法進行了鑒定儀的性能驗證試驗。 一共選取了26株細菌和真菌，參照標準操作規(guī)

15、程XJ-SOP-503 VITEK2 Compact標準操作規(guī)程連續(xù)測試20天。 GP、GN：如果失控的生化鑒定項目3個，可認為性能好可接受；如果質(zhì)控檢測結(jié)果和目標反應結(jié)果出現(xiàn)誤差大于3個，必須立即進行查誤步驟，如誤差無法解決，則聯(lián)系生物梅里埃/委托代理的技術(shù)代表。,血清學檢查,CNAS-GL41:4.5.2,血清學鑒定試驗包括沙門菌/志賀菌/致病大腸桿菌/弧菌等的血清學分型。,CNAS-GL41:4.5.2,沙門菌至少包括傷寒沙門菌/甲型副傷寒沙門菌/乙型副傷寒沙門菌/丙型副傷寒 沙門菌；志賀菌包括福氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、痢疾志賀菌和鮑氏志賀菌四種；致病大腸桿菌/弧菌等根據(jù)當?shù)匦l(wèi)生行政管理和

16、實驗室情況進行選擇?；魜y弧菌每年由杭州市疾控中心進行檢測驗證。 優(yōu)先選擇標準菌株和 質(zhì)控菌株，也可使用實驗室確認過的留樣臨床分離株,驗證要求,CNAS-GL41:4.5.2,參照實驗室相關(guān)SOP進行 XJ-SOP-409沙門菌屬、志賀菌屬檢驗 XJ-SOP-410O1群、O139群霍亂弧菌檢驗,驗證方案,要求準確率 100%。,可接受標準,CNAS-GL41:4.5.2,抗菌藥物敏感性試驗,CNAS-GL41:4.7,抗菌藥物敏感性試驗（藥敏試驗）可分為紙片法和最低抑菌濃度法（MIC 法）。,CNAS-GL41:4.7,藥敏試驗方法的評估宜既保證藥敏試驗的準確性，也要確保耐藥菌株的檢出靈敏性。

17、 藥敏卡的選擇應遵循生產(chǎn)廠家 說明書要求，不應超范圍使用。 藥敏試驗性能驗證可使用藥敏質(zhì)控菌株。,驗證要求,CNAS-GL41:4.7,參考 CLSI 細菌、真菌相關(guān)藥敏試驗操作及判斷標準，選擇藥敏質(zhì)控標準菌株和藥 物。 連續(xù)檢測 2030 天，每一組藥物/細菌的抑菌圈直徑或最低抑菌濃度（MIC）超出 參考范圍的頻率應不超過（）1/20 或 3/30； 也可采用替代質(zhì)控方案，即連續(xù) 5 天， 每天對每一組藥物/細菌重復測定 3 次，每次單獨制備接種物，15 個數(shù)據(jù)中超出參考范 圍（抑菌圈直徑或 MIC）的結(jié)果應不超過（）1 個，若失控結(jié)果為 2-3 個，則如前述， 再進行 5 天，每天 3 次

18、重復試驗，30 個數(shù)據(jù)失控結(jié)果應不超過（）3 個。,驗證方案,CNAS-GL41:4.7,連續(xù)MIC法應計算基本符合率（EA，essential agreement）：用于連續(xù)MIC法，AST設備得到的MIC結(jié)果與參考方法確定的MIC結(jié)果（或已知確認結(jié)果）相差在正負一個倍比稀釋度內(nèi)的符合率。,性能指標,EA=,實驗MIC在已知參考MIC的1個倍比稀釋度內(nèi)的試驗數(shù),測試總數(shù),100%,分類符合率（CA，category agreement）：用于非連續(xù)MIC法和紙片法，驗證的藥敏試驗方法與參考方法或已確認結(jié)果間S/I/R判斷的一致性。,性能指標,CA=,藥敏分類結(jié)果一致的試驗數(shù),測試的總數(shù),100%,在新的藥敏試驗系統(tǒng)應用于臨床前，須滿足上述質(zhì)控要求，通過后在日常檢測中 轉(zhuǎn)為室內(nèi)控制要求。應對較大和重大偏差進行分析，以確定特定細菌結(jié)