1、潔凈室(區(qū)域)浮游細(xì)菌檢測(cè)操作程序范圍：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了制藥行業(yè)潔凈室和潔凈區(qū)浮游細(xì)菌的檢測(cè)條件和方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于制藥行業(yè)潔凈室和潔凈區(qū)、無菌室或局部空氣凈化區(qū)(包括潔凈工作臺(tái))的浮游細(xì)菌檢測(cè)和環(huán)境驗(yàn)證。2參考標(biāo)準(zhǔn)：gb/t 16293-2010良好制造規(guī)范附錄(1998年修訂)。3標(biāo)準(zhǔn)清潔度活微生物數(shù)量/m3100級(jí)510000級(jí)10010萬級(jí)5004測(cè)試方法4.1方法總結(jié)本樣本中使用的方法是計(jì)數(shù)濃度法。也就是說，潔凈室中微生物的濃度可以通過將懸浮在空氣中的生物顆粒收集在特殊的培養(yǎng)基中(選擇能夠證明其能夠支持微生物生長的培養(yǎng)基)，并在適當(dāng)?shù)纳L條件下將它們繁殖至可見菌落數(shù)達(dá)一定時(shí)間來確定。4.

2、2人員的職責(zé)和培訓(xùn)潔凈室(區(qū))測(cè)試人員在履行潔凈室(區(qū))測(cè)試職責(zé)前，應(yīng)接受專業(yè)培訓(xùn)并取得相應(yīng)資格，包括相關(guān)衛(wèi)生知識(shí)和基本微生物知識(shí)。潔凈室(區(qū))的測(cè)試人員應(yīng)選擇適合生產(chǎn)作業(yè)空氣潔凈度要求的穿著方式，室外服裝不得帶入10萬以上的區(qū)域。4.3儀器、輔助設(shè)備和培養(yǎng)基選擇合適的浮游細(xì)菌采樣器，包括無油氣泵、低空氣流速和大采樣流速，以確保培養(yǎng)基表面的水分分布是干燥的。本試驗(yàn)所需的儀器、輔助設(shè)備和培養(yǎng)基如下：a)浮游生物采樣器；培養(yǎng)皿；c)高壓釜；d)培養(yǎng)基；e)恒溫培養(yǎng)箱；4.4浮游細(xì)菌采樣器的原理浮游細(xì)菌采樣器一般采用撞擊法機(jī)理，可分為三明治采樣器、離心采樣器或針孔采樣器。夾層取樣器的氣流被內(nèi)部風(fēng)扇吸

3、入，收集的空氣通過取樣器的夾層板噴射沖擊在慢板培養(yǎng)基表面，附著的活微生物顆粒經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。由于離心取樣器內(nèi)部風(fēng)扇的高速旋轉(zhuǎn)，氣流從取樣器的前部流向后部。在離心力的作用下，空氣中的活微生物顆粒有足夠的時(shí)間撞擊到特殊的固體培養(yǎng)條上，附著的活微生物顆粒經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。在針孔采樣器中，氣流通過金屬罩吸入，金屬罩上有密集的特制加工孔。收集的細(xì)小空氣通過風(fēng)扇直接沖擊平板培養(yǎng)基表面，附著的活微生物顆粒經(jīng)培養(yǎng)形成菌落。4.5測(cè)試點(diǎn)4.5.1試驗(yàn)儀器必須按照儀器的校準(zhǔn)周期定期校準(zhǔn)。應(yīng)使用通過驗(yàn)證且在有效期內(nèi)的儀器。4.5.2當(dāng)測(cè)試儀器未進(jìn)入測(cè)試區(qū)域時(shí)，如有必要，首先清潔表面，或?qū)⑵錅?zhǔn)備好并存放在相應(yīng)的潔凈

4、室中(用防護(hù)罩或其他合適的蓋子保護(hù)儀器)。4.5.3在100級(jí)潔凈室使用紙張時(shí)，應(yīng)覆蓋一層透明的無塵罩，100級(jí)潔凈室不應(yīng)使用鉛筆橡皮擦。4.5.4使用測(cè)試儀器時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照說明書操作。4.5.4.1儀器啟動(dòng)并預(yù)熱至穩(wěn)定后，可根據(jù)規(guī)范對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。同時(shí)，檢查取樣流量并根據(jù)取樣量設(shè)定時(shí)間。4.5.4.2取樣口必須由易于消毒且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的材料制成。4.5.4.3取樣管嚴(yán)禁泄漏，且內(nèi)壁應(yīng)光滑。4.5.4.4取樣管的長度應(yīng)根據(jù)測(cè)點(diǎn)的高度來確定，以減少彎曲。4.6培養(yǎng)皿4.6.1一般使用90毫米和15毫米規(guī)格的培養(yǎng)皿?？梢愿鶕?jù)所選的取樣器選擇合適的培養(yǎng)皿。4.6.2離心取樣器采用特殊的固體培養(yǎng)條4.

5、7培養(yǎng)基大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(tsa)或沙氏培養(yǎng)基(sda)或其他用戶認(rèn)可和驗(yàn)證的培養(yǎng)基。4.8恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)箱它應(yīng)該提前放在測(cè)試室。4.9.1.2用消毒劑擦拭了培養(yǎng)皿的外表面。在4.9.1.3取樣前，用消毒劑對(duì)頂蓋、轉(zhuǎn)盤和蓋子內(nèi)外進(jìn)行消毒。取樣后，用消毒劑輕輕噴灑蓋子和轉(zhuǎn)盤的內(nèi)壁。4.9.1.4取樣口和取樣管在使用前必須經(jīng)過高溫消毒。如果采樣管的外壁和內(nèi)壁用消毒劑消毒，應(yīng)將管中的殘余液體倒出并干燥。4.9.1.5的取樣員應(yīng)穿著與待測(cè)清潔區(qū)域相對(duì)應(yīng)的工作服。在轉(zhuǎn)盤上放置或更換培養(yǎng)皿之前，雙手應(yīng)使用消毒劑消毒或使用無菌手套操作。消毒后，4.9.1.6取樣儀器不應(yīng)放入培養(yǎng)皿中，應(yīng)打開浮游細(xì)菌取

6、樣器，蒸發(fā)儀器中殘留的消毒劑不少于5分鐘。檢查流速，并根據(jù)取樣量調(diào)整設(shè)定時(shí)間。4.9.1.7關(guān)閉了漂浮取樣器，把它放在培養(yǎng)皿中，蓋上蓋子。在4.9.1.8將取樣口放在取樣點(diǎn)后，它打開浮游取樣器進(jìn)行取樣。4.10栽培4.10.1所有取樣后，在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)皿。4.10.2用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(tsa)制備的培養(yǎng)物應(yīng)取樣并在30 35的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少2天。取樣后，將沙氏培養(yǎng)基制成的培養(yǎng)皿在20 25的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不少于5天。4.10.3每批培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，檢查培養(yǎng)基本身是否被污染。每批可選擇三個(gè)培養(yǎng)皿用于對(duì)照培養(yǎng)。4.11菌落計(jì)數(shù)4.11.1直接用肉眼計(jì)數(shù)并標(biāo)記培養(yǎng)皿上的所有菌落或

7、在菌落計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)，然后用5 10倍的放大鏡檢查是否有遺漏。4.11.2如果平板上有兩個(gè)或多個(gè)菌落重疊，當(dāng)可以區(qū)分時(shí)，仍可計(jì)數(shù)兩個(gè)或多個(gè)菌落。4.12注意事項(xiàng)4.12.1使用前，仔細(xì)檢查每個(gè)培養(yǎng)皿的質(zhì)量。如果培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿變質(zhì)、損壞或被污染，則不能使用。4.12.2詳細(xì)記錄培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等參數(shù)。4.12.3因?yàn)榧?xì)菌種類很多，所以差別很大。計(jì)數(shù)時(shí)，通常用透射光仔細(xì)觀察培養(yǎng)皿的表面或真實(shí)表面。不應(yīng)遺漏培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落，應(yīng)區(qū)分細(xì)菌菌落或培養(yǎng)基沉淀的物質(zhì)。如有必要，應(yīng)使用顯微鏡進(jìn)行鑒定。5測(cè)試規(guī)則5.1測(cè)試條件測(cè)試前，潔凈室(區(qū)域)的相關(guān)參數(shù)應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)試，這將為測(cè)試懸浮顆粒提供環(huán)境條件。例如，該

8、預(yù)測(cè)試可以包括：a)溫度和相對(duì)濕度測(cè)試。潔凈室(區(qū))的溫度和相對(duì)濕度應(yīng)適合其生產(chǎn)和工藝要求是(無特殊要求時(shí)，溫度應(yīng)控制在18-26之間，相對(duì)濕度應(yīng)控制在45%-65%之間)。同時(shí)足部測(cè)試儀器的使用范圍；b)室內(nèi)送風(fēng)或風(fēng)速測(cè)試，或壓差測(cè)試；c)高效過濾器的泄漏試驗(yàn)5.1測(cè)試狀態(tài)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)都可以測(cè)試。靜態(tài)測(cè)試時(shí)，室內(nèi)測(cè)試人員不得超過2人在測(cè)試浮游細(xì)菌之前，用戶應(yīng)對(duì)待測(cè)試的潔凈室(區(qū)域)進(jìn)行預(yù)消毒。測(cè)試浮游細(xì)菌時(shí)，應(yīng)標(biāo)明測(cè)試狀態(tài)和室內(nèi)測(cè)試人員的數(shù)量。5.3測(cè)試時(shí)間5.3.1在空或靜態(tài)a試驗(yàn)中，對(duì)于單向流潔凈室(區(qū))，試驗(yàn)應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行時(shí)間不少于10分鐘后開始。對(duì)于非單向潔凈室(區(qū))，測(cè)試應(yīng)

9、在凈化系統(tǒng)正常運(yùn)行時(shí)間不少于30分鐘后開始。在靜態(tài)b試驗(yàn)中，應(yīng)清潔單向流，試驗(yàn)應(yīng)在生產(chǎn)操作人員離開現(xiàn)場(chǎng)后開始，并在10分鐘后進(jìn)行自清潔；對(duì)于非單向潔凈室(區(qū))，測(cè)試應(yīng)在生產(chǎn)操作人員離開現(xiàn)場(chǎng)并自潔20分鐘后開始。5.3.2動(dòng)態(tài)試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)記錄生產(chǎn)開始時(shí)間和試驗(yàn)時(shí)間。5.4。浮游細(xì)菌濃度的計(jì)算5.4.1取樣點(diǎn)的數(shù)量和布置5.4.1.1的最小取樣點(diǎn)數(shù)量請(qǐng)參考gb/t16292-2每次浮游細(xì)菌的最小取樣量見表1。表1最小樣本量清潔度取樣數(shù)量l/次100級(jí)100010000級(jí)50010萬級(jí)100300，000級(jí)1005.4.3取樣次數(shù)通常，每個(gè)采樣點(diǎn)采樣一次。5.4.4取樣注意事項(xiàng)對(duì)于5.4.4.1的單向

10、流潔凈室(區(qū))或送風(fēng)口，采樣器的采樣口應(yīng)朝向氣流方向；對(duì)于非單向流潔凈室(區(qū))，取樣口朝上。在5.4.4.2布置采樣點(diǎn)時(shí)，至少應(yīng)盡量避開灰塵顆粒集中的回風(fēng)出口。在5.4.4.3取樣時(shí)，測(cè)試人員應(yīng)站在取樣口的背風(fēng)面，盡可能少走動(dòng)。5.4.4.4已采取一切措施防止取樣期間的污染和其他可能對(duì)樣品造成的污染。當(dāng)使用5.4.4.5培養(yǎng)皿進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，為了避免培養(yǎng)皿的運(yùn)輸或移動(dòng)所造成的影響，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)。每次或在每個(gè)區(qū)域應(yīng)取一個(gè)對(duì)照皿，其操作方式應(yīng)與取樣皿相同，但取樣皿不應(yīng)暴露，然后與取樣培養(yǎng)皿(tsa或sda)一起放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。因此，任何群體都不應(yīng)該生長。5.5記錄測(cè)試報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容a)

11、測(cè)試人員的姓名和地址、測(cè)試日期；b)測(cè)試基礎(chǔ)c)測(cè)試潔凈室(區(qū)域)的平面位置(如有必要，標(biāo)記相鄰區(qū)域的平面位置)；d)試驗(yàn)儀器及其試驗(yàn)方法的說明：包括試驗(yàn)環(huán)境條件、取樣點(diǎn)的數(shù)量和布局、試驗(yàn)次數(shù)、取樣流量或試驗(yàn)方法的可能變化、試驗(yàn)儀器的檢定證書等。動(dòng)態(tài)試驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)記錄現(xiàn)場(chǎng)操作人員的數(shù)量和位置，以及現(xiàn)場(chǎng)操作設(shè)備的數(shù)量和位置。e)結(jié)果：包括所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算數(shù)據(jù)。5.6結(jié)果的計(jì)算5.6.1計(jì)算每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。5.6.2每個(gè)測(cè)量點(diǎn)浮游細(xì)菌平均濃度的計(jì)算見公式(1)。平均濃度(件數(shù)/m3)=菌落數(shù)/取樣量(1)實(shí)施例1:如果某個(gè)測(cè)量點(diǎn)的取樣量為400升，菌落數(shù)為1，則：平均濃度=1/0.4=2.5 /m3實(shí)施例2:如果某個(gè)測(cè)量點(diǎn)的取樣量為2m3，菌落數(shù)為3，則：平均濃度=3/2=1.5 /m35.7結(jié)果評(píng)估5.7.1每個(gè)測(cè)量點(diǎn)的浮游細(xì)菌平均濃度必須低于所選評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)中的細(xì)菌濃度限值。5.7.2在靜態(tài)試驗(yàn)中，如果某一測(cè)量點(diǎn)浮游細(xì)菌的平均濃度超過評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)重新取樣兩次，兩次試驗(yàn)的結(jié)果均合格后才能判定為合格。5.8日常監(jiān)控對(duì)于