1、廣東醫(yī)學(xué)院2004級(jí)研究生,開題報(bào)告,Survivin與鼻咽癌放射殘存細(xì)胞 Tr-12放射抵抗的關(guān)系探討,研究生： 畢 宏 導(dǎo) 師： 孫 寧教授 時(shí) 間： 2005年8月20日,立題依據(jù),立題依據(jù),放射治療是鼻咽癌的首選治療手段，但放射后5年生存率較低，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是放療失敗的原因。 放射后存活細(xì)胞對(duì)放射的抵抗是放療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。 明確放射抵抗的機(jī)理可提高放療的局部控制率和完全緩解率。,立題依據(jù),研究證明腫瘤細(xì)胞對(duì)放射的反應(yīng)主要受基因控制 在受放射細(xì)胞中DNA鏈斷裂，伴有細(xì)胞周期、生長因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)的改變 照射存活后代放射抵抗機(jī)制可能與：凋亡減少;增殖減慢;DNA損傷修復(fù)

2、能力增強(qiáng)有關(guān),survivin基因,Survivin是IAPs家族中分子量最小但抗凋亡能力最強(qiáng)而倍受關(guān)注的明星分子 位于染色體17q25，全長15kb，含4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子，編碼分子量為16.5kD的蛋白質(zhì) 羧基末端缺乏環(huán)指結(jié)構(gòu) ，氨基端只含有一個(gè)包含保守的Cys/His 的BIR功能區(qū),Survivin的組織分布,胚胎和胎兒組織中大量表達(dá)，分化成熟的正常組織無表達(dá) 特異性地表達(dá)于多數(shù)腫瘤組織,survivin基因的主要功能,抑制凋亡 Caspase途徑：caspase-3/7 非caspase途徑：NFB,survivin基因的主要功能,參與細(xì)胞周期調(diào)控 特異性地表達(dá)于G2/M期,sur

3、vivin基因的主要功能,參與血管的生成 參與DNA損傷后修復(fù),survivin參與腫瘤放療抵抗的機(jī)制,參與放射引起腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的調(diào)節(jié),survivin參與腫瘤放療抵抗的機(jī)制,阻滯細(xì)胞周期于放射不敏感期,survivin參與腫瘤放療抵抗的機(jī)制,阻止自發(fā)性和放射誘導(dǎo)性凋亡,以Survivin為靶點(diǎn)的腫瘤放射增敏,Survivin核酶 Pennati等用靶向Survivin的錘頭狀核酶作用于兩個(gè)過表達(dá)Survivin的黑色素瘤細(xì)胞株 ，-射線照射后，與親代細(xì)胞相比，表達(dá)核酶的細(xì)胞克隆形成率下降，caspase-3活性提高，凋亡水平增加,以Survivin為靶點(diǎn)的腫瘤放射增敏,Surviv

4、in反義寡核苷酸 Cao等在肺癌小鼠模型中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染survivin與XIAP的反義寡核苷酸能顯著下調(diào)它們的表達(dá)，反義治療聯(lián)合放療組的移植瘤出現(xiàn)了超過15天的生長延遲,以Survivin為靶點(diǎn)的腫瘤放射增敏,siRNA干擾 Kappler等以survivin siRNA轉(zhuǎn)染肉瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)survivin表達(dá)明顯下降，且腫瘤細(xì)胞的放射敏感性隨照射劑量的增加而增加。,姜黃素放射增敏的研究進(jìn)展,姜科姜黃屬植物姜黃Curcuma longa L(Cdomestica Valet)是一種常用中藥，藥用其根莖 抗炎抗氧化抗凝降血脂 抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗腫瘤,姜黃素放射增敏的研究進(jìn)展,我室黃小軍、曹璋的實(shí)驗(yàn)已

5、證明姜黃素通過改變細(xì)胞周期對(duì)鼻咽癌放射抵抗細(xì)胞的增敏作用,創(chuàng)新之處,探討survivin與鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗的關(guān)系以及姜黃素對(duì)survivin表達(dá)的影響，為鼻咽癌的放射增敏提供理論依據(jù),研究目標(biāo),研究目標(biāo),探討survivin的表達(dá)與鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗的關(guān)系，姜黃素作用對(duì)survivin表達(dá)及放射敏感性的影響，為鼻咽癌預(yù)后的判斷，放療后復(fù)發(fā)的治療及放射增敏提供理論指導(dǎo),研究目標(biāo),對(duì)比慢性鼻咽炎、鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌及放療后復(fù)發(fā)鼻咽癌survivin及caspase-3蛋白表達(dá)，,研究內(nèi)容,研究內(nèi)容,CNE-2Z及其放射殘存細(xì)胞tr12的培養(yǎng)。 分別檢測兩個(gè)細(xì)胞株的自發(fā)凋亡水平，然后施以不同劑量

6、(暫定為2、4、8、10Gy)的照射，培養(yǎng)一定時(shí)間后用hoechst33342/PI雙染法檢測凋亡水平；RT-PCR檢測survivin的mRNA水平；比色法測caspase-3的活性變化,研究內(nèi)容,收集慢性鼻咽炎、鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌、放射后復(fù)發(fā)的鼻咽癌標(biāo)本各20例，用MSP法測fhit基因甲基化是否存在及甲基化率，用免疫組織化學(xué)法測PKC的表達(dá)。,研究內(nèi)容,對(duì)Tr-12細(xì)胞做姜黃素的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)（MTT法），取低毒性劑量聯(lián)合照射（不同劑量）作用于Tr-12細(xì)胞，設(shè)對(duì)照組、單純加藥組、藥物聯(lián)合放射組、單純放射組。各組細(xì)胞用克隆形成實(shí)驗(yàn)繪制放射-存活曲線；RT-PCR檢測survivin的mRN

7、A水平，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測survivin和caspase-3的表達(dá),研究內(nèi)容,收集慢性鼻咽炎、鼻咽分化性非角化型鱗狀細(xì)胞癌、放射后復(fù)發(fā)的鼻咽癌標(biāo)本各30例，免疫組化檢測survivin與caspase-3蛋白的表達(dá),技術(shù)路線,一、實(shí)驗(yàn)病理部分,CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng),Tr-12細(xì)胞培養(yǎng),姜黃素細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn) (MTT),不同劑量照射,空白對(duì)照組,空白對(duì)照組,不同劑量照射,姜黃素加照射,姜黃素閾下劑量,克隆形成實(shí)驗(yàn),RT-PCR測survivin ,caspase-3mRNA水平 比色法測caspase-3活性 hoechst/PI雙染測凋亡水平 免疫細(xì)胞化學(xué)測survivin caspase-3蛋白

8、表達(dá),二、臨床病理部分,慢性鼻咽炎,鼻咽分化性非角化型 鱗狀細(xì)胞癌,放療后復(fù)發(fā)鼻咽癌,Survivin蛋白表達(dá) 免疫組化,Caspase-3蛋白表達(dá) 免疫組化,擬解決的關(guān)鍵問題,CNE-2Z及其放射殘存細(xì)胞tr-12的培養(yǎng)。 放射后復(fù)發(fā)的鼻咽癌標(biāo)本的收集。,預(yù)期結(jié)果,預(yù)期結(jié)果,照射前和不同劑量照射后Tr-12細(xì)胞株中survivin的表達(dá)明顯高于CNE-2Z；caspase-3的活性在CNE-2Z中比Tr-12中高；hoechst/PI雙染法測凋亡水平在CNE-2Z中高于Tr-12,預(yù)期結(jié)果,姜黃素一定濃度作用于Tr-12后，survivin的表達(dá)低于作用前，照射與姜黃素聯(lián)合組比單純照射組的存活分?jǐn)?shù)低，免疫細(xì)化顯示survivin的表達(dá)也比單純照射組低。 慢性鼻咽炎中survivin表達(dá)幾乎為零，鼻咽低分化鱗癌中survivin表達(dá)水平低于放療后復(fù)發(fā)的鼻咽癌，caspase-3的表達(dá)與survivin呈反相關(guān)。,經(jīng)費(fèi)預(yù)算,細(xì)胞培養(yǎng)基本材料及放射費(fèi) 2000元 caspase-3活性檢測 2000元 免疫組化試劑 2000元 hoechst/PI雙染 3000元 姜黃素 1000元,進(jìn)度安排,2006年3月至2006年5月培養(yǎng)細(xì)胞，免疫組化預(yù)實(shí)驗(yàn)及石蠟標(biāo)本中survivin、caspa