1、第四章 操作技術,目的要求： 1.熟練掌握組織培養(yǎng)相關的滅菌方法和無菌操作技術； 2.掌握培養(yǎng)和馴化的方法和步驟； 3.基本掌握污染、褐變和玻璃化原因及采取的對策； 4.試管苗增殖率的估算和組培計劃的安排 。,第一節(jié) 滅菌和接種,第四章 操作技術,第二節(jié) 培養(yǎng)和馴化 ,第三節(jié) 組培常見問題及對策,第四節(jié) 試管苗增殖率的估算 ,總結及復習思考題 ,第五節(jié) 快速繁殖工作的計劃安排 ,第一節(jié) 滅菌和接種,一、滅菌 二、無菌操作 四、接種 (融入實踐課),二、滅菌,(一)滅菌與消毒的區(qū)別,(二)滅菌方法,消毒：殺死、消除或抑制部分微生物，使之不發(fā)生作用。,滅菌：用物理或化學方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)一

2、切微生物或生物體，即所有生命的物質(zhì)全部殺死。,滅菌和消毒的區(qū)別是什么？,(一)滅菌與消毒的區(qū)別,1.培養(yǎng)基滅菌 2.玻璃器皿滅菌 3.接種工具滅菌 4.實驗服、口罩、濾紙滅菌 5.接種室滅菌 6.接種材料滅菌 7.物體表面滅菌 8.培養(yǎng)室滅菌,(二)滅菌方法,1.培養(yǎng)基滅菌,高壓濕熱滅菌 某些激素、維生素采用過濾滅菌,1.外桶 2.鍋蓋 3.安全閥 4.排氣閥 5.氣壓表 6.內(nèi)桶 7.排氣軟管 8.支架,手提式高壓濕熱滅菌鍋,自動高壓濕熱滅菌鍋,電源,水位指示燈,溫度、壓力顯示窗,溫度壓力設置鈕,壓力表,放汽閥,培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必需的最少時間,容器體積(mL) 121滅菌所需最少時間(m

3、in),20-50 15,1000 30,250-500 25,75-150 20,過濾滅菌,濾膜0.45um以下,1.過濾器先滅菌，滅菌溫度不超過121。 2.溶液先進行初濾(濾膜0.65um),2.玻璃器皿滅菌,干熱滅菌：160-180,1.5-2.0h 濕熱滅菌：121, 20-40min 接種前用酒精棉球擦試，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌。,3.接種工具滅菌,用前干熱滅菌：160-180,1.5-2.0h 用前濕熱滅菌：121, 20-30min 接種前用酒精棉球擦試，浸入95%酒精液中，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌。,濕熱滅菌：121,20-30min 實驗服滅菌后置于緩沖間或密封好。,4.

4、實驗服、口罩、濾紙滅菌,5.接種室滅菌,紫外燈照射(接種室、超凈臺、接種箱)：波長260nm，距離小于1.2m，20-30min。 臭氧滅菌機：1-2h 熏蒸滅菌：5-8ml/m3甲醛+5g/ m3 高錳酸鉀；冰醋酸；1-3%高錳酸鉀或3%來蘇兒。 接種臺噴霧消毒：75%酒精。,用化學滅菌劑消毒 常用化學滅菌劑 滅菌步驟： 流水沖洗或洗衣粉漂洗 用化學滅菌劑浸潤滅菌，最好加吐溫-80等表面活性劑(滅菌液的0.5%)，一般70%酒精30S，0.1-1%升汞5-8 min。 無菌水沖洗3-10次。 注：滅菌液要浸沒材料,6.接種材料滅菌,滅菌劑 使用濃度 持續(xù)時間 去除難易 效 果,次氯酸鈣 9-

5、10%5-30min 易 很好,次氯酸鈉 2% 5-30min 易 很好,氯化汞 0.1-1% 5-8min 較難 最好,抗菌素 4-50mg/L 30-60min 中 較好,7.物體表面滅菌,滅菌方式：噴霧、涂抹殺菌 范圍：桌面、墻面、雙手、材料表面 消毒劑：70%酒精；1-2%來蘇水；0.25-1%新潔爾滅；洗衣粉；吐溫-80,8.培養(yǎng)室滅菌,新建培養(yǎng)室用前一定要徹底熏蒸1次。 隔2-5天用洗衣粉水或來蘇水拖地1次，用高錳酸鉀擦架1次。,二、無菌操作,無菌操作錄像,思考：如果不進行無菌操作，其后果是什么?,第二節(jié) 培養(yǎng)和馴化,一、培養(yǎng) 二、移栽馴化 (融入實踐課),1.培養(yǎng)含義 2.培養(yǎng)方

6、法 3.培養(yǎng)步驟 4.外植體成苗途徑,一、 培 養(yǎng),將植物材料置于培養(yǎng)室，提供光照、溫度條件，使之生長，分裂分化形成愈傷組織或進一步分化成再生植株的過程,一、培養(yǎng)含義,固體培養(yǎng),養(yǎng)分分布不均，生長速度不均，常有褐化、中毒發(fā)生。,養(yǎng)分分布均一，生長速度均一，振蕩培養(yǎng)能保證氧氣供應。,液體培養(yǎng),二、培養(yǎng)方法,1.初代培養(yǎng),2.繼代培養(yǎng),3.生根培養(yǎng),三 培養(yǎng)步驟,一.初代培養(yǎng),目的：獲得無菌材料和無性繁殖系。無性繁殖系包括：芽叢、不定芽、胚狀體、原球莖。,培養(yǎng)基：誘導或分化培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中CTK多，IAA少。,類型（根據(jù)發(fā)育方向）： 叢生芽的發(fā)育不定芽的發(fā)育 胚狀體的發(fā)育 原球莖的發(fā)育,叢生芽的發(fā)

7、育,頂芽,腋芽,微型扦插,叢生芽的發(fā)育,頂芽,CTK刺激,帶芽的莖切段,側(cè)芽,接種培養(yǎng),形成的莖梢節(jié)長，直立向上呈小灌木叢狀,獲得較多嫩莖梢,莖段培養(yǎng)繼代擴繁,試管苗,生根培養(yǎng),無愈傷組織產(chǎn)生,初代,繼代,不定芽的發(fā)育,不定芽的發(fā)育,脫分化,分化,愈傷組織,芽、芽叢,切割芽叢 繼代培養(yǎng),大量芽叢,試管苗,生根培養(yǎng),外植體,初代,繼代,石龍芮下胚軸培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體過程,體細胞胚狀體的發(fā)育,體細胞胚狀體的發(fā)育,外 植 體,特點：數(shù)量多，速度快，結構完整，成苗率高,愈傷組織,小孢子,游離單細胞,器官,胚 狀 體,試 管 苗,原球莖的發(fā)育,縮短的、呈珠粒狀的、由胚性細胞組成的、類似嫩莖的器官。,目的：擴

8、繁無根苗，最后達到邊繁殖邊生根。,擴繁方法：以幾何級數(shù)增加，可切割莖段、分離芽叢、胚狀體、原球莖。,培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基或分化培養(yǎng)基,實質(zhì)：增殖培養(yǎng)物，為生產(chǎn)成品試管苗做準備。,二、繼代培養(yǎng),三、生根培養(yǎng),三、生根培養(yǎng),培養(yǎng)材料,生根,繼代培養(yǎng),初代培養(yǎng),生根培養(yǎng)基：12或14MS培養(yǎng)基,生根方法與途徑,新梢基部浸入50或100ppmIBA液48h,在含IAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)46d,移入含IAA的生根培養(yǎng)基培養(yǎng),其它方法,生根其它方法,延長增殖在培養(yǎng)基培養(yǎng)時間,減少增殖倍率，減少CTK用量,對易生根植物，切割粗壯嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根,生根困難的則在培養(yǎng)基中搭濾紙橋,胚狀體發(fā)育成小苗不經(jīng)生根階段，但

9、需壯苗生根,根、芽,四、外植體成苗途徑,胚狀體,根、芽,愈傷組織,芽、根,根,芽,外植體,試管苗,原球莖,根、芽,第三節(jié) 組培常見問題及對策,（一）污染的原因及預防 （二）褐變的原因及預防 （三）玻璃化的原因及預防 （四）其它(自學),（一）污染,含義：在組培過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。 1.污染原因：細菌、真菌為病源菌；污染途徑有外植體帶菌，培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底，操作人員未遵守操作規(guī)程，環(huán)境不清潔。,（一）污染,（1）防止材料帶菌：避免陰雨天在室外采集外植體；春秋組培；材料預培養(yǎng)。（2）嚴格外植體滅菌（3）接種用具滅菌徹底（4）嚴守無菌操作規(guī)程（5）保持培養(yǎng)室清潔,

10、2.預防措施,（一）污染,1.褐變的原因 （1）植物品種（基因型） （2）生理狀態(tài) （3）培養(yǎng)基成分 （4）培養(yǎng)條件 （5）材料轉(zhuǎn)移時間,（二）褐變的原因及預防,2.褐變的防止措施 （1）選擇適宜的外植體 （2）選擇合適的培養(yǎng)條件 （3）連續(xù)培養(yǎng) （4）加抗氧化劑（VC、PVP、牛血清、牛蛋白） （5）加0.10.5%活性炭,（二）褐變的原因及預防,（三） 玻璃化的原因及預防,1.含義： 離體培養(yǎng)物的嫩莖或葉呈半透明水漬狀。為生理失調(diào)癥。,2.原因：細胞過程中的環(huán)境變化引起。導致玻璃化的因素有以下幾方面：（1）激素濃度（尤其CTK）增加或CTKIAA高（2）瓊脂濃度低 （3）光照時間大于15h

11、（4）溫度低（5）通風條件不好（6）培養(yǎng)基離子種類及比例不適宜,（三） 玻璃化的原因及預防,3.預防措施：（1）適當控制培養(yǎng)基中無機鹽成分，適當提高蔗糖和瓊脂濃度，減少含氮化合物的用量，降低培養(yǎng)基的水勢。 （2）適當降低CTK和GA的濃度。考慮加入適當?shù)拿撀渌帷?（三） 玻璃化的原因及預防,3.預防措施：（3）增加自然光照，控制光照時間；增加容器通氣，控制溫度。（4）加入其他物質(zhì)（如活性炭、多效唑、CCC）。,（三） 玻璃化的原因及預防,第三節(jié) 試管苗增殖率的估算,Y=xn,年增殖率,全年增殖周期數(shù)n=365/每周期天數(shù),每周期增殖倍數(shù),例如：增殖周期為1個月，增殖倍數(shù)為3， 則年增殖率為312,第四節(jié)組培快繁的計劃安排,要確定（或限制）增殖瓶數(shù) 考慮每天增殖與生根的比例。試驗后確定，一般3：7。 快速繁殖由提高增殖倍數(shù)、縮短增殖周期，周年生產(chǎn)三因素決定。 實行有效的管理辦法，達到人力物力的協(xié)調(diào)，從而提高生產(chǎn)效率 苗數(shù)及其它指標的計算,1.存架增殖總瓶數(shù)（T）增殖周期內(nèi)工作日數(shù)W*每工作日需用的母株瓶數(shù)S 2.全年出瓶苗數(shù)（P）全年總工作日*平均每個工作日出瓶苗