1、第三講藥物蛋白質組學，1。藥物蛋白質組學：蛋白質組學在藥理學中的應用的概念和研究內容。藥物蛋白質組學：蛋白質組學和藥學的學科交叉并逐漸形成一個新的研究領域。研究內容：臨床前：發(fā)現(xiàn)所有可能的藥物作用靶點和針對這些靶點的所有可能的化合物，用蛋白質組學方法研究藥物作用機制和毒理學臨床研究：作為患者選擇有效藥物的依據(jù)和臨床診斷的標志，采用類似藥物遺傳學的方法，根據(jù)蛋白質譜對患者進行分類，給予個體化治療，預測藥物療效。運用比較蛋白質組學策略尋找與藥物作用相關的蛋白質；第二，研究藥物作用靶點，通過研究和比較疾病或藥物的差異蛋白表達譜，可以發(fā)現(xiàn)影響疾病或藥物的關鍵蛋白或生化途徑，進而綜合分析蛋白的生物學功能

2、，推測新的和潛在的藥物作用靶點?；钚孕》肿铀幬锼幬锇袠说闹苯影l(fā)現(xiàn)和確認：蛋白質組學技術，小分子藥物與蛋白質直接相互作用，如親和層析、酵母三雜交、蛋白質芯片、噬菌體展示技術、基于蛋白質活性的蛋白質組學方法和結構蛋白質組學技術等。研究藥物作用靶點的策略和方法，通過差異表達譜分析，發(fā)現(xiàn)基于活性的蛋白質譜(ABPP)、親和層析、直接分離活性小分子、結合蛋白、酵母三雜交系統(tǒng)、藥物靶點的鑒定、噬菌體展示技術，通過差異表達譜發(fā)現(xiàn)藥物靶點；2.基于活性的蛋白質譜(ABPP)分析，基于活性的探針(ABPs):設計有結合/反應基團和分析標簽(如熒光素)的探針分子僅結合蛋白質(酶)的活性形式，因此可以通過測量熒光能

3、量間接確定蛋白質活性。其優(yōu)點是蛋白質結合或蛋白質表達水平的測定被酶活性的測定所代替，PNAS 2002年8月6日第99卷第16期1033510340，自然422，226-232(2003年3月13日)。3.親和層析直接分離活性小分子的結合蛋白。其基本原理是活性小分子配體的一些官能團(羧基或氨基)通過連接臂與水不溶性載體(樹脂或瓊脂糖珠)連接作為固定相，制備親和吸附柱。然后，蛋白質提取物或細胞裂解物通過親和柱，未結合的蛋白質用緩沖溶液充分洗滌，與小分子配體親和結合的蛋白質留在柱上；最后，結合到親和柱上的蛋白質被干擾配體和目標蛋白質之間相互作用的條件溶液解吸(例如蛋白質變性溶液或與游離配體的競爭性

4、結合)。洗脫的蛋白質通常可以通過凝膠電泳進行鑒定，然后用質譜聯(lián)用儀進行分析，或者消化成肽，然后用液相色譜-質譜聯(lián)用儀或免疫分析法進行分析。Yamamoto等人通過連續(xù)親和層析成功分離并鑒定了免疫抑制劑FK506的特異性結合蛋白FKBP12。肛門生物化學。2006年5月1日；352(1):15-23。Bach等人通過相同的方法成功地鑒定出抗癌藥Roscovitine可以特異性結合多種細胞內激酶CDK5、ERK1和ERK2。生物化學。2005年9月2日；280(35):31208-19。4。酵母三雜交系統(tǒng)識別藥物靶標，酵母雙雜交系統(tǒng)廣泛用于研究蛋白質之間的相互作用。在此基礎上開發(fā)的酵母三雜交系統(tǒng)將

5、應用于蛋白質、蛋白質核糖核酸和蛋白質小分子化合物等更廣泛的研究領域。BD:脫氧核糖核酸結合結構域AD:轉錄激活結構域DHFR:二氫葉酸還原酶MTX:甲氨蝶呤，一個成功的例子，貝克爾等人首先通過連接臂共價連接CDK抑制劑purvalanol B和MTX聚乙二醇，然后將該化合物添加到酵母表達DHFR-BD融合蛋白和激酶cDNA文庫AD融合蛋白，以檢測報告基因的表達。鑒定了嘌呤醇B的已知靶蛋白CDK1、CDK5和CDK6。同時，在Chem Biol中還發(fā)現(xiàn)了新的激酶靶蛋白CDC/CDK樣蛋白CDC樣激酶3(CLK3)、PCTAIRE蛋白激酶1(PCTK1)和PCTK2、絲/蘇氨酸激酶p21(CDKN

6、1A)活化激酶4(PAK4)、核糖體蛋白S6激酶3(RSK3)、非受體酪氨酸激酶FYK和山口肉瘤癌基因(YES)、受體酪氨酸激酶ephrin受體。2004年2月；11(2):211-23 Licitra通過酵母三雜交系統(tǒng)成功地證實了fkbp12 (FK506結合蛋白)美國國家科學院學報1996年11月12日；93(23):12817-21。第三，藥物蛋白質組學在臨床診斷和治療中的應用可以篩選出疾病特異性蛋白，作為疾病分類和臨床診斷的標志，也可以作為評價藥物療效和預測疾病預后的依據(jù)，從而實現(xiàn)個體化藥物治療。1.尋找用于診斷的疾病特異性生物標志物，并預測疾病的預后和結果。蛋白質組學技術可以動態(tài)、完

7、整地觀察疾病發(fā)生過程中蛋白質種類和數(shù)量的變化。通過比較正常和疾病狀態(tài)下的蛋白質表達，可以識別疾病特異性生物標志物。生物標志物：一種客觀測量和評估的特征，作為正常生物過程、致病過程或對治療干預的藥理反應的指標。美國食品和藥物管理局草擬的用于疾病分期的藥物基因組學指導診斷工具疾病狀態(tài)的指標預測和/或監(jiān)測對干預的臨床反應，生物標記物，生物標記物是循證醫(yī)學的基礎-誰應該治療，如何治療，用什么治療。如果沒有新的標記物，在更有針對性的治療方面的進展將是有限的，并且治療將在很大程度上是經(jīng)驗性的。生物標記物的發(fā)展必須與治療一起加速。例如，(1)在顯微鏡觀察下使用激光恢復特定的細胞群。提取的蛋白質用熒光染料標記

8、，用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離。(三)通過散點圖評估2D-DIGE的再現(xiàn)性。3360將7個正常肝組織、11個鄰近的非腫瘤組織、6個高分化肝細胞癌和1個中分化HCC肝細胞癌歸為一組，而將13個中分化肝細胞癌和7個低分化肝細胞癌歸為一組。主成分分析也顯示了類似的結果(B)，在已鑒定的蛋白質中，EB1由c-Myc、RhoA和CDC42控制，而在以前的報告中，EB1都與HCC惡性腫瘤相關，2。為了評價藥物的療效，大多數(shù)藥物和疾病的目標是蛋白質?？梢哉J為，如果一種藥物能使疾病的蛋白質組學表現(xiàn)更接近正常狀態(tài)，該藥物的治療效果就更好。通過藥物蛋白質組學的研究，研究藥物的毒理機制，

9、監(jiān)測藥物毒性的生物標志物，可以準確、快速地揭示藥物的毒副作用。檢測藥物刺激組織細胞的蛋白質組，建立其蛋白質譜數(shù)據(jù)庫，有助于了解其毒理機制，建立可用于評價其安全性的生物標志物。例如，慶大霉素的明顯毒副作用是腎毒性。Kennedy等人用蛋白質組學研究了用慶大霉素處理的大鼠血清樣品，發(fā)現(xiàn)了一種持續(xù)高表達的蛋白質。該蛋白可能參與補體替代途徑的激活過程，并能與腎皮質上皮細胞結合，有望成為評價慶大霉素毒性的非侵入性標志物。毒物與疾病登記署，2001，120 (1.3) :379-384。四.癌癥多藥耐藥性的蛋白質組學研究：腫瘤細胞對一種化療藥物產生耐藥性后，也會對其他化療藥物產生不同程度的耐藥性，導致藥物

10、療效持續(xù)下降。多藥耐藥是化療成功的一個重要障礙，在癌細胞中發(fā)生的多藥耐藥通常是由于特定蛋白如細胞膜轉運蛋白的高表達引起的，多種已發(fā)表的藥物蛋白質組學研究提示了潛在的耐藥機制，(a)藥物測序，(b)PKC活性的調節(jié)，(c)細胞凋亡，和(d)米托蒽醌：米托蒽醌的調節(jié)；FABP :脂肪酸結合蛋白；硫氧還蛋白：-國內生產總值離解抑制劑；膜聯(lián)蛋白：Map :微管相關蛋白(微管相關蛋白)，通過蛋白質組學方法在對不同抗癌藥物、抗癌藥物： a米托蒽醌、B柔紅霉素、c依托泊苷、d阿霉素、e紫杉醇、f順鉑、g文克里斯汀和h抗有絲分裂化合物有抗性的癌細胞系中鑒定的蛋白質。根據(jù)蛋白質組表達譜預測抗腫瘤藥物的化療敏感性

11、，化療是腫瘤的三種主要治療方法之一。近30年來，雖然一些惡性腫瘤的化療有了明顯的改善，但大多數(shù)腫瘤，尤其是實體瘤的療效仍不理想。這與腫瘤的個體差異和多重耐藥性有關。如何選擇有效的藥物并進行個體化治療一直是化療的重點。傳統(tǒng)藥物敏感性試驗方法及其存在的問題，藥物敏感性試驗方法存在的問題，菌落形成法(HTCA)，標本可評價率低，只有4070。實驗周期長，檢測藥物需要2周以上，種類和數(shù)量有限，操作繁瑣，難以標準化，陽性預測值低，只有4060。四唑藍比色法靈敏度差，至少只能檢測500個細胞。范圍小，有效范圍在2.0以內。細胞毒性差異染色(DiC)有多種適用的標本類型。目前，它僅用于人類判斷血液腫瘤。難以推廣的樣品可評價率不高，僅有7080陽性預測值低，僅有7080，胸腺嘧啶核苷摻入法(3H-Td