1、,RNA 干 擾 技 術(shù),提綱,第一部分 RNA干擾理論基礎(chǔ) 一、RNA干擾概述 二、 RNA干擾的機理 第二部分 RNA干擾技術(shù)應(yīng)用 一、小干擾RNA(siRNA)序列設(shè)計 二、 siRNA的合成 三、 siRNA的轉(zhuǎn)染 第三部分 RNA干擾在中藥學上的應(yīng)用展望,一、RNA干擾概述,1、 RNA干擾定義 2、 RNA干擾簡介 3、 RNA干擾研究簡史,一些小的雙鏈RNA(siRNA)可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAi）。,1、 RNA 干擾定義,2、 RNA干擾簡介,RNAi的發(fā)現(xiàn)具有劃時代的意義，

2、它不僅深入揭示了細胞內(nèi)基因沉默的機制，而且它還是后基因組時代基因功能分析的有力工具，極大地促進了人類揭示生命奧秘的進程；此外， siRNA本身還是一種極具前景的基因靶向藥物，可廣泛地用于諸如癌癥等疾病的治療。鑒于siRNA技術(shù)的巨大意義與廣闊應(yīng)用前景，2002年美國科學雜志將其評為全球年度十大科學進展之首。,2006年的諾貝爾生理學獎獲得者：,Andrew Z. Fire Craig C. Mello,3、RNAi 研 究 史,20多年前，在對矮牽牛花（petunias）進行的研究中發(fā)現(xiàn)協(xié)同抑制現(xiàn)象cosuppression，導入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時都被抑制。,1995年，康奈爾大學的

3、研究生Su Guo（郭蘇）用 反義RNA阻斷線蟲基因表達的試驗中發(fā)現(xiàn)，反義和正義RNA都阻斷了基因的表達。結(jié)果出乎意料。；三年后，F(xiàn)ire等真正起作用的是微量雙鏈RNA（污染），注入雙鏈RNA到線蟲中發(fā)現(xiàn)比注入單鏈更有效，隨后發(fā)展了通過RNAi進行線蟲基因敲除的策略。,在果蠅的研究中同樣發(fā)現(xiàn)RNAi。通過顯微注射或者通過基因槍將dsRNA注入果蠅胚胎中能夠引發(fā)基因沉默。在過去的幾年中RNAi技術(shù)在果蠅的研究中成為一種反向遺傳工具，用于鑒定功能缺失表型。,2001年Elbashir等 Nature上首次報道通過21個核苷酸的siRNA成功地在哺乳動物培養(yǎng)細胞中誘導特異性基因沉默。隨后，在小鼠等多

4、種細胞中也取得了成功。,牽?；ǎ╬etunias） 協(xié)同抑制現(xiàn)象cosuppression，,線蟲的RNAi,（左）兩線蟲帶有含普遍性表達的GFP報告基因重組質(zhì)粒的 表達品系。 （右）喂食表達針對GFP的dsRNA的細菌后，整個蟲體GFP 信號消失（頭部區(qū)域有些神經(jīng)元對該效應(yīng)具有抗性)。,RNAi 機制 模式圖,在起始步驟，加入的dsRNA被Dicer酶切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段,在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex, or RISC）,激活的RISC通過堿基配對定位

5、到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上,激活RISC需要一個ATP依賴的將siRNA解雙鏈的過程,并在距離siRNA3端12個堿基的位置切割mRNA,Degradation of the target mRNA (引起靶標mRNA的降解), Inhibition of translation of the target mRNA (抑制靶標mRNA的翻譯), Silencing the gene transcription from the target promoter (引起靶標啟動子的轉(zhuǎn)錄沉默).,The targets of the RNAi-directed gene silencing （RNA干

6、擾指導的基因沉默的結(jié)果）：,第二部分 RNA干擾技術(shù)應(yīng)用,一、小干擾RNA(siRNA)序列設(shè)計 二、 siRNA的合成 三、 siRNA的轉(zhuǎn)染,確定目的基因 根據(jù)相對應(yīng)的核酸序列設(shè)計出 siRNA的序列 獲得siRNA 用siRNA轉(zhuǎn)染細胞 分析RNA干擾的效果,RNA干擾研究的一般流程,一、小干擾RNA(siRNA)序列設(shè)計,1、 siRNA的一般結(jié)構(gòu) 2、siRNA靶位點的選擇,siRNA的一般結(jié)構(gòu)： 哺乳動物：21-23bp dsRNA 非哺乳動物：長片段dsRNA,1、 siRNA的一般結(jié)構(gòu),如何選擇siRNA靶位點：,2、siRNA靶位點的選擇,2、研究結(jié)果顯示GC含量在30%50

7、%左右的siRNA要 比那些GC含量偏高的更為有效。,1、從轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列， 記錄跟每個AA 3端相鄰的19個核苷酸作為候選的 siRNA靶位點。,3、在設(shè)計siRNA時不要針對5和3端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響RISC結(jié)合mRNA,從而影響siRNA的干擾效果。,序列同源性分析：,將siRNA序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小 鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列 / EST同源的序列。例如進行BLAST搜索分析（ www.

8、/BLAST/）,選出合適的目標序列進行合成,并非所有符合條件的siRNA都一樣有效，其原因還不清楚，可能是位置效應(yīng)的結(jié)果，因此對于一個目的基因，一般要選擇3-5個靶位點來設(shè)計siRNA,設(shè)計陰性對照,通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查 結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性?；蛘哂胔ousekeeping genes 作對照.,補充：,Whitehead 研究所已研發(fā)了siRNA的自動選擇方法，并于 網(wǎng)站：/bioc/siRNA/home.php 上向公 眾開放這個軟件允許使用者定義序列基序和G/C含量， 并

9、自動在人和鼠的基因組數(shù)據(jù)庫中搜索siRNA序列，以 防錯配。,疑難解答：,假如siRNA不起作用，應(yīng)首先確定所使用的靶序列和細胞是 否來源于相同的組織。是否使用了錯誤的細胞系。 應(yīng)確定用于進行RNAi的siRNA雙鏈對選擇的mRNA序列是否 可靠的，因后者可能包含序列上的錯誤、突變（如在癌細胞 中）或存在多態(tài)性。,二、 siRNA的合成,1、化學合成 2、體外轉(zhuǎn)錄 3、用RNase 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA 4、體內(nèi)表達,1、化學合成,許多公司可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成34

10、對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。 最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究 不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素,雙鏈 RNA合成 非特異siRNA合成,2、體外轉(zhuǎn)錄,3、非特異性siRNA合成,大腸桿菌RNase III是一種識別雙鏈 RNA的內(nèi)切酶，產(chǎn)物為 3端外懸2-3個堿基的雙鏈短片段，與 Dicer在真核生物RNAi途徑中相同。利用RNase III 消化得到的siRNA混合物直接轉(zhuǎn)染細胞，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。,用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備

11、siRNA,Figure 2: siRNA production by ShortCut RNase III: (A) Varying amounts of ShortCut RNase III were incubated with 2 g of a 500 bp dsRNA for 20 minutes. (B)dsRNA fragments (1 kb and 175 bp) were digested with ShortCut RNase III. Digestswere analyzed by 20% TBE polyacrylamide gel electrophoresis.,

12、Figure 3: GFP Silencing in COS-7 Cells: COS-7 cells co-transfected with a plasmid expressing GFP in the absence (control) or the presence of 30ng (4 nM) of GFP siRNA prepared using the ShortCut RNAi Kit. Cells were photographed 48hours post-transfection.,siRNA表達載體在細胞中表達siRNAs 以PCR制備的siRNA表達框進行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄 利

13、用病毒系統(tǒng)實現(xiàn)體內(nèi)表達siRNA,4、體內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成 siRNA,優(yōu)點：不需要直接操作RNA,siRNA表達載體,BD Knockout RNAi vectors,siRNA表達框架(siRNA expresion casetes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模板，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。,siRNA表達框進行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄,表達框架包括：,一個RNA pol III啟動子,一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA,一個RNA pol III終止位點,優(yōu)點：SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到。SECs成為篩選siRNA最有效工具。,缺點：PCR產(chǎn)物

14、難以轉(zhuǎn)染入細胞、不適合大規(guī)模制備。,SiRNA 的 轉(zhuǎn) 染,RNAiFect Transfection Reagent siRNA 轉(zhuǎn)染專用試劑，使用簡單。,轉(zhuǎn)染方法： 1 磷酸鈣共沉淀; 2 電穿孔法; 3 DEAE-葡聚糖 4 機械法 5 陽離子脂質(zhì)體試劑,注意事項： 1 純化 siRNA ； 2 避免RNA酶污染 3 細胞培養(yǎng)和操作嚴格 4 避免使用抗菌素 5 選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑 6 合適的陽性對照 7 通過標記siRNA來優(yōu)化實驗,第三部分、RNAi技術(shù)在中藥學上的的應(yīng)用,一、 RNAi在證候-基因組研究中的應(yīng)用 二、 RNAi在中藥生產(chǎn)中的應(yīng)用,老子說:“萬物負陰而抱陽”；易經(jīng)說：“

15、一陰一陽謂之道”。,有過多的mRNA,siRNA就會與之結(jié)合,進而把它降解來完成機體的自穩(wěn)(陰陽的對立制約), mRNA的降解進而又轉(zhuǎn)換成siRNAs以繼續(xù)執(zhí)行功能(陰陽的相互轉(zhuǎn)化),siRNAs和mRNA互根互用、消長平衡來完成機體的自穩(wěn)及清除外來的病原體。,siRNA（陰）,mRNA（陽）,一、RNAi在證候-基因組研究中的應(yīng)用,證候研究是中醫(yī)科學研究的重點和難點,也是制約中醫(yī)發(fā)展的頸瓶。人類基因組學研究的方法學內(nèi)容與中醫(yī)學的整體觀、辨證觀有許多相似之處。在微觀水平的基因調(diào)控與修飾,反映著生命機體的整體功能狀態(tài),基因組的多樣性高度強調(diào)了每個人的基因特異性。因此如何揭示證的本質(zhì),如何把證候和

16、現(xiàn)代科學聯(lián)系起來是值得中醫(yī)研究者去思考的。,一、RNAi在證候-基因組研究中的應(yīng)用 廣州中醫(yī)藥大學脾胃研究所通過基因芯片研究,篩選出了脾氣虛證核糖體蛋白下調(diào)基因RPS20、RPS29、RPL35、RPL27;同時也進行了脾氣虛證異病同證差異基因研究,通過收集潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)脾氣虛證及濕熱證患者結(jié)腸病變黏膜,制作核糖體蛋白的低密度芯片,篩選出多條下調(diào)基因。證候基因組學的深入發(fā)展必然要求對這些基因的功能進行綜合評價,尋找其中的關(guān)鍵基因,并明確差異基因相互作用的關(guān)系,對證候本質(zhì)進行深入研究。,一、RNAi在證候-基因組研究中的應(yīng)用 因此,在此基礎(chǔ)上,該所采用RNAi技術(shù)在IEC-6細胞上對脾虛證關(guān)鍵基因RPS20的功能進行了鑒定。結(jié)果提示,干擾IEC-6細胞RPS20后,細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,細胞遷移、增殖能力受到抑制,表明小腸上皮細胞可能存在著消化吸收功能低下及黏膜修復(fù)減慢趨勢。此結(jié)果說明了RPS20可能在脾虛證發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。,RNA 干擾是一種新型反義技術(shù), 即把dsRNA 導入細胞引起同源mRNA 降解， 可抑制特異基因的表達, 對藥用植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑進行調(diào)控, 達到調(diào)控天然產(chǎn)物生物合成的目的. 張蔭麒利用反義DNA或RNA 片段導入亞麻植物毛狀根中抑制肉桂醇脫氫酶活性,