1、侵襲性真菌病臨床實(shí)驗(yàn)室診斷操作規(guī)范,本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草 本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會(huì)提出 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院、北京大學(xué)第一醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院。 本標(biāo)準(zhǔn)起草人：徐英春、李若瑜、章強(qiáng)強(qiáng)、王瑤、王賀、余進(jìn)、郭莉娜、張麗、范欣。,2,侵襲性真菌病臨床實(shí)驗(yàn)室診斷操作規(guī)范概述,本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了侵襲性真菌病臨床實(shí)驗(yàn)室診斷操作規(guī)范、包括標(biāo)本采集處理、形態(tài)檢查、培養(yǎng)檢查、真菌培養(yǎng)鑒定、非培養(yǎng)診斷方法和藥物敏感試驗(yàn)。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于具有級(jí)生物安全防護(hù)能力的臨床實(shí)驗(yàn)室。,3,術(shù)語和定義,4,1. 侵襲性真菌病 IFD,指真菌侵入人體組織、血液，并在其中

2、生長繁殖所致組織損害、器官功能障礙、炎癥反應(yīng)的病理改變及病理生理過程。根據(jù)患者宿主因素、臨床特征和微生物學(xué)檢查、將IFD診斷分為確診(proven)、擬診(probable)和疑似(possible)。,5,2. 最小抑菌濃度 MIC,按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行體外真菌稀釋法或連續(xù)濃度梯度稀釋法藥物敏感性試驗(yàn)時(shí)，在特定培養(yǎng)時(shí)間及溫度的條件下，能導(dǎo)致特定程度肉眼可見真菌生長抑制的最低藥物濃度。,6,3. 劑量依賴敏感 S-DD,給予高于常規(guī)給藥劑量，且達(dá)到最大血藥濃度時(shí)，臨床有效。,4. 最低有效濃度 MEC,指曲霉在含系列濃度的棘白菌素類藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，與生長對(duì)照孔中的菌絲形態(tài)相比，菌絲變短、

3、變圓、變粗的最低藥物濃度。,7,5. 折點(diǎn) breakpoint,臨床上能抗菌藥物對(duì)真菌分為敏感、耐藥、中介或劑量依賴敏感的特定MIC值。 折點(diǎn)系綜合體外的MIC值、耐藥機(jī)制、 抗菌藥物PK/PD參數(shù)及臨床療效而得出，還可能隨環(huán)境改變而改變（如感染部位、常規(guī)給藥劑量的改變、給藥途徑及頻次的改變） 。,8,6. 消化液 lysis solution,粘液溶解作用，用于呼吸道標(biāo)本等的前處理，常用N-乙酰-L-半胱氨酸、 5%草酸或二巰基蘇糖醇等。,9,標(biāo)本采集及處理,10,采集部位消毒,一步法： 葡萄糖酸氯己啶作用 30s，或 70%異丙醇消毒后自然干燥。,三步法： (1) 70%乙醇擦拭靜脈穿刺

4、部位，作用 30s 以上、待干； (2) 1%-2%碘酊從穿刺點(diǎn)向外畫圈消毒至消毒區(qū)域直徑3cm，作用 30 s 或 10 %碘伏作用 60 s； (3) 70 %乙醇脫碘：對(duì)碘過敏者， 用70%乙醇消毒 60s，待乙醇揮發(fā)干燥、采集標(biāo)本。,11,血液標(biāo)本采集,推薦在抗真菌藥物使用前，發(fā)熱初期或寒顫期、采靜脈血或骨髓液。 立即注入血培養(yǎng)瓶內(nèi)并輕輕搖勻。至少采集 2 套。 標(biāo)本與培養(yǎng)基比例為 1/10-1/5（成人每瓶 8-10ml）、必須包括需氧瓶或真菌瓶。,12,血液標(biāo)本處理,2h 內(nèi)常溫送檢。若不能及時(shí)送檢，則常溫保存。,2h 內(nèi)常溫送檢,不能送檢時(shí)，常溫保存,13,評(píng)估導(dǎo)管相關(guān)性血流感染

5、（ CRBSI）,如患者已拔管，應(yīng)采集 2 套外周血進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)做導(dǎo)管尖 Maki 法半定量培養(yǎng)（導(dǎo)管尖長 5cm），如 1 套及以上外周血培養(yǎng)陽性，導(dǎo)管尖培養(yǎng)陽性（ 15 CFU），且血培養(yǎng)與導(dǎo)管尖培養(yǎng)菌種相同，即為 CRBSI。 如患者尚未拔管，應(yīng)至少采集 1 套外周血培養(yǎng)，同時(shí)盡快采集等量的導(dǎo)管血進(jìn)行培養(yǎng)，如導(dǎo)管血與外周血培養(yǎng)均陽性，導(dǎo)管血陽性時(shí)間比外周血早 2h，或?qū)Ч苎芯繛橥庵苎芯?5 倍以上，且沒有其它明確感染源，即為 CRBSI；如導(dǎo)管血培養(yǎng)陰性，外周血培養(yǎng)陽性且為念珠菌屬，且沒有其它明確感染源，也可能為 CRBSI。,14,骨髓標(biāo)本采集,使用肝素化的注射器或溶解離心管

6、采集骨髓液 0.5ml（兒童）至 3ml（成人）后送檢。,一次性骨穿包,骨穿操作,采集足量骨髓液送檢,15,骨髓標(biāo)本處理,15 分鐘內(nèi)常溫送檢。若不能及時(shí)送檢，則常溫保存。,不建議常規(guī)做骨髓液培養(yǎng)，如需培養(yǎng)可將骨髓液接種于培養(yǎng)瓶，但易出現(xiàn)假陽性。骨髓液需同時(shí)做吉姆薩染色鏡檢。,15分鐘內(nèi)常溫送檢,骨髓涂片 （吉姆薩染色鏡檢）,16,靜脈導(dǎo)管標(biāo)本采集,剪取導(dǎo)管尖段 5cm 置于無菌容器中送檢。,導(dǎo)管尖段 5cm,無菌容器,送檢,17,靜脈導(dǎo)管標(biāo)本處理一,15分鐘內(nèi)常溫送檢。若不能及時(shí)送檢，則4C保存。,15分鐘內(nèi)常溫送檢,4C保存,18,靜脈導(dǎo)管標(biāo)本處理二,將導(dǎo)管置于血平板上，使用無菌鑷子將其從

7、平板一端滾動(dòng)至另一端，滾動(dòng)4次，做導(dǎo)管尖Maki法半定量培養(yǎng)。不要使用含放線菌酮的培養(yǎng)基。,19,無菌體液（腦脊液、心包液、腹水和關(guān)節(jié)液）標(biāo)本采集,除腦脊液外，將其余的無菌體液置于含肝素的無菌真空采血管。腦脊液使用脊髓穿刺針采取后送檢。,20,無菌體液（腦脊液、心包液、腹水和關(guān)節(jié)液）標(biāo)本處理一,15 分鐘內(nèi)常溫送檢。 若不能及時(shí)送檢，則常溫保存（不能冷藏）。,15min 內(nèi)常溫送檢,不能送檢時(shí)，常溫保存,21,標(biāo)本大于 2ml，則 2000g 離心10 分鐘，取沉渣接種。 若標(biāo)本量少于 2ml，則將標(biāo)本直接接種于培養(yǎng)基。 推薦使用細(xì)胞離心機(jī)對(duì)無菌體液進(jìn)行涂片鏡檢。腦脊液可直接接種于血培養(yǎng)瓶。,

8、無菌體液（腦脊液、心包液、腹水和關(guān)節(jié)液）標(biāo)本處理二,22,膿液、引流液、創(chuàng)面分泌物及竇道標(biāo)本采集,開放性創(chuàng)口：用無菌生理鹽水沖洗創(chuàng)面后，應(yīng)采集病灶活動(dòng)性邊緣組織標(biāo)本。,封閉性膿腫：局部皮膚消毒后用注射器抽取膿血性液體送檢。,23,膿液、引流液、創(chuàng)面分泌物及竇道標(biāo)本處理,2h 內(nèi)常溫送檢。將標(biāo)本直接接種于培養(yǎng)基。較濃稠的標(biāo)本需使用消化液處理。,2h 內(nèi)常溫送檢,直接接種于培養(yǎng)皿,24,下呼吸道標(biāo)本（深部痰液、支氣管吸取物、肺泡灌洗液）標(biāo)本采集,清潔口腔后采集清晨第一口痰液。采用外科方法進(jìn)行支氣管毛刷取樣和采集肺泡灌洗液。唾液或24h 痰液都不能用來進(jìn)行真菌培養(yǎng)。,25,下呼吸道標(biāo)本（深部痰液、支

9、氣管吸取物、肺泡灌洗液）標(biāo)本處理,2h 內(nèi)室溫送檢；若不能及時(shí)送檢，則 4C 保存。將標(biāo)本接種至含抗生素的選擇培養(yǎng)基中。較黏稠的下呼吸道標(biāo)本需要使用消化液處理，并 2000g 離心 10 分鐘后取沉渣接種。,2h 內(nèi)常溫送檢,4C保存,26,眼（角膜刮片、玻璃體液等）標(biāo)本采集及處理,角膜刮片或針吸玻璃體液。 15 分鐘內(nèi)常溫送檢。若不能及時(shí)送檢，則常溫保存。角膜刮片直接接種至不含抑制劑的培養(yǎng)皿中，采用 X 或 C 型涂菌方式，玻璃體液離心后取沉淀物接種。,15min 內(nèi)常溫送檢,不含抑制劑的培養(yǎng)皿 接種培養(yǎng),27,組織標(biāo)本采集、處理,采集標(biāo)本后用無菌容器轉(zhuǎn)運(yùn)，如標(biāo)本量較少，需滴加幾滴無菌鹽水保

10、濕。,及時(shí)送檢，否則室溫保存。采用滅菌眼科剪將組織標(biāo)本剪成米粒大小后接種培養(yǎng)；若可疑組織胞漿菌感染、研磨組織并培養(yǎng)，或采用裂解離心技術(shù)處理。若可疑接合菌感染、直接接種不研磨組織。直接鏡檢需研磨組織，但會(huì)影響絲狀真菌培養(yǎng)陽性率。建議病理科與檢驗(yàn)科聯(lián)合檢查組織標(biāo)本。組織標(biāo)本最好接種到包含抗生素和血培養(yǎng)基中。,28,尿液標(biāo)本采集、處理,采集早晨第一次清潔尿液、恥骨上聯(lián)合穿刺尿液或?qū)Ч苣蛞?10-50ml， 不要采用 24h 尿液。,2h 內(nèi)常溫送檢；若不能及時(shí)送檢， 則 4C 保存。 尿液接種前需要 2000g 離心 10 分鐘，取沉渣進(jìn)行鏡檢和接種。 尿液真菌培養(yǎng)不推薦定量檢測(cè)。,29,判定不合格

11、標(biāo)本,a) 標(biāo)本標(biāo)識(shí)與申請(qǐng)單不符，標(biāo)識(shí)錯(cuò)誤或沒有標(biāo)識(shí)；b) 未采用無菌容器或容器選擇不恰當(dāng)；c) 標(biāo)本采集未按規(guī)定消毒或清潔創(chuàng)口；d) 標(biāo)本采集量過少；e) 標(biāo)本保存方式不恰當(dāng)或保存時(shí)間超過規(guī)定；f) 血培養(yǎng)瓶中有凝塊；g) 血培養(yǎng)瓶破碎、滲漏或過有效期；h) 血培養(yǎng)瓶數(shù)不夠；i) 稀薄唾液或低倍鏡下上皮細(xì)胞數(shù)大于 10 個(gè)；j) 尿液采集未清洗會(huì)陰部及尿道口。,30,參 考 文 獻(xiàn)：1 秦啟賢主編：臨床真菌學(xué). 復(fù)旦大學(xué)出版社， 2001.2 王端禮主編：醫(yī)學(xué)真菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范. 人民衛(wèi)生出版社， 2005.3 吳紹熙主編：現(xiàn)代醫(yī)學(xué)真菌檢驗(yàn)手冊(cè)（第二版） . 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社， 20

12、05.4 周庭銀，倪語星。臨床微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作. 上海科學(xué)技術(shù)出版社， 2009.5 周庭銀. 臨床微生物學(xué)診斷與圖解（第三版） . 上海科學(xué)技術(shù)出版社， 2012.6 James V. Manual of Clinical Microbiology M, 10th ed. Washington, DC: ASM Press, 2011.7 Sybren de Hoog, Guarro J, Gene J, et al. Atlas of clinical fungi M. CBS,Electronic Version 3.1, 2011.8 CLSI, Clinical and Labo

13、ratory Standards Institute, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, 2009, M27-A3, vol.28, No14.9 CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, 2012, M27-S4, vol.28, No15.10

14、CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi, 2009, M38-A2, vol.28, No16.11 CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute, principles and procedures for blood cultures; approved guideline, 2009, M47-A2, vol.28, No16.12 EUCAST.The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing.Brea