1、精選文檔在分子克隆實驗中，有時我們會在待擴增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點，用于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。由于直接暴露在末端的酶切位點不容易直接被限制性核酸內(nèi)切酶切開，因此在設(shè)計PCR引物時，人為的在酶切位點序列的5端外側(cè)添加額外的堿基序列，即保護堿基，用來提高將來酶切時的活性。添加保護堿基，需要考慮兩個因素：一是堿基數(shù)目，一是堿基種類。添加保護堿基時，最關(guān)心的應(yīng)該是保護堿基的數(shù)目，而不是種類。什么樣的酶切位點，添加幾個保護堿基，是有數(shù)據(jù)可以參考的，見附表。添加什么保護堿基，如果嚴格點，是根據(jù)兩條引物的Tm值和各引物的堿基分布及GC含量。如果某條引物Tm值偏小，GC%較低，添加時多加G或C，

2、反之亦反。保護堿基列表EnzymeOligo Sequence Chain Length % Cleavage 2 hr 20 hr AccIGGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 12 0 0 0 0 0 0 AflIIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 8 10 12 0 90 90 0 90 90 AscIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 90 90 90 90 90 90 AvaICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 8 10 12 50 90

3、 90 90 90 90 BamHICGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 8 10 12 10 90 90 25 90 90 BglIICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 8 10 12 0 75 25 0 90 90 BssHIIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 0 0 50 0 0 90 BstEIIGGGT(A/T)ACCC 9 0 10 BstXIAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGG

4、ATGCAT 22 24 27 0 25 25 0 50 90 ClaICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 8 8 10 12 0 0 90 50 0 0 90 50 EcoRIGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG 8 10 12 90 90 90 90 90 90 HaeIIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA 8 10 12 90 90 90 90 90 90 HindIIICAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG 8 10 12 0 0 10 0 0 75 K

5、pnIGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 8 10 12 0 90 90 0 90 90 MluIGACGCGTC CGACGCGTCG 8 10 0 25 0 50 NcoICCCATGGG CATGCCATGGCATG 8 14 0 50 0 75 NdeICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC 8 10 12 18 20 22 0 0 0 0 75 75 0 0 0 0 90 90 NheIGGCTAGCC

6、CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG 8 10 12 0 10 10 0 25 50 NotITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 12 16 20 24 28 0 10 10 25 25 0 10 10 90 90 NsiITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 12 22 10 90 90 90 PacITTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG 8 10

7、12 0 0 0 0 25 90 PmeIGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG 8 10 12 24 0 0 0 75 0 25 50 90 PstIGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 8 14 22 24 26 0 10 90 90 0 0 10 90 90 0 PvuICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA 8 10 12 0

8、10 0 0 25 10 SacICGAGCTCG 8 10 10 SacIIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA 8 12 0 50 0 90 SalIGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 28 30 32 0 10 10 0 50 75 ScaIGAGTACTC AAAAGTACTTTT 8 12 10 75 25 75 SmaICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 6 8 10 12 0 0 1

9、0 90 10 10 50 90 SpeIGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG 8 10 12 14 10 10 0 0 90 90 50 50 SphIGGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT 8 12 14 0 0 10 0 25 50 StuIAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT 8 10 12 90 90 90 90 90 90 XbaICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG 8 10 12 14 0 90 75 75 0 90 90 90 Xho