1、1,PD-1/PD-L1信號通路阻斷劑的研究,報告人： 張杰 指導導師：張雙全教授,2,1.前言,2.立題依據(jù)和意義,6. 已有進展,5. 進度安排,4. 研究設想及方法,開題報告,3. 國內(nèi)外研究進展,3,前言,腫瘤逃逸是目前腫瘤免疫治療公認的障礙?；颊吣[瘤細胞自身的缺陷和免疫系統(tǒng)的功能障礙一起作用促進了腫瘤的瘋狂生長。T細胞在免疫治療腫瘤的過程中處于中心地位，如果能調(diào)動體內(nèi)的殺傷武器，那將是最有效的也是最安全的治療腫瘤的途徑。 腫瘤的免疫逃逸機制與機體對腫瘤的免疫應答之間存在著極為復雜的關系。腫瘤免疫治療的過程中早期腫瘤特異性的CD8+T細胞是激活的，隨著腫瘤生長到后期失去了殺傷的功能；I

2、FN-r的分泌功能持續(xù)增強，腫瘤產(chǎn)生抵抗力。總而言之，無論是通過調(diào)節(jié)因子還是免疫細胞的修飾都是為了極大限度的提高病人自身的免疫系統(tǒng)反應。不但要在體內(nèi)激活原有自身的免疫系統(tǒng)反應，還要讓已經(jīng)調(diào)動的反應持續(xù)增強才是免疫治療腫瘤的策略。 T細胞的活化除了需要通過APC遞呈MHC-抗原肽給抗原特異性T細胞提供第一信號外，還需要一系列協(xié)同刺激分子提供第二信號，進而才能使T細胞達到生理活化閾值產(chǎn)生正常的免疫應答，這在理論上更好地解釋了免疫系統(tǒng)對自身和非自身抗原產(chǎn)生免疫學應答時精確而微妙的調(diào)節(jié)機制。如果缺少共刺激分子提供的第二信號，將會導致T細胞的無反應性或特異性免疫耐受甚至進入凋亡，因此，正性和負性協(xié)同刺激

3、信號的調(diào)節(jié)及兩者之間的平衡在極體免疫應答的整個過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。,4,立題依據(jù)及意義,PD-L1(B7-H1)屬于B7家族，具有IgV和IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)及胞漿區(qū)尾部，PD-L1與其T細胞上的受體PD1相互作用，在免疫應答的負性調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用；該分子具有廣泛的組織表達譜，在一些腫瘤細胞系上有較高的表達，許多研究均表明其與腫瘤的免疫逃逸機制相關。腫瘤部位的微環(huán)境可誘導腫瘤細胞上的PD-L1的表達，且表達廣泛，表達的PD-L1有利于腫瘤的發(fā)生和生長，誘導抗腫瘤T細胞的凋亡。轉(zhuǎn)染PD-L1基因的P815腫瘤細胞系在體外可抵制特異性CTL的裂解，將其接種小鼠體內(nèi)后具有更強的致瘤性和侵襲

4、性。這些生物學特性均可通過阻斷PD-L1而逆轉(zhuǎn)。敲除PD1基因的小鼠，阻斷PD-L1/PD-1通路，則接種腫瘤細胞不能形成腫瘤。 通過阻斷PD-L1/PD-1信號通路可有效抑制腫瘤生長，可根據(jù)此設計新的對腫瘤免疫逃逸的治療方案，來加強T細胞對腫瘤的殺傷作用。,5,國內(nèi)外研究進展-PDL1在腫瘤中的表達,PD1（programmed death-1）最初是在凋亡的T細胞雜交瘤中得到的，由于其和細胞凋亡相關而被命名為程序性死亡-1受體。 目前，PD-1的配體被證實有兩個，分別是PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC).PD-L1蛋白廣泛表達于抗原提呈細胞（APCs）、活化T、B細胞、巨噬

5、細胞、胎盤滋養(yǎng)層、心肌內(nèi)皮和胸腺皮質(zhì)上皮細胞。在許多人類腫瘤組織中均可檢測到PD-L1蛋白的表達，且許多癌組織較正常組織中的PD-L1表達水平明顯上調(diào)。應用免疫組織化學方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤等人類腫瘤組織中檢測到PD-L1蛋白的表達，且PDL1的表達水平和患者的臨床及預后緊密相關。,6,國內(nèi)外研究進展-PD1/PDL1在腫瘤免疫治療中的作用,在抗腫瘤免疫中，通常遵循腫瘤特異性T細胞活化、T細胞增值、腫瘤浸潤和T細胞記憶應答加強的步驟。研究表明，腫瘤細胞以及腫瘤微環(huán)境中的APCs表達的PD-L1均可經(jīng)PD-1/PD

6、-L1信號通路抑制腫瘤抗原特異性T細胞的活化，下調(diào)T細胞介導的腫瘤免疫應答。因此，干預PD-1/PD-L1信號有望成為腫瘤免疫治療的新策略。 PD-L1單抗能有效抑制局部腫瘤生長； 阻斷PD-1/PD-L1信號可以促進腫瘤抗原特異性T細胞的增值，發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用； 阻斷腫瘤細胞上相關PD-L1信號可上調(diào)浸潤CD8T細胞IFN-R的分泌，表明PD-1/PD-L1信號通路的阻斷在以誘導免疫應答為目的的腫瘤免疫應答中發(fā)揮作用； 選擇抗PD-L1單抗配合腫瘤疫苗進行腫瘤免疫治療可有效加強腫瘤疫苗的免疫激活作用，減弱腫瘤微環(huán)境對療效的影響；,7,研究設想及方法,8,研究設想及方法,表達可溶性PD1

7、與腫瘤細胞上過度表達的PDL1結(jié)合； 利用單鏈抗體庫篩選與PDL1特異性結(jié)合的SCFV； 利用多肽庫篩選與PDL1特異性結(jié)合的多肽； SCFV或多肽阻斷PD1/PDL1通路機理的研究；,9,PD-L1/PD-1相關蛋白的表達鑒定,已有報道PD-1和PD-L1在原核中以包涵體形式表達，為了獲得可溶性的PD-1和PD-L1；我們擬采用sumo標簽融合表達PD-1和PD-L1，以期獲得可溶性表達；鎳柱純化，sumo酶酶切，再鎳柱純化獲得與天然氨基酸相同的PD-1和PD-L1；以備單鏈抗體及多肽的篩選實驗； 采用酵母表達系統(tǒng)來表達純化PD1-IgG，來阻斷PD-1/PD-L1通路；,10,PDL1的單

8、鏈抗體SCFV的篩選,利用噬菌體展示技術從高容量半合成人抗體文庫中篩選PDL1的特異性的且具有封閉PDL1生物學活性的單鏈抗體片斷(scFv)； 采用酵母表達系統(tǒng)來表達純化SCFV-FC，來研究是否能阻斷PD-1/PD-L1通路； 利用SCFV與PDL1的高親和力，研究能否融合毒素靶向殺傷高表達PDL1蛋白的腫瘤細胞；,11,PDL1特異性結(jié)合多肽的篩選,利用NEB 7/12-mer多肽文庫；篩選與PDL1特異性結(jié)合的多肽；研究其與PDL1的結(jié)合能力，能否與其受體PD1競爭性結(jié)合的能力；能否成開發(fā)成為一種阻斷PD1/PDL1信號通路的多肽藥物；,12,SCFV或多肽阻斷PD1/PDL1通路機理

9、的研究,T細胞活力的增強：流式細胞儀檢測活化狀態(tài)T細胞(CD44+)的數(shù)量是否增加； 細胞因子數(shù)量的增加：ELISA檢測IFN-r、IL-10等細胞因子的表達量是否提高； 腫瘤位置T細胞數(shù)目的增加：免疫組化方法檢測活化T細胞是否在腫瘤位置聚集以發(fā)揮其殺傷作用；,13,進度安排,研究生一年級上學期：專業(yè)課的理論學習； 研究生一年級下學期：閱讀大量的專業(yè)文獻，獲取PD1/PDL1基因； 研究生二年級上學期 ：完成PD1、PDL1及相關基因的蛋白表達純化鑒定 ； 研究生二年級下學期：完成PDL1結(jié)合SCFV及多肽的篩選工作，并對其活性進行初步的鑒定； 研究生三年級上學期 ：完成SCFV或多肽阻斷PD1/PDL1通路機理的研究； 研究生三年級下學期 ：撰寫畢業(yè)論文，準備答辯。,14,已有進展-PD1表達,Fig.1. SDS-PAGE of SUMO-PD1 expression Lane 1: uninduced Lane 2: