1、實驗六 原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng),【實驗?zāi)康摹?1. 學(xué)習(xí)植物細(xì)胞原生質(zhì)體分離純化的方法。 2. 了解原生質(zhì)體活性鑒定的原理。,【實驗原理】,植物原生質(zhì)體(protoplast)是除去細(xì)胞壁后 為原生質(zhì)所包圍的“裸露細(xì)胞”,是開展基礎(chǔ)研 究的理想材料。其中,酶解法分離原生質(zhì)體是一個常用的技術(shù),其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維 素、半纖維素和果膠質(zhì)組成,因而使用纖維素 酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成分,除 去細(xì)胞壁,即可得到原生質(zhì)體。由于原生質(zhì)體內(nèi) 部與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細(xì)胞膜,必須 保持在滲透壓平衡的溶液中才能保持其完整性。 其次,還應(yīng)當(dāng)考慮取材、酶的種類和純度、酶液 的滲透壓、酶解時間

2、及溫度等因素對分離原生質(zhì) 體的影響。,測定原生質(zhì)體的活性有多種方法。熒光素雙 醋酸酯(FDA)染色是常用的一種方法,FAD 本身無熒光,無極性,可透過完整的原生質(zhì)膜。 一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后,由于受到酯酶分解而產(chǎn)生 具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。它不能自由出入原 生質(zhì)膜,因此有活力的細(xì)胞能產(chǎn)生熒光,無活力 的原生質(zhì)體不能分解FAD無熒光產(chǎn)生。,【實驗材料和用具】,材料：菊花花瓣愈傷組織或煙草幼苗葉片等。 用具：過濾器，注射筒，不銹鋼網(wǎng)篩，漏斗，燒杯，滴管，10ml刻度離心管，血球記數(shù)板等。,【實驗材料】,材料：煙草幼苗葉片或菊花花瓣愈傷組織等。,【實驗儀器和用具】,儀器和用具：搖床、離心機、顯微鏡、過

3、濾器，注射筒，不銹鋼網(wǎng)篩，漏斗，燒杯，滴管，10ml刻度離心管，血球記數(shù)板等。,【實驗試劑】,(1)酶解液：2%(WV) 纖維素酶,1% (WV)果膠酶,0.6molL甘露醇;3.5mmol/L CaCl2.2H2O,0.7mmol/L KH2PO4,pH 5.6。 (2) 洗滌液： 0.6molL甘露醇;3.5mmol/L CaCl2.2H2O,0.7mmol/L KH2PO4,pH 5.6 (3)0.02%二乙基熒光素(FDA):5mgFDA溶于1ml丙酮中,避光4下貯存,使用 時取0.22mlFDA貯存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中.使用時,使最終濃度為0.01%。 (4) DP

4、D培養(yǎng)基,【實驗內(nèi)容】,(1)取充分展開的葉片,用自來水沖洗干凈。 (2)在超凈工作臺上,葉片用0.1升汞溶 液中浸泡滅菌10min(中間搖動幾次)。取出葉片,無菌蒸餾水漂洗5次。 (3)將葉片放入大培養(yǎng)皿中,吸去水分,葉背面朝上,用無菌鑷子小心撕去下表皮,或用解剖刀將葉片切成0.5mm寬的小條。 (4)另取1個培養(yǎng)皿或帶蓋的三角瓶,加入酶解液10mL,放葉片約2g,浸泡。 (5)在28C保溫36h,中間輕輕搖動23次。,(6)用200目篩網(wǎng)過濾酶解液,濾液經(jīng) 600g離心5min,使原生質(zhì)體沉淀下來。 (7)用移液管吸去上清液,將沉淀的原生質(zhì)體懸浮在0.2molL CaCl22H20 2mL

5、中。 (8)用注射器(裝上長針頭)向離心管底部緩緩注入20蔗糖6mL,在600g離心5min。 這時,在兩相溶液的界面之間出現(xiàn)一層純凈的完整原生質(zhì)體,雜質(zhì)和碎片都沉到管底。 (9)取原生質(zhì)體提取液1滴于載玻片上,加入相同體積的 0.02FDA稀釋液,靜置5 min 后,于熒光顯微鏡下觀察,發(fā)綠色熒光的為有活力的原生質(zhì)體,沒有產(chǎn)生熒光的原生質(zhì)體無活力。,23周齡愈傷組織和葉片各約1g和0.5g，葉片剪成細(xì)條,加入到酶液中、用鑷子分散愈傷組織,黑暗、 25酶解36小時，間歇輕輕搖動。,愈傷組織和葉肉原生質(zhì)體分離,過濾和離心洗滌原生質(zhì)體,過濾,800rpm離心3min,棄上清液,加入3ml CPW培養(yǎng)基，用滴管重新懸浮原生質(zhì)體,800rpm離心3min,棄上清液,重新懸浮在0.5ml CPW溶液中,【實驗報告】,分別述說你觀察到的三張臨時裝片的結(jié)果,你認(rèn)為此種分離與純化原生質(zhì)體的方法如何,有無可改