1、第三章 顯微鏡首 頁基本要求重點難點講授學時內容提要1 基本要求 1.1了 解(1) 了解顯微鏡技術的產生和發(fā)展現狀(2) 了解光學顯微鏡的常見故障及其排除方法1.2 熟 悉(1) 熟悉臨床常用顯微鏡的臨床應用(2) 熟悉光學顯微鏡的維護、調試與使用方法(3) 熟悉掃描隧道顯微鏡的基本原理及特點(4) 熟悉電子顯微鏡的臨床應用1.3 掌 握(1) 掌握光學顯微鏡的性能參數、基本原理和基本結構(2) 掌握常用顯微鏡的基本原理、結構和特殊部件(3) 掌握電子顯微鏡的類型和組成(4) 掌握透射和掃描電子顯微鏡的基本原理及特點。2 重點難點2.1重 點(1) 光學顯微鏡的光學參數、基本原理和基本結構(

2、2) 臨床常用顯微鏡的基本原理、結構和特殊部件(3) 臨床常用顯微鏡的性能、用途(4) 光學顯微鏡的調試與使用方法(5) 電子顯微鏡的類型和組成(6) 透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、掃描隧道顯微鏡的基本原理及特點2.2 難點(1) 臨床常用顯微鏡的基本原理、結構和特殊部件(2) 光學顯微鏡的性能參數(3) 透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、掃描隧道顯微鏡的基本原理及特點3 講授學時建議1012學時4 內容提要 4.1光學顯微鏡4.1.1 光學顯微鏡的工作原理 光學顯微鏡是利用光學原理，把人眼所不能分辨的微小物體放大成像，供人們提取物質微細結構信息的光學儀器。顯微鏡是由兩組會聚透鏡組成的光學折射

3、成像系統(tǒng)。把焦距較短、靠近觀察物、成實像的透鏡組稱為物鏡（object lens），而焦距較長，靠近眼睛、成虛像的透鏡組稱為目鏡（ocular lens）。而相對于物鏡的成像條件及最后二次成像于觀察者的明視距離等條件的滿足是通過儀器的機械調焦系統(tǒng)來實現的。被觀察物體位于物鏡的前方，被物鏡作第一級放大后成一倒立的實像，然后此實像再被目鏡作第二級放大， 得到最大放大效果的倒立的虛像，位于人眼的明視距離處。4.1.2 光學顯微鏡的基本結構光學顯微鏡的基本結構包括光學系統(tǒng)和機械系統(tǒng)兩大部分。光學系統(tǒng)是顯微鏡的主體部分，有包括物鏡、目鏡、聚光鏡及反光鏡等組成的照明裝置。機械系統(tǒng)是為了保證光學系統(tǒng)的成像而

4、配置的，包括調焦系統(tǒng)、載物臺和物鏡轉換器等運動夾持部件以及底座、鏡臂、鏡筒等支持部件。一些特殊類型或高級顯微鏡還有一些附加裝置。顯微鏡基本結構示意圖4.1.3 光學顯微鏡的性能參數放大率:顯微鏡的放大率(amplification)或稱放大倍數是指顯微鏡經多次成像后最終所成(放大的)像的大小相對于原物體大小的比值。數值孔徑：數值孔徑(numerical aperture)又叫鏡口率，是物體與物鏡間媒質的折射率n與物鏡孔徑角的一半()正弦值的乘積，通?？s寫為NA。分辨率：顯微鏡的分辨率(distinguishability)又稱為分辨本領(resolving power)，是指透鏡能分辨兩點之間

5、的最小距離。視野：視野(visual field)又稱視場(field)，是指通過顯微鏡所能看到標本所在空間的范圍。景深與焦長：景深(depth of field)又稱焦點深度，是指在成一幅清晰像的前提下，像平面不變，景物沿光軸前后移動的距離稱“景深”。景物不動，像平面沿光軸前后移動的距離稱“焦長”。鏡像亮度和清晰度：鏡像亮度即顯微鏡的圖像亮度的簡稱。鏡像清晰度是指圖像的輪廓清晰、襯度適中的程度。工作距離：工作距離是指從物鏡前表面中心到被觀察標本間滿足工作要求的距離范圍，與物鏡的數值孔徑成反比。4.2 電子顯微鏡4.2.1 電子顯微鏡的基本結構電子顯微鏡主要由電子光學系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、供電系統(tǒng)、

6、機械系統(tǒng)和觀察顯示系統(tǒng)等幾部分組成。電子光學系統(tǒng)主要由電子透鏡和電子槍組成。真空系統(tǒng)主要由機械泵、油擴散泵或離子泵、聯(lián)動控制閥門、真空排氣管道、空氣過濾器和用于真空度指示的真空測量規(guī)等組成。供電系統(tǒng)包括高壓電源、真空系統(tǒng)供電電源、透鏡電源、輔助電源及安全保護系統(tǒng)的電源等。機械系統(tǒng)包括電鏡座、標本室、磁屏蔽外殼、鏡筒、制冷系統(tǒng)及控制工作臺等。觀察顯示系統(tǒng)由熒光屏和照相室兩部分組成。4.2.2 電子顯微鏡的分類及其應用透射電子顯微鏡：透射電子顯微鏡是以電子束透過樣品經過聚焦與放大后所產生的物像， 投射到熒光屏上或照相底片上進行觀察。透射電鏡的分辨率為0.10.2nm，放大倍數為幾萬幾十萬倍。由于電

7、子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50100nm）。在生物醫(yī)學中主要用于觀察組織和細胞內的亞顯微結構、蛋白質、核酸等大分子的形態(tài)結構及病毒的形態(tài)結構等，另外，透射電鏡還是區(qū)分細胞凋亡與細胞壞死最可靠的方法。細菌細胞結構，鞭毛結構，放線菌的孢子結構及孢子表面裝飾物立體形狀等超微結構的觀察，都需用透射電子顯微鏡。透射電子顯微鏡的實體圖掃描電子顯微鏡：掃描電子顯微鏡的工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關，也就是說與樣品的表面結構有關，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉變?yōu)楣庑盘?，再經光電倍增管和放大器轉變

8、為電信號來控制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像立體形象，反映了標本的表面結構。為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。其分辨率一般為3nm10nm，放大率為5倍300 000倍，加速電壓為1kV30kV，SEM的景深長、視野大、圖像有立體感、樣品制備簡單、放大率范圍廣、能夠觀察較大樣品的局部細微結構。掃描電鏡可以觀察到微觀世界的立體形象, 它的圖像是三維的逼真反映出樣品表面結構的凹凸不平，如細菌的形態(tài)，鞭毛大小結構，放線菌的孢子表面裝飾物等。在生物醫(yī)學上，掃描電鏡主要用來觀察組織、細胞表面或斷裂面

9、的顯微和亞顯微結構及較大的顆粒性樣品(3nm10nm)的表面形態(tài)結構。掃描隧道顯微鏡：掃描隧道顯微鏡是根據量子力學原理中的隧道效應和三維掃描而設計。當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加電壓（2mV2V），針尖與樣品之間產生隧道效應而有電子逸出，形成隧道電流，通過隧道電流獲取顯微圖像，而不需要光源和透鏡。掃描隧道顯微鏡的分辨率很高，橫向為0.10.2nm，縱向可達0.001nm，已達原子量級的分辨率。它的優(yōu)點是三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質均可進行觀察，可在真空、大氣、常溫等不同環(huán)境下工作，甚至可將樣品浸在水和其它溶液中，不需要特別的制樣技術。普通電鏡只能觀察制作

10、好的固體標本。利用掃描隧道顯微鏡可直接觀察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白質等分子的原子布陣，和某些生物結構，如生物膜、細胞壁等的原子排列，特別適用于研究生物樣品和在不同實驗條件下對樣品表面的評價。STM有兩種工作方式，一種稱為恒流掃描方式，即采用電子反饋線路控制隧道電流使其大小恒定，而用壓電陶瓷管控制針尖的表面掃描路線保持間距不變，隨著表面高低起伏而上下運動。另一種工作模式是恒高度工作，在對樣品進行掃描過程中保持針尖的絕對高度不變；于是針尖與樣品表面的局域距離將發(fā)生變化，隧道電流的大小也隨著發(fā)生變化；通過計算機記錄隧道電流的變化，并轉換成圖像信號顯示出來，即得到了STM顯微圖像。4.3 特

11、殊光學顯微鏡4.3.1 熒光顯微鏡熒光顯微鏡利用物質的熒光性識別物質。熒光物質把入射的紫外線變?yōu)榭梢姽?，使熒光顯微鏡對可見光成像，故可以采用常規(guī)的物鏡和目鏡。當輻射波長在 3000以下時，應采用貴重的石英玻璃作載玻片，為避免試樣上的灰塵或污點產生外來的熒光，被檢試樣必須十分清潔。為防止紫外線進入物鏡，可以采用暗視場照明。熒光顯微鏡既可以觀察固定的切片標本，而且可以進行活體染色觀察。 4.3.2 相襯顯微鏡光線只有通過染色標本時其波長、振幅發(fā)生變化，人眼才能看見，但活細胞和未染色的標本由于光波長和振幅不發(fā)生變化，人眼看不到，但其相位有變化，因此利用光的干涉和衍射效應把透過標本不同區(qū)域的光波光程差

12、轉變成振幅差，使細胞內各種結構之間呈現清晰可見的明暗對比?？捎脕碛^察活細胞和未染色的標本。4.3.3 倒置顯微鏡倒置顯微鏡(Inverted Microscope)的組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。4.3.4 暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡（dark field microscope）的聚光鏡中央有當光片，使照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至 4nm200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。它可用來觀察小于0.1m

13、物體的存在，這是其他光學顯微鏡觀測不出來的。還可用來觀察活細胞的運動，尤其是配合顯微攝影技術，可記錄一個細胞或細胞器的運動軌跡，借此可分析它的運動方向，乃至速度等。4.3.5 偏光顯微鏡偏光顯微鏡是利用光的偏振特性，對具有雙折射性(即可以使一束入射光經折射后分成兩束折射光)的晶體、液晶態(tài)物質進行觀察和研究的重要光學儀器。偏光顯微鏡是在一般顯微鏡的基礎上增添了使普通光轉變成線偏振光和檢測偏振光的裝置或觀察干涉圖樣的特殊透鏡。即光源前有偏振片（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（一個偏振方向與起偏器垂直的起偏器）。偏光顯微鏡的載物臺是可以旋轉的。當載物臺無樣品時，無論如何旋轉載物

14、臺，由于兩個偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線。而放入旋光性物質后，由于光線通過這類物質時發(fā)生偏轉，因此旋轉載物臺便能檢測到這種物體。利用它可以清楚地觀察到纖維絲、紡錘體、膠原、染色體、卵巢、骨骼、毛發(fā)、活細胞的結晶或液晶態(tài)的內含物、神經纖維、肌肉纖維、植物纖維等的細微結構，從而可以分析細胞、組織的變化過程。4.3.6 激光掃描共聚焦顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡成像的基礎上裝有激光掃描裝置，以單色激光作為光源，使樣品被激發(fā)出熒光，利用計算機進行圖像處理，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像。共聚焦顯微鏡利用激光掃描束經照明孔形成點光源對標本內焦平面上的每一點掃描，由于照明孔與

15、檢測孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明孔和檢測孔，焦平面以外的點不會在檢測孔處成像，這樣就得到了標本清晰的光學切面圖，克服了普通光鏡圖像模糊的缺點。 4.3.7 紫外光顯微鏡使用紫外光源可以明顯提高顯微鏡的分辨率，對于生物樣品使用紫外光照明還具有獨特的效果。細胞中的原生質對可見光幾乎是不吸收的，而蛋白質和核酸等生物大分子對紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光顯微鏡（ultraviolet microscope）研究單個細胞的組成與變化情況。4.3.8 干涉相襯顯微鏡干涉相襯顯微鏡利用偏振光，有四個特殊的光學組件：偏振器、棱鏡、滑行器和檢偏器。偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)

16、的前面，使光線發(fā)生線性偏振。在聚光器中安裝了石英Wollaston棱鏡，可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x和y），二者成一小夾角。聚光器將兩束光調整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致，在穿過標本相鄰的區(qū)域后，由于標本的厚度和折射率不同，引起兩束光發(fā)生光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個Wollaston棱鏡(滑行器)，把兩束光波合并成一束。這時兩束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿過第二個偏振裝置(檢偏器)，檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，使二者發(fā)生干涉。干涉相襯顯微鏡的優(yōu)點是能顯示結構的三維立體投影影像，與相襯顯微鏡相比，其標本可略厚一點，折射率差別

17、更大，故影像的立體感更強，產生類似于浮雕的效果。它使細胞的內部結構，特別是一些較大的細胞器，如核、線粒體等，立體感特別強，因此適合應用于顯微操作技術。4.3.9 近場掃描光學顯微鏡近場顯微鏡的微探頭是一個中空的、針狀的、頂部小于150nm，內孔直徑為50nm的玻璃微管，管壁鍍鋁膜，最終使光線只能從直徑為50nm（可見波長的1/10左右）的內孔射入，微管的尾部接上十分靈敏的光量子探測器測量進入內孔的光量。這種技術的理論分辨率極限約10nm。由于采用可見光對生物樣品損害很少，而且既可以用在空氣中（與電子顯微鏡必須在真空條件下相比要優(yōu)越），又可以用在水中（與一般的光學顯微鏡相比也有優(yōu)越性）。這種光學

18、顯微鏡技術將對研究活體中的病毒和染色體等生物物質的結構和形態(tài)發(fā)揮作用。由于探測器對可見光是靈敏的，還可以對生物樣品進行熒光分析。這種顯微鏡還能用來研究材料的表面性質。4.4 顯微鏡的使用、維護、常見故障及排除4.4.1 光學顯微鏡的使用低倍光學顯微鏡的使用：對光：轉動粗調節(jié)螺旋，降低載物臺；旋轉物鏡轉換器，使10倍物鏡頭對準鏡臺孔；然后升高聚光鏡，打開光圈，將反光鏡的凹面對準光源，直至視野明亮為止。將要觀察的切片放在載物臺上，固定好，并將要觀察的部位移至中央。調焦距：旋轉粗調螺旋，升高載物臺，至物鏡距玻片約0.5cm時，再緩慢降低鏡臺，直到看清圖像為止。調節(jié)兩瞳孔間的距離：一邊用雙眼自目鏡中觀

19、察，一邊用雙手握住兩個目鏡管，前后或左右移動，直到雙眼看到一共同視野為止。為使右眼圖像更清晰，可輕輕轉動微調螺旋，欲使左眼圖像清晰，需旋轉鏡管長度調節(jié)環(huán)。高倍光學顯微鏡的使用：用低倍鏡看清圖像后，將要進一步放大的結構移至視野中央，一邊從側面觀察，一邊旋轉物鏡轉換器，將高倍鏡頭對準鏡臺孔；升高聚光鏡，將光線調節(jié)到最亮的程度；然后，稍微轉動微調螺旋，即可觀察到清晰的圖像。油鏡的使用：用低倍鏡看清圖像后，將所要觀察的結構移至視野中央，在標本所要觀察的部位滴一滴鏡油，旋轉物鏡轉換器，將油鏡頭對準鏡臺孔，使油鏡頭下端與鏡油接觸，然后，輕輕轉動微調螺旋，即可看清物像。使用油鏡時，應把聚光鏡的光圈充分開大。 用完油鏡后，必須用擦鏡紙蘸清洗劑，將鏡頭和玻片擦凈。4.4.2 光學顯微鏡的維護搬動顯微鏡時，應該用右手握鏡臂,左手托鏡座，平貼胸前，以防撞碰。切勿用一只手斜提，前后搖擺。每次使用顯微鏡前，要檢查顯微鏡的主要部件有無缺損，發(fā)現問題，及時報告。使用時，要嚴格按操作程序，正確地緩慢移動有關機械部分。禁止拆卸顯微鏡的各個部件，更不允許與其它顯微鏡對換，以免安裝不當影響觀察效果。如鏡頭表面有灰塵，應該用擦鏡紙擦，不允許用口吹、手指抹，或用其它紙、布擦。 顯微鏡用完后，將4倍鏡頭對準鏡臺孔，升高鏡臺，降下聚光器，打開光圈，蓋好防塵罩，放回原處。4.