1、臨床微生物檢驗與臨床,臨床微生物科 李 浩,微生物檢驗的重要性,在醫(yī)學高度發(fā)展，新的抗菌藥物不斷涌現(xiàn)的今天，感染性疾病的發(fā)病率和病死率仍然居高不下。主要原因之一是當代的感染性疾病，在病原上發(fā)生了較大的變化，形成了現(xiàn)代感染性疾病在病原學上的新特點,現(xiàn)代感染性疾病的新特點,以條件致病菌為主：很多低致病、弱毒的細菌，在外環(huán)境、人體體表以及與外界相通的腔道中廣泛存在的細菌，引起感染甚至造成嚴重后果的現(xiàn)象日益增多。 病原菌的種類更為廣泛：包括需氧菌、厭氧菌、苛氧菌、分枝桿菌和真菌等。,細菌的耐藥性不斷增強：同一種細菌對抗生素的耐藥性可以完全不同，甚至出現(xiàn)同時耐多種抗生素的“多重耐藥”細菌，往往使臨床醫(yī)師

2、的“經驗性”治療或所謂的常規(guī)治療根本無效。,現(xiàn)代感染性疾病的新特點,提高感染樣本送檢率 加強細菌耐藥監(jiān)測 關注細菌性疾病的病原學診斷，已成為臨床工作者、臨床微生物與微生態(tài)工作者、藥學家和從事感染控制的工作者共同關注的熱門焦點。,病原微生物送檢是感染控制的基礎,成功治療感染癥的因素 成功分離病原菌 標本收集、運送、保存 標本處理方法 檢驗醫(yī)師專業(yè)知識 醫(yī)師判讀病原菌培養(yǎng)結果 選擇適當治療方法,臨床醫(yī)生要合理用好兩種數(shù)據(jù),1. 本地區(qū)、本單位病原流行病學資料，指導經驗用藥。（微生物室、院感科、臨床科室） 2.藥敏試驗報告，糾正經驗用藥。 重視病原學檢查,盡可能在應用抗菌藥物之前留取標本送檢。以提高

3、病原學診斷率,為選藥和調整藥物提供依據(jù)。,“正確的微生物學檢驗始自正確的標本采取。臨床醫(yī)師、護師及檢驗技師都必須通曉其要領?！?著名的臨床微生物檢驗專著Manual of Clinical Microbiology 的主編Patrick Murray,標本采集和運送是細菌培養(yǎng)成功的最最重要的關鍵 但由于標本的采集和運送常由護士或醫(yī)生或病人自己完成，所以也是最不容易做好的事情，而且不知道問題所在之處，造成的后果是: 臨床醫(yī)生最不能接受的問題:陽性率低,國內微生物標本的采集目前存在的問題 ： 標本送檢率低 從全國來看，抗感染治療前，送檢相關標本可能只占應送標本的一半左右，與抗菌藥物應用率之高形成鮮

4、明的反差。一些醫(yī)師在經驗性治療受挫后方送標本，此時已失去陽性培養(yǎng)的機會。 標本有缺陷 正確收集各種臨床標本，關注特檢標本采樣與送檢的方法和條件，是完成病原學診斷的先決條件。,微生物讓人類步步為營， 我們應該追求： “準確的病原學診斷” “針對性病原學治療” 正確的微生物標本采集和運送，是準確的病原學診斷的前提！,基本原則,1.及時采集微生物標本作病原學檢查 2.在抗菌藥物使用前采集標本 3.采樣時嚴格執(zhí)行無菌操作 4.采樣后立即送檢 5.標本容器須滅菌處理，但不得使用消毒劑 6.送檢標本應注明來源和檢驗目的,常見不合格標本主要有以下問題：,標本采集時間錯誤 容器錯誤 標本量不足 標本采集延誤

5、標本未及時正確運送 以及暫存條件錯誤。 。,最有價值的細菌學檢測項目,血液培養(yǎng) 腦脊液培養(yǎng) 膽汁培養(yǎng) 胸腹水培養(yǎng) 關節(jié)液 其他無菌體液或分泌液,血培養(yǎng)標本,采集與運送,血培養(yǎng)是進行血流感診斷的最佳手段,目前血培養(yǎng)的問題：,采血時機不合適 采血套數(shù)不夠 采血量不足 只做需氧培養(yǎng)，不同時做厭氧培養(yǎng) 采血前或采血時正在使用抗生素治療,相似規(guī)模醫(yī)院的血培養(yǎng)數(shù), 國內多數(shù)三甲綜合醫(yī)院210 瓶/天 復旦大學中山醫(yī)院2050瓶/天 香港瑪麗醫(yī)院200瓶/天 臺灣大學醫(yī)院300瓶/天 我院約1015瓶/天,1370瓶/2011年7月26日 美國，亞特蘭大，埃默里大學附屬一院，1100床位,平均100 人次/

6、天 美國，亞特蘭大，埃默里大學附屬二院，900床位,實驗室類型:美國私立大醫(yī)院微生物實驗室醫(yī)院病床數(shù): 800 beds微生物標本量: 600個標本/天血培養(yǎng)標本量:150 瓶/天血培養(yǎng)標準采樣:3套瓶/24小時 (1個需氧瓶+1個厭氧瓶=1套)陽性結果:10-30株需氧或兼性厭氧菌/天, 2株厭氧菌/月BacT/ALERT 3D 240 7臺,“只有在發(fā)熱時，才需要進行血培養(yǎng)?！?關于血培養(yǎng)指征,想采就采,？,答 案：血培養(yǎng)的指征,當懷疑血流感染或膿毒癥時，應常規(guī)行血培養(yǎng) 懷疑患者有血流感染的癥狀有： 不明原因的發(fā)燒(38)或體溫過低(36) 白細胞增多（ 10,000/ul），粒細胞減少（

7、 1,000ul） 休克，寒顫，僵直 嚴重的局部感染(腦膜炎，心內膜炎，肺炎，腎盂腎炎，腹部術后感染，) 心率異常加快 低血壓或高血壓 呼吸頻率加快,“何時采血進行血培養(yǎng)，無特殊時間要求?！?關于采血時機,？,你認為對嗎？為了提高病人血培養(yǎng)的陽性率，最好的抽血時間是：,A.發(fā)熱開始時B.寒戰(zhàn)開始時C.發(fā)熱最高峰時D.寒戰(zhàn)結束時E.預計寒戰(zhàn)發(fā)熱前,0,30,60,時間 (分鐘),體溫,血培養(yǎng)采血時機,細菌濃度,答 案：采集血培養(yǎng)樣本的最佳時間,盡可能在患者寒戰(zhàn)或開始發(fā)熱時采血 在患者接受抗生素治療前采血 如患者已經應用抗菌藥物進行治療，應在下一次用藥之前采血培養(yǎng),“為減輕患者痛苦，只從一個穿刺部

8、位采一份血液標本即可?！?關于采血套數(shù)及部位,？,基本概念,成人“一套” 血培養(yǎng)應該包括需氧瓶和厭氧瓶各一個，也叫“一份” 注意：一次穿刺采血，算“一套”，采集第二套應從另一個穿刺點獲得。 兒童一般只做需氧培養(yǎng)，但仍需從多個部位采集多次。特殊患者才考慮厭氧培養(yǎng)。,采血套數(shù),Weinstein et al. Detection of Bloodstream Infections in Adults: How Many BloodCultures Are Needed J Clin Microbiol. 2007; 45:3546-3548,表皮葡萄球菌的臨床意義,23套血培養(yǎng)，有助于污染的判斷。

9、,Tokars, JI. Clin Infect Dis 2004; 39:333,污染菌,致病菌,？,采集1套無法判斷是病原菌還是污染菌。,答 案 ：關于血培養(yǎng)套數(shù)與采血部位,每位患者每次采血最少2套，3套更好 初發(fā)患者，絕不能只采1套標本 多個穿刺部位采血。因多部位同時發(fā) 生污染的幾率較小，便于對結果進判斷,“兩套血培養(yǎng)采集間隔無特殊要求?！? 關于采血間隔,？,答案：關于標本采集間隔時間,對于非持續(xù)性菌血癥，同時或短時間內采集23套血培養(yǎng)，因為體內巨噬細胞吞噬系統(tǒng)會在1530min內清除掉進入人體內的細菌。 可疑急性心內膜炎患者要立即取血作血培養(yǎng)，30分鐘內完成3套血培養(yǎng)的采集，采集后立

10、即進行抗菌藥的經驗治療。如果24小時內報告陰性，則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng)。 可疑的亞急性心內膜炎患者每間隔30分鐘至1h采集1套，連續(xù)采集3套標本。如果24小時內報告陰性，則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng)。,“每瓶采集多少血液無特殊要求?！? 關于采血量,？,菌血癥病人血中細菌濃度 成年病人: 鏈球菌心內膜炎 1 to 30 organisms/ml 葡萄球菌心內膜炎 1 to 20 organisms/ml 革蘭氏陰性菌血癥 少于1 to 10 organisms/ml 革蘭氏陽性菌血癥 1 to 300 organisms/ml 幼兒病人: 革蘭氏陰性菌血癥 5 to 1000 organisms/ml

11、75%幼兒菌血癥病人血液有100 organisms/ml 所以采血量一定要足夠！,采血量(ml)與檢出率的關系,Overall,血培養(yǎng)物每增加一毫升，真性菌血癥 成年人微生物的檢出率增加3,但并非越多越好，超過一定數(shù)量的采血量會稀釋培養(yǎng)瓶內的肉湯，使肉湯無法有效中和血中的抑制物質（補體、抗體、抗生素）。所以血液與肉湯的最佳比例為1：41：10,答 案：關于采集血液量,采血量是影響靈敏度最關鍵因素 成人一份標本2個培養(yǎng)瓶（需氧厭氧），每瓶810ml，共20ml；要求至少采兩份標本，即40ml。 兒童一般只需采集需氧瓶，在保證采集血量1總血量下，一般為13ml 采血量不足時應優(yōu)先保證需氧瓶，因臨

12、床90以上的感染為需氧菌或兼性需氧菌感染,先采生化、凝血標本，再采血培養(yǎng)標本。”,關于各種血液標本的采集順序,？,血培養(yǎng)對無菌操作的要求比注射、采集生化、凝血等其它標本要高。 所以要最先采集血培養(yǎng)標本。 污染率的指標是 3% （100份標本里只能有不到3個標本出現(xiàn)污染。）,答案：采各種血液標本的先后順序,“消毒的重點是足夠量的消毒劑?！?關于皮膚及培養(yǎng)瓶消毒,？,皮膚消毒程序：,推薦使用碘町、洗必泰或碘伏作為皮膚消毒劑。 碘町作用1min 碘伏作用1.5-2min 洗必泰作用時間與碘町一樣（但不能用于少于2個月嬰兒皮膚消毒）,培養(yǎng)瓶的消毒程序：,去掉培養(yǎng)瓶口的塑料瓶蓋。 75%酒精消毒血培養(yǎng)瓶

13、橡皮塞子60秒。 自然待干。 將標本注入培養(yǎng)瓶內。 5. 顛倒混勻標本與肉湯，以避免血液凝集。,“培養(yǎng)瓶未使用時，需要冷藏或冷凍。”,關于培養(yǎng)瓶的儲存溫度,？,不需冷藏，更不能冷凍。保存在1525的室溫即可，溫度過低會導致對溫度敏感的耐瑟氏菌等死亡。,答案：關于未用培養(yǎng)瓶的儲存溫度,“加入標本后的培養(yǎng)瓶夜班未能及時送到檢驗科，可以冷藏或放入35的溫箱?！?關于夜班血培養(yǎng)的送檢,？,培養(yǎng)瓶夜班未能及時送到檢驗科，存在室溫即可，不能冷藏也不能放入35 的溫箱 。過夜不會對檢測造成影響，但仍需盡快送檢。冷藏可能導致對溫度敏感的耐瑟氏菌等死亡。溫箱會導致細菌進入生長對數(shù)期，從而錯過檢測的最佳時期。,答

14、案：關于夜班血培養(yǎng)的送檢,“患者靜脈中插有導管，可直接從導管采血?！?關于采血部位,？,不可以，常規(guī)血培養(yǎng)不宜從靜脈導管或靜脈留置裝置中采集，檢出污染或定植菌的可能性較大。除非懷疑導管相關性血流感染，請參照導管相關性血流感染的采血方法。,答案：關于從靜脈留置裝置直接采血,有臨床意義的分離株Bourbeau PP et al. Routine incubation of BacT/ALERT FA and FN blood culture bottles for more than 3 days may not be necessary. J Clin Microbiol. 2005; 43:2

15、506-2509,結果表明培養(yǎng)的前三天，有臨床意義分離株的97%被檢出，培養(yǎng)前兩天的檢出率為94%。,97,痰培養(yǎng)標本,采集與運送,病原體種類繁多而復雜,使下呼吸道感染病原診斷成為難題,細菌（包括放線菌與奴卡菌，厭氧菌與分枝桿菌） 真菌（包括肺孢子菌） 病毒 支原體、衣原體與立克次體 原蟲 寄生蟲,咳痰途經口咽部,唾液中口咽部定植菌的濃度可達108-109/ml。 研究顯示，國內常規(guī)痰標本中約半數(shù)存在唾液嚴重污染現(xiàn)象。,不可避免地受到污染,我國痰細菌培養(yǎng)現(xiàn)狀,標本送檢率低 苛養(yǎng)菌檢出率極低 結果重復性差 報告速度慢 感染菌與污染菌不易區(qū)分 藥敏結果與治療反應存在差距,咳痰標本的采集,標本采集方

16、法 醫(yī)師或護士直視下采集標本 病人先漱口，去除表面的菌群 教育病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液 臨床上約半數(shù)咳痰標本不合格！,關于咳痰標本,在抗生素應用前采集痰標本; 標本采集后12h內必須立即進行實驗室處理 咳痰標本應用最早且廣泛，但也是最受爭議的標本 取標本前應摘去牙托，清潔口腔如刷牙和漱口 深咳，采集標本過程中要有專業(yè)的醫(yī)務人員指導 無痰可用35NaCl 5ml霧吸約5min導痰 也可用物理療法、體位引流、鼻導管抽吸等法取痰,幾種下呼吸道直接采集的標本,經氣管穿刺吸引（transtracheal aspiration,TTA） 經胸壁針刺吸引（transthoracic needle

17、aspiration, TNA） 經支氣管鏡采樣 支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL） 經支氣管鏡直接吸引 防污染樣本毛刷（protective specimen brush, PSB） 開胸肺活檢（open-lung biopsy，OLB） 經人工氣道吸引分泌物（endotracheal aspirates，ETA）,痰培養(yǎng)的送檢次數(shù),對于普通細菌性肺炎，痰標本送檢每天1次，連續(xù)23天。不建議24h內多次采集，除非痰液外觀性狀出現(xiàn)改變； 懷疑分枝桿菌感染者，應連續(xù)收集3天清晨痰液送檢；,標本質量,膿痰,粘液樣痰,唾液or誘導痰 (?),帶血痰,用革蘭氏染色

18、來評估 呼吸道標本是否合格,呼吸道標本的涂片評估模式,尿培養(yǎng)標本,采集與運送,尿培養(yǎng)標本,清潔中段尿 導尿導管尿 經恥骨上皮膚穿刺采集膀胱內尿液 送檢標本以晨起第一次尿液為佳 不能立即送檢者，可暫存4冰箱，但保存不超過8h,清潔中段尿液,盡量取早晨第一次尿液 棄去開始流出的尿液，以沖刷尿道口的細菌，取能代表膀胱部位病原菌的中段尿 詳細告知病人以下操作步驟 女性病人 收集標本前用清洗液沖洗干凈，從前向后仔細擦洗尿道區(qū)域 分開陰唇，開始排尿 排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 回縮包皮并清洗龜頭 排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿,導尿管尿液,集尿袋內的尿液不能用作培養(yǎng)； 導尿管末端

19、的尿液也不能用于培養(yǎng)，因為很難避免沒有尿道菌群污染。 留置導管尿液標本常通過專門的采樣端口采集，不能把導尿管與尿袋拔開后收集尿液。 采樣端口用酒精消毒；必要時，可先夾住導尿管但不能超過30分鐘；將注射器針頭插入采樣端口，抽吸出尿液；注入無菌杯或試管中,恥骨上穿刺吸取尿液,常用于患兒、泌尿道厭氧菌感染或脊柱損傷病人等。 可避免尿道或會陰細菌的污染，但對膀胱內少量尿液的小兒難以實施。 可用于厭氧菌檢測,出現(xiàn)如下情況時，怎樣判斷？,化膿和創(chuàng)傷標本采集,組織或器官的化膿性感染，其病原菌的來源可分為兩類： 內源性：感染源是炎癥局部周圍器官中的正常菌群，由于損傷等因素進入無菌狀態(tài)的組織內，發(fā)生感染。 外源

20、性：感染源是存在于人體外部自然界的微生物，由于外傷和直接接觸通過人體表面進入人體，造成感染。 膿液的細菌學檢查對于確定感染的種類（結核性或非結核性等）、提供藥物敏感結果和指導臨床治療有重要的意義。,（一）標本采集 1開放性感染和已潰破的化膿灶 標本采集前先用滅菌生理鹽水拭去表面滲出物，盡可能用抽吸或將拭子深入傷口，緊貼傷口前沿取樣，從膿腫底部或膿腫壁取樣，效果最好。慢性感染，污染嚴重，很難分離到致病菌，可取感染部位下的組織，研磨成組織勻漿接種于適宜的培養(yǎng)基。 2封閉性膿腫 局部消毒后用針及注射器抽吸膿腫壁，將所有物質置于無菌試管內送檢，疑為厭氧菌感染時立即作床邊接種或置于厭氧轉運裝置送檢（針頭

21、插一橡皮塞隔絕空氣）。但取樣時，可能會帶入與感染過程無關的定植細菌。 3大面積創(chuàng)傷感染：可取感染組織塊或沾有膿汁的內層敷料送檢。,（二）注意事項 細菌對干燥敏感或只能采集少量標本時，用棉拭子采集標本后立即放入液體培養(yǎng)基內，或采標本前先將棉拭子沾少許肉湯以保持標本濕度。 對于不能立即送檢的標本，應放4保存，培養(yǎng)淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌的標本除外。 盡可能在用藥前采集標本。 采樣前病灶局部應避免用抗菌藥物或消毒劑。 革蘭染色對標本進行評估。涂片中如出現(xiàn)上皮細胞提示標本已被污染。沒有上皮細胞而有白細胞說明標本采集正確。 有的創(chuàng)傷均可有細菌污染，但不一定發(fā)生感染，因此對分離到的細菌要根據(jù)創(chuàng)傷的情況、菌

22、量和種數(shù)，收集標本的處理過程、機體免疫力及抗生素的使用情況等多種因素來分析判斷。,與臨床溝通中常見問題,1、我們想用的藥物在藥敏試驗中 沒有做？ 可能是天然耐藥 可能是藥物的敏感性被其他藥物所預報,與臨床溝通中常見問題,2.為什么有的菌報告很多種藥物， 有的僅報告幾種藥物？ 報告的藥物種類根據(jù)細菌種類的不同而有所不同，如銅綠假單胞菌報告的藥物較多，而腸球菌報告的藥敏較少,與臨床溝通中常見問題,3、是否能將所用的藥都做藥敏試驗? 沒有必要：通過耐藥機制和標志性藥物可以預測其他抗菌藥物的敏感性 沒有可能：不是所用藥物都可以做藥敏試驗（需要藥物在體外穩(wěn)定，需要有操作標準和解釋標準）,與臨床溝通中常見問