1、基因表達的定量檢測分析,基因表達的定量檢測方法 1. 蛋白表達水平的檢測： 1）定量檢測分析： western blotting、ELISA、HPLC 2）蛋白質(zhì)功能分析： 蛋白質(zhì)亞細胞定位分析：免疫熒光技術(shù) 蛋白相互作用研究：酵母雙雜交、免疫共沉淀（IP）、 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET） 酶活性檢測：ELISA、HPLC 2. mRNA表達水平檢測： 1）半定量RT-PCR 2）Northern blot 3）實時熒光定量PCR（Realtime PCR）,Northern blot 雜交 是用來檢測真核生物RNA的表達量和大小，以估計其豐度的實驗方法，可以從大量的RNA樣本同時獲得這些信息

2、。 其基本步驟包括： 1. 完整mRNA的分離 2. 根據(jù)RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行分離 3. 將RNA 轉(zhuǎn)移到固相支持物（尼龍膜）上，在轉(zhuǎn)移的過程中， 要保持RNA 在凝膠中的相對分布 4. 將RNA固定到支持物上（UV交聯(lián)） 5. 固相RNA與探針分子（DNA或RNA）雜交 6. 除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針分子 7. 對特異結(jié)合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析,Realtime PCR,實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解

3、決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。,實時熒光定量PCR原理 所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線或內(nèi)參基因的關(guān)系對起始模板進行定量分析的方法。 與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析，無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測。,一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段： 熒光背景信號階段, 熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。,在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。 而在平臺期，擴增產(chǎn)

4、物已不再呈指數(shù)級的增加。 PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。 只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR 產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。 熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的 10 倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（

5、 threshold value ）,幾個常用名詞概念,1. Ct 值的定義 C代表Cycle，t代表threshold（閾值，臨界值），Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。,2. 熒光域值（threshold）的設(shè)定 PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 3. Ct值與起始模板的關(guān)系 研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫

6、坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。,前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline） 熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍 手動設(shè)置：大于熒光背景和陰性對照的熒光最高值；進入指數(shù)期的 最初階段,絕對定量分析： Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系,質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標準品使用,相對定量分析必須用內(nèi)對照基因（管家基因）進行校正，進行相對表達量分析。,管家基因：維持細胞基本代謝活動所必須的基因，如GAPDH、Actin、HPRT等,優(yōu)點：價格便宜，使用方便，不用設(shè)計復雜的探針。 缺點：無模板特異性，對引物特異性要求比較高， 不能進行多重定量分析,Taqman Probe,Molecular Beacon,背景熒光更低,反應(yīng)優(yōu)化,反應(yīng)液組成、體積 50ul絕對不必要 20ul應(yīng)用廣，但成本高 推薦10ul，但需要優(yōu)化 引物與引物、引物與探針濃度配比 44組合，50nm,300nm,600nm,900nm 探針50nm, 100nm, 250nm,qPCR一般使用二步