1、第十二章 細(xì)胞增殖及其調(diào)控,細(xì)胞增殖(cell proliferation)的意義,細(xì)胞增殖(cell proliferation)是細(xì)胞生命活動的重要特征之一,是生物繁育的基礎(chǔ)。 單細(xì)胞生物細(xì)胞增殖導(dǎo)致生物個體數(shù)量的增加。 多細(xì)胞生物由一個單細(xì)胞(受精卵)分裂發(fā)育而來， 細(xì)胞增殖是多細(xì)胞生物繁殖基礎(chǔ)。 成體生物仍然需要細(xì)胞增殖，主要取代衰老死亡的細(xì)胞， 維持個體細(xì)胞數(shù)量的相對平衡和機(jī)體的正常功能。 機(jī)體創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理組織修復(fù)等，都要依賴細(xì)胞增殖。,第一節(jié) 細(xì)胞周期的概述,概念： 細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分 完成所經(jīng)歷的一個有序過程。其間細(xì)胞遺傳物 質(zhì)和其他內(nèi)含物分配給子細(xì)

2、胞。 細(xì)胞周期時相組成 細(xì)胞周期時間 根據(jù)增殖狀況，細(xì)胞分類三類,細(xì)胞周期時相組成,間期(interphase): G1 phase，S phase，G2 phase M phase: 有絲分裂期(Mitosis), 胞質(zhì)分裂期(Cytokinesis) 細(xì)胞沿著G1SG2MG1周期性運轉(zhuǎn)，在間期細(xì)胞體積增大(生長)，在 M 期細(xì)胞 先是核分裂，接著胞質(zhì)分裂，完成一個細(xì)胞周期。,細(xì)胞周期時間,不同細(xì)胞的細(xì)胞周期時間差異很大 S+G2+M 的時間變化教小，細(xì)胞周 期時間長短主要差別在G1期 有些分裂增殖的細(xì)胞缺乏G1、G2期,根據(jù)增殖狀況，細(xì)胞分類三類,連續(xù)分裂細(xì)胞(cycling cell)

3、休眠細(xì)胞(Go細(xì)胞) 終末分化細(xì)胞 G0期細(xì)胞和終末分化細(xì)胞的界限有時難以劃 分，有的細(xì)胞過去認(rèn)為屬于終末分化細(xì)胞，目前 可能被認(rèn)為是G0期細(xì)胞。,細(xì)胞周期中不同時相及其主要事件, G1期 S 期 G2期 M 期,G1期,與DNA合成啟動相關(guān)，開始合成細(xì)胞生長所 需要的多種蛋白質(zhì)、RNA、碳水化合物、脂 等，同時染色質(zhì)去凝集。,G2期,DNA復(fù)制完成，在G2期合成 一定數(shù)量的蛋白質(zhì)和RNA分子,M 期,M期即細(xì)胞分裂期，真核細(xì)胞的細(xì)胞分裂主 要包括兩種方式，即有絲分裂(mitosis)和 減數(shù)分裂(meiosis)。遺傳物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)其 他物質(zhì)分配給子細(xì)胞。,S期,DNA復(fù)制與組蛋白合成同步，組

4、成核小體串珠結(jié)構(gòu) S期DNA合成不同步,Experimental demonstration of the coordinated Synthesis of DNA and hitones.,細(xì)胞周期長短測定,脈沖標(biāo)記DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂指數(shù)觀察測定法 流式細(xì)胞儀測定法(Flow Cytometry) 縮時攝像技術(shù)， 可以得到準(zhǔn)確的細(xì)胞周期時間及分裂間 期和分裂期的準(zhǔn)確時間。,細(xì)胞周期同步化,自然同步化，如有一種粘菌的變形體plasmodia， 某些受精卵早期卵裂 人工選擇同步化 藥物誘導(dǎo)法 條件依賴性突變株在細(xì)胞周期同步化中的應(yīng)用： 將與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的條件依賴性突變株轉(zhuǎn)移 到限定條件下培

5、養(yǎng)，所有細(xì)胞便被同步化在細(xì)胞 周期中某一特定時期。,人工選擇同步化,有絲分裂選擇法：用于單層貼壁生長細(xì)胞。優(yōu)點是細(xì) 胞未經(jīng)任何藥物處理，細(xì)胞同步化效率高。缺點是 分離的細(xì)胞數(shù)量少。 密度梯度離心法：根據(jù)不同時期的細(xì)胞在體積和重量 上存在差別進(jìn)行分離。優(yōu)點是方法 簡單省時，效率高， 成本低。缺點是對大多數(shù)種類的細(xì)胞并不適用。,藥物誘導(dǎo)法, DNA合成阻斷法 G1/S-TdR雙阻斷法：最終將 細(xì)胞群阻斷于G1/S交界處。優(yōu)點是同步化效率高， 幾乎適合于所有體外培養(yǎng)的細(xì)胞體系。缺點是誘 導(dǎo)過程可造成細(xì)胞非均衡生長 分裂中期阻斷法：通過抑制微管聚合來抑制細(xì)胞 分裂器的形成，將細(xì)胞阻斷在細(xì)胞分裂中期。優(yōu)

6、點 是操作簡便，效率高。缺點是這些藥物的毒性相對 較大,爪蟾早期胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期,細(xì)胞分裂快,無G1期, G2期非常短,S期也短(所有復(fù) 制子都激活), 以至認(rèn)為僅含有S期和M期 無需臨時合成其它物質(zhì) 子細(xì)胞在G1、G2期并不生長，越分裂體積越小 細(xì)胞周期調(diào)控因子和調(diào)節(jié)機(jī)制與一般體細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的 細(xì)胞周期基本是一致的,第二節(jié)細(xì)胞分裂,一、有絲分裂(mitosis) 前期(prophase) 前中期(prometaphase) 中期(metaphase) 后期(anaphase) 末期(telophase),前期(prophase),標(biāo)志前期開始的第一個特征是染色質(zhì)開始濃縮 (condensati

7、on)形成有絲分裂染色體(mitotic chromosome） 第二個特征細(xì)胞骨架解聚，有絲分裂紡錘體 (mitotic spindle)開始裝配 Golgi體、ER等細(xì)胞器解體，形成小的膜泡,這種染色體由兩條染色單體(chromatid)構(gòu)成 在前期末，染色體主縊痕部位形成一種蛋白復(fù) 合物稱為動粒(kinetochore),間期動物細(xì)胞含一個MTOC，即中心體，在 S期末，兩個中心粒在各自垂直的方向復(fù)制出一個中心粒，形成兩個中心體。當(dāng)前期開始時， 2個中心體移向細(xì)胞兩極，并同時組織微管生 長，由兩極形成的微管通過微管結(jié)合蛋白在正 極末端相連，最后形成有絲分裂紡錘體。,前中期(prometa

8、phase),核膜破裂成小的膜泡，這一過程是由核纖層蛋白中 特異的Ser殘基磷酸化導(dǎo)致核纖層解體 紡錘體微管與染色體的動粒結(jié)合，捕捉住染色體 每個已復(fù)制的染色體有兩個動粒，朝相反方向，保 證與兩極的微管結(jié)合；紡錘體微管捕捉住染色體后， 形成三種類型的微管 不斷運動的染色體開始移向赤道板。細(xì)胞周期也由前中期 逐漸向中期運轉(zhuǎn)。,前中期(prometaphase),核纖層解體,三種類型的微管,中期(metaphase),所有染色體排列到赤道板(Metaphase Plate)上， 標(biāo)志著細(xì)胞分裂已進(jìn)入中期 是什么機(jī)制確保染色體正確排列在赤道板上？ 著絲粒微管動態(tài)平衡形成的張力,中期(metaphas

9、e),.,MT behavior during formation of the metaphase plate. Initially,MT from opposite poles are different in length.,Experimental demonstration of the importance of mecha- nical tension in metaphase checkpoint control.,著絲粒微管動態(tài)平衡形成的張力,后期(anaphase),排列在赤道面上的染色體的姐妹染色單體分離 產(chǎn)生向極運動 后期(anaphase)大致可以劃分為連續(xù)的兩個階段

10、，即后期A和后期B 后期A，動粒微管去裝配變短，染色體產(chǎn)生兩極運動 后期B，極間微管長度增加，兩極之間的距離逐漸拉 長，介導(dǎo)染色體向極運動,后期(anaphase),后期A,后期B,末期(telophase),染色單體到達(dá)兩極，即進(jìn)入了末期（telophase）, 到達(dá)兩極的染色單體開始去濃縮 核膜開始重新組裝 Golgi體和ER重新形成并生長 核仁也開始重新組裝，RNA合成功能逐漸恢復(fù), 有絲分裂結(jié)束,末期(telophase）,動物細(xì)胞胞質(zhì)分裂,胞質(zhì)分裂(cytokinesis)開始于細(xì)胞分裂后期，在 赤道板周圍細(xì)胞表面下陷，形成環(huán)形縊縮，稱為 分裂溝(furrow)。分裂溝的位置與紡錘體

11、極性微管和 鈣離子濃度升高的變化有關(guān) 胞質(zhì)分裂開始時，大量肌動蛋白和肌球蛋白在中體 處組裝成微絲并相互組成微絲束，環(huán)繞細(xì)胞，稱為 收縮環(huán)（contractile ring)。收縮環(huán)收縮、收縮環(huán) 處細(xì)胞膜融合并形成兩個子細(xì)胞,分裂溝(furrow),收縮環(huán),植物細(xì)胞胞質(zhì)分裂,與動物細(xì)胞胞質(zhì)分裂不同的是，植物細(xì)胞胞 質(zhì)分裂是因為在細(xì)胞內(nèi)形成新的細(xì)胞膜和細(xì) 胞壁而將細(xì)胞分開,植物細(xì)胞胞質(zhì)分裂,第三節(jié) 細(xì)胞周期調(diào)控,MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用:,MPF,即卵細(xì)胞促成熟因子(maturation-promoting factor),或細(xì)胞促分裂因子(mitosis-promoting factor),或M期促

12、進(jìn)因子(M phase-promoting factor). 背景一: Rao和Johnson(1970、1972、1974)將Hela細(xì)胞同步于不同階段，然后與M期細(xì)胞在滅活仙臺病毒介導(dǎo)下誘導(dǎo)細(xì)胞融合，發(fā)現(xiàn)與M期細(xì)胞融合的間期細(xì)胞產(chǎn)生了形態(tài)各異的染色體凝集,稱之為染色體超前凝集(prematurely condensed chromosome，PCC)。如圖所示:,G1期PCC為單線狀，S期PCC為粉末狀，G2期PCC為雙線染色體，因DNA未復(fù)制;因DNA由多個部位開始復(fù)制;說明DNA復(fù)制已完成。,G1與M融合,S與M融合,G2與M融合,人M期細(xì)胞與袋鼠（Ptk）G1、S、G2期細(xì)胞融合誘導(dǎo)

13、PCC：這就意味著M期細(xì)胞具有某種促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，稱為細(xì)胞促分裂因子。,不僅同類M期細(xì)胞可以誘導(dǎo)PCC，不同類的M期細(xì)胞也可以誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生:,背景二：1971年,Masui和Markert用非洲爪蟾做實驗，明確提出了MPF這一概念。非洲爪蟾卵細(xì)胞發(fā)育過程分為六個階段、和期。前四個時期為卵母細(xì)胞生成和生長階段 。其中 第期時細(xì)胞核較大，稱為生發(fā)泡(germinal vesicle,GV),此時細(xì)胞就停留在該時期，等待成熟。,因此，在成熟卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中必然有一種物質(zhì)，可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟，稱之為促成熟因子，MPF。進(jìn)一步實驗表明：在成熟卵母細(xì)胞中，MPF已經(jīng)存在，只是處于非活性狀態(tài)

14、，稱為前體MPF(preMPF)。非活性態(tài)的前體MPF通過翻譯后修飾，可以轉(zhuǎn)化為活性態(tài)的MPF。,分離純化出MPF：,直到1988年，Maller實驗室的Lohka等人才以非洲爪蟾為材料，分離得到了微克級的純化的MPF。證明其含有p32和p45兩種蛋白。二者結(jié)合后表現(xiàn)出蛋白激酶活性，可以使多種蛋白質(zhì)底物磷酸化。證明，MPF是一種蛋白激酶。,MPF組成：p32+p45 MPF概念：又稱細(xì)胞促分裂因子或M期促進(jìn)因子，是由細(xì)胞周期蛋白與周期蛋白依賴性蛋白激酶組成的復(fù)合物，能啟動細(xì)胞進(jìn)入M期。,結(jié)果, p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系：,另一批生物學(xué)家以酵母為材料,從另一個側(cè)面對細(xì)胞周期調(diào)控

15、進(jìn)行著深入研究.如:L.Hartwell以芽殖酵母為實驗材料, P.Nurse以裂殖酵母為實驗材料。 他們的實驗原理都相同：均是在不同溫度下培養(yǎng)酵母,獲得不同的溫度敏感突變體, 這些不同的突變體在限定溫度下，會滯留在細(xì)胞周期的某個階段以及表現(xiàn)出不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)。這些與細(xì)胞分裂和周期調(diào)控有關(guān)的基因被稱為 (cell division cycle) cdc基因，根據(jù)被發(fā)現(xiàn)的先后順序被命名。,P.Nurse在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)的cdc2基因就是第一個被分離出來的cdc基因。其表達(dá)產(chǎn)物是一種相對分子量為34103的蛋白，被稱為p34cdc2,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， p34cdc2具有激酶活性，可使多種蛋白底物磷酸

16、化，在裂殖酵母周期調(diào)控中起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。 L.Hartwell在芽殖酵母中發(fā)現(xiàn)的cdc28基因是第二個被分離出的cdc基因，其表達(dá)產(chǎn)物也是一種相對分子量為34103的蛋白，被稱為p34cdc28，它也是一種蛋白激酶，在G2/M轉(zhuǎn)換過程中起中心調(diào)節(jié)作用。,由此得出p34cdc2與p34cdc28是同源物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：二者本身并不具有激酶活性，只有當(dāng)其與有關(guān)蛋白結(jié)合后，其激酶活性才能夠表現(xiàn)出來。例如： p34cdc2必須與另一種蛋白p56cdc13結(jié)合后才具有激酶活性。 很快MallerNurse證明：MPF中的p32可以被p34cdc2特異抗體所識別，并且p34cdc2多肽片斷可以加速MP

17、F活性，表明二者是同源物。,Hartwell還通過研究酵母菌細(xì)胞對放射線的感受性，提出了checkpoint（細(xì)胞周期檢驗點）的概念，意指當(dāng)DNA受到損傷時，細(xì)胞周期會停下來。,芽殖酵母及其細(xì)胞周期,裂殖酵母及其細(xì)胞周期,二、p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系,cdc2基因表達(dá)產(chǎn)物：p34cdc2激酶 cdc28基因表達(dá)產(chǎn)物：p34cdc28激酶 研究三： Maller實驗室和Nurse實驗室合作：p34cdc2與MPF中p32兩者為同源物。,研究結(jié)果,二、p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系,研究四：Hunt (1983)以海膽卵為材料 周期蛋白 Maller實驗室和Nurse

18、實驗室合作 MPF另一種主要成分為周期蛋白B， 周期蛋白B與p56cdc13為同源物。,在研究酵母的同時，以Tim Hunt為代表的另一批科學(xué)家正在以海膽卵為材料，對細(xì)胞周期調(diào)控進(jìn)行著深入研究。他們發(fā)現(xiàn)：有兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程的變化而變化，一般在細(xì)胞間期內(nèi)積累，在細(xì)胞分裂期內(nèi)消失，在下一個周期中又重復(fù)這一消長現(xiàn)象。因此稱這兩種蛋白為細(xì)胞周期蛋白(cyclin)。并很快被分離和克隆出來，證明其廣泛存在于從酵母到人類等各種真核生物中，而且在功能上存在互補性。 MallerHunt合作證明：MPF中的另一種成分是周期蛋白B。序列分析證明，周期蛋白B與酵母的p56cdc13是同源物。,MPF,2001年10月8日美國人LelandHartwell、英國人Paul Nurse、TimothyHunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎, 周期蛋白：,自1983年首次發(fā)現(xiàn)周期蛋白后，許多科學(xué)家紛紛開展周期蛋白研究，短短10年就從各種生物中克隆分離了數(shù)十種周期蛋白，如酵母的Cln1、Cln2、Cln3、Clb1-Clb6，高等動物的周期蛋白A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等等。 各種周期蛋白均含有100個左右的保守氨基酸序列，稱為周期蛋白框，它可介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合。 M期周期蛋白(A2,B1)分子的N端含有破壞框。G1期周期蛋白分子的C