1、葉綠體色素的性質(zhì)鑒定,葉綠素的背景知識(shí)介紹,葉綠素分子是由兩部分組成的：核心部分是一個(gè)卟啉環(huán)(porphyrin ring)，其功能是光吸收；另一部分是一個(gè)很長(zhǎng)的脂肪烴側(cè)鏈，稱為葉綠醇(phytol)，葉綠素用這種側(cè)鏈插入到類囊體膜。與含鐵的血紅素基團(tuán)不同的是，葉綠素卟啉環(huán)中含有一個(gè)鎂原子。葉綠素分子通過卟啉環(huán)中單鍵和雙鍵的改變來吸收可見光。各種葉綠素之間的結(jié)構(gòu)差別很小。如葉綠素a和b僅在吡咯環(huán)上的附加基團(tuán)上有差異：前者是甲基，后者是甲醛基。,高等植物葉綠體中的葉綠素主要有葉綠素a 和葉綠素b 兩種。它們不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。葉綠素a分子式：C55H72O5N4

2、Mg；葉綠素b分子式：C55H70O6N4Mg。在顏色上，葉綠素a 呈藍(lán)綠色，而葉綠素b 呈黃綠色。按化學(xué)性質(zhì)來說，葉綠素是葉綠酸的酯，能發(fā)生皂化反應(yīng)。葉綠酸是雙羧酸，其中一個(gè)羧基被甲醇所酯化，另一個(gè)被葉醇所酯化。,葉綠素分子含有一個(gè)卟啉環(huán)的“頭部”和一個(gè)葉綠醇的“尾巴”。鎂原子居于卟啉環(huán)的中央，偏向于帶正電荷，與其相聯(lián)的氮原子則偏向于帶負(fù)電荷，因而卟啉具有極性，是親水的，可以與蛋白質(zhì)結(jié)合。葉醇是由四個(gè)異戊二烯單位組成的雙萜，是一個(gè)親脂的脂肪鏈，它決定了葉綠素的脂溶性。葉綠素不參與氫的傳遞或氫的氧化還原，而僅以電子傳遞（即電子得失引起的氧化還原）及共軛傳遞（直接能量傳遞）的方式參與能量的傳遞。

3、,卟啉環(huán)中的鎂原子可被氫離子、銅離子、鋅離子所置換。用酸處理葉片，氫離子易進(jìn)入葉綠體，置換鎂原子形成去鎂葉綠素，使葉片呈褐色。去鎂葉綠素易再與銅離子結(jié)合，形成銅代葉綠素，顏色比原來更穩(wěn)定。人們常根據(jù)這一原理用醋酸銅處理來保存綠色植物標(biāo)本。 葉綠醇是親脂的脂肪族鏈，由于它的存在而決定了葉綠素分子的脂溶性，使之溶于丙酮、酒精、乙醚等有機(jī)溶劑中。由于在結(jié)構(gòu)上的差別，葉綠素a呈藍(lán)綠色，b呈黃綠色。在光下易被氧化而退色。,葉綠素不很穩(wěn)定，光、酸、堿、氧、氧化劑等都會(huì)使其分解。酸性條件下，葉綠素分子很容易失去卟啉環(huán)中的鎂成為去鎂葉綠素。葉綠素溶液能進(jìn)行部分類似光合作用的反應(yīng)，在光下使某些化合物氧化或還原。

4、人工制備的葉綠素膜在光下能產(chǎn)生光電位和光電流，也能催化某些氧化還原反應(yīng)。,葉綠素的用途,造血功能 諾貝爾得獎(jiǎng)人Dr.Richard Willstatter和Dr.Hans Fisher發(fā)現(xiàn)：葉綠素的分子與人體的紅血球分子在結(jié)構(gòu)上很是相似，唯一的分別就是各自的核心為鎂原子與鐵原子。因此，飲用葉綠素對(duì)產(chǎn)婦與因意外失血者會(huì)有很大的幫助。 幫助解除體內(nèi)殺蟲劑與藥物殘?jiān)?營(yíng)養(yǎng)學(xué)家Bernard Jensen博士指出，葉綠素能除去殺蟲劑與藥物殘?jiān)亩舅?，并能與輻射性物質(zhì)結(jié)合而將之排出體外。此外，他也發(fā)現(xiàn)一般上健康的人會(huì)比病患者擁有較高的血球計(jì)數(shù)，但通過吸收大量的葉綠素之后，病患者的血球計(jì)數(shù)就會(huì)增加，健康狀

5、況也會(huì)有所改善。,2. 類胡蘿卜素,類胡蘿卜素（carotenoid）是一類由八個(gè)異戊二烯單位組成的，含有40個(gè)碳原子的化合物，不溶于水而溶于有機(jī)溶劑。葉綠體中的類胡蘿卜素含有兩種色素，即胡蘿卜素（carotene）和葉黃素(lutein)，前者呈橙黃色，后者呈黃色。胡蘿卜素是不飽和的碳?xì)浠衔?，分子式是C40H56，有、三種同分異構(gòu)體。在一些真核藻類中還含有類胡蘿卜素。葉子中常見的是-胡蘿卜素，它在動(dòng)物體內(nèi)水解后即轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A。葉黃素是由胡蘿卜素衍生的醇類，分子式是C40H56O2。,一般情況下，葉片中葉綠素與類胡蘿卜素的比值約為3:1，所以正常的葉子呈現(xiàn)綠色。秋天，葉片中的葉綠素較易降解

6、，數(shù)量減少，而類胡蘿卜素比較穩(wěn)定，所以葉片呈現(xiàn)黃色。 全部的葉綠素和類胡蘿卜素都包埋在類囊體膜中，并以非共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，組成色素蛋白復(fù)合體（pigment protein complex），各色素分子在蛋白質(zhì)中按一定的規(guī)律排列和取向，以便于吸收和傳遞光能。,一. 實(shí)驗(yàn)原理 1.1 葉綠素： 主要包括葉綠素a和b 分子式: Chla C55H72O5N4Mg Chlb C55H70O6N4Mg 結(jié)構(gòu)式: 卟啉環(huán)化合物 四個(gè)吡咯環(huán)與四個(gè)=CH-組成一個(gè)大環(huán),共軛雙鍵形成一個(gè)大鍵,環(huán)中央有一個(gè)鎂原子,卟啉環(huán)決定葉綠素顏色,也是吸收可見光,并以誘導(dǎo)共振方式傳遞光能的根本所在,葉醇尾是由四個(gè)異

7、戊二烯單位組成的雙萜 Chla 藍(lán)綠色 Chlb 黃綠色 脂溶性: 難溶于水,僅溶于酒精、丙酮、已醚、已烷等有機(jī)溶劑 卟啉環(huán)頭部呈極性, 具親水性; 葉醇尾部具親脂性,皂化反應(yīng): Chla、Chlb 是雙羧酸的酯 一個(gè)羧基被甲基酯化 可發(fā)生皂化反應(yīng) 另一個(gè)羧基被葉醇基酯化 COOCH3 C32H30ON4Mg +2KOH COOC20H39 COOK C32H30ON4Mg +CH3OH+C20H39OH COOK 取代反應(yīng)：卟啉環(huán)中的Mg2+可被H2+、Cu2+、Zn2+取代，被Cu2+、Zn2+取代后仍保持綠色,光學(xué)特性：,（1）吸收光譜：色素溶液隨波長(zhǎng)改變而發(fā)生光吸收變化的圖譜 Chla

8、 Chlb的吸收光譜有二個(gè)強(qiáng)吸收峰 640660nm 紅光部分 葉綠素特有 410470nm 藍(lán)紫光部分 卟啉環(huán)化合物共有 （2）熒光和磷光 熒光現(xiàn)象：Chl溶液在透射光下呈綠色，而反射光下呈紅色的現(xiàn)象。強(qiáng)度大，壽命短（10-9秒） 磷光： Chl溶液停止光照后，仍能在一定時(shí)間內(nèi)放出暗紅色的光。 壽命長(zhǎng)（10-2秒10-3秒）,1.2 類胡蘿卜素,類胡蘿卜素 胡蘿卜素 橙黃色 不溶于水 葉黃素 鮮黃色 溶于有機(jī)溶劑 分子式、結(jié)構(gòu)式： 胡蘿卜素：C40H56 有、三種同分異構(gòu)體 葉黃素是胡蘿卜素的衍生物，其兩端的紫羅蘭酮環(huán)第四位C上的H被OH取代，分子式為C40H56O2 類胡蘿卜素吸收光譜都在

9、藍(lán)紫光部分，所吸收的光能傳遞給葉綠素用于光合作用，保護(hù)葉綠素分子不被氧化或陽光破壞,二. 試劑與材料,2.1 實(shí)驗(yàn)試劑： 石油醚（沸程6090）、丙酮、甲醇、氫氧化鉀、石英砂、碳酸鎂、氯化鈉、醋酸銅。 2.2 儀器和器皿： 分光光度計(jì)、臺(tái)秤、剪刀、 研缽、移液管、漏斗、大試管、層析缸 2.3 材料： 新鮮菠菜葉片，不同顏色的花和果實(shí)。,三.實(shí)驗(yàn)操作,丙酮研磨提取葉綠素 過濾、洗研缽及殘?jiān)?2mL丙酮提取液 余下的色素提取液用石油醚萃取 加入6N HCl 紙層析 熒光 皂化反應(yīng) 光破壞 （脫鎂葉綠素） 分離色素 Cu取代,四. 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 4.1 葉綠素的熒光現(xiàn)象觀察： 取葉綠體色素提取液少許于1

10、支試管中，用反射光和透射光觀察提取液的顏色有何不同，反射光下觀察到的提取液顏色即為葉綠素產(chǎn)生的熒光顏色。,左：透射光下 右：反射光下,4.2 皂化作用,在觀察過熒光現(xiàn)象的色素提取液中加入1ml 20%KOH-甲醇溶液，充分搖勻，靜置片刻，再加入5ml苯,混勻，然后用滴管沿著管壁緩緩加入1ml蒸餾水。靜置片刻，溶液慢慢分為三層：上層為苯，其中的色素為類胡蘿卜素和葉黃素；下層為乙醇溶液，其中的色素為已經(jīng)皂化的葉綠素a、b素和少量葉黃素；試管底部同時(shí)出現(xiàn)白色沉淀。另取4ml色素提取液做對(duì)照，其他步驟都一樣，只是不加KOH-甲醇溶液。,4.3 葉綠體色素的理化性質(zhì),氫和銅對(duì)葉綠素中鎂的替代作用 取4m

11、l色素提取液于試管中,加入數(shù)滴5%鹽酸，慢慢搖動(dòng)，可見逐漸由綠色變?yōu)楹稚Ｈ~綠素中的鎂被鹽酸中的氫替代，變成了去鎂葉綠素。 取一半上述變成了去鎂葉綠素溶液，加入少許醋酸銅結(jié)晶，緩慢加熱，這時(shí)，去鎂葉綠素中的氫又被銅取代。銅代葉綠素為何種顏色？,五. 結(jié)果與分析,對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象作好詳細(xì)記錄， 并加以解釋 請(qǐng)對(duì)皂化反應(yīng)現(xiàn)象做出合理解釋，而不是單單用反應(yīng)方程式來表示,六. 注意事項(xiàng),實(shí)驗(yàn)中注意安全，石油醚、丙酮等試劑要遠(yuǎn)離火源。 研磨過程中丙酮要少量多次加入，以免研磨時(shí)四處飛濺。 過濾時(shí)不要使用濾紙而使用棉花，棉花塞在漏斗基部要松緊適當(dāng)。 葉綠素要避光保存。,七. 思考題,1 、在本實(shí)驗(yàn)中加入少許二氧化硅和碳酸鈣的目的各是什么? 2、熒光現(xiàn)象是葉綠體色素的光化學(xué)性質(zhì)之一，但為什么熒光現(xiàn)象的