福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 茄科 尖孢鐮刀菌綠色熒光蛋白 基因轉(zhuǎn) 化 體系的優(yōu)化 及其定殖特性的研究 學(xué) 科 門(mén) 類：理學(xué) 一級(jí)學(xué)科名稱：微生物學(xué) 二級(jí)學(xué)科名稱：微生物學(xué) 研 究 方 向：應(yīng)用微生物學(xué)與基因工程 研 究 生：朱磊 指 導(dǎo) 教 師：劉波 研究員、博士 完 成 時(shí) 間：二 0一一年四月 s he on of o 2011 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學(xué)位（畢業(yè)）論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究成果，并且是自己撰寫(xiě)的。盡我所知，除了文中作了標(biāo)注和致謝中已作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。與我一同對(duì)本研究做出貢獻(xiàn)的同志，都在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權(quán)的說(shuō)明 本人完全了解福建農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位（畢業(yè)）論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)送交論文的復(fù)印件， 允許論文被查閱和借閱，學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權(quán)書(shū)。 不保密，本論文屬于不保密。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 指導(dǎo)教師親筆簽名： 日期： 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 目 錄 中文摘要 . i . 一章 前言 . 1 1. 茄科枯萎病的發(fā)生與危害 . 1 科枯萎病的分布 . 1 生原因 . 1 播危害 . 1 病規(guī)律 . 2 2. 茄科枯萎病的病原菌 . 3 3. 茄科枯萎病的防治 . 3 4. 其在絲狀真菌中的研究概況 . 4 礎(chǔ)理論研究概況 . 4 為標(biāo)記物所具有的優(yōu)點(diǎn) . 5 絲狀真菌研究中的應(yīng)用 . 5 5. 本研究的目的及意義 . 6 第二章 茄科作物枯萎病原菌的分離與鑒定 . 8 1 材料與方法 . 8 料 . 8 法 . 8 2 結(jié)果與分析 . 9 科作物枯萎病害調(diào)查及其發(fā)病癥狀 . 9 科枯萎病菌的分離與鑒定 . 10 原菌的分子鑒定 . 12 病性測(cè)定結(jié)果 . 14 3 討論 . 14 第三章 番茄尖孢鐮刀菌 化體系的優(yōu)化 . 15 1 材料與方法 . 15 料 . 15 法 . 16 2 結(jié)果與分析 . 17 孢鐮刀菌的原生質(zhì)體制備 . 17 2.2 因的轉(zhuǎn)化 . 17 化子的穩(wěn)定性篩選 . 18 3 討論 . 19 第四章 番茄尖孢鐮刀菌 化子的生物學(xué)特性 . 20 1 材料與方法 . 20 料 . 20 法 . 20 2 結(jié)果與分析 . 21 化子的菌體形態(tài)及生長(zhǎng)速度 . 21 同 轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)的影響 . 22 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 化子對(duì)潮霉素的抗性水平分析 . 22 3 討論 . 23 第五章 番茄尖孢鐮刀菌在植株體內(nèi)的侵染定殖 . 24 1 材料與方法 . 24 料 . 24 法 . 24 2 結(jié)果與分析 . 24 株及組織發(fā)病癥狀觀察 . 24 聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)標(biāo)記菌 . 25 3 討論 . 29 第六章 番茄尖孢鐮刀菌在土壤中的定殖特性 . 31 1 材料與 方法 . 31 料 . 31 法 . 31 2 結(jié)果與分析 . 32 同土壤中轉(zhuǎn) 因鐮刀菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化 . 32 同土壤中轉(zhuǎn) 因鐮刀菌的熒光觀察 . 32 3 討論 . 34 第七章 番茄尖孢鐮刀菌對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 . 35 1 材料與方法 . 35 料 . 35 法 . 35 2 結(jié)果與分析 . 36 分析轉(zhuǎn) 因鐮刀菌對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 . 36 3 討論 . 39 第八章 結(jié)論與展望 . 41 1 結(jié)論 . 41 2 展望 . 41 參考文獻(xiàn) . 42 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 i 中文摘要 茄科 枯萎病是由尖孢鐮刀菌 （ 引起的毀滅性病害，嚴(yán)重 制約了 我國(guó) 茄科作物的生產(chǎn) 。 本文從福建省各地區(qū)采集了 番茄、茄子及辣椒 枯萎病植株 ，分離與 鑒定 了其病原菌；并對(duì) 一株 番茄枯萎病菌進(jìn)行 綠色熒光蛋白（ 基因轉(zhuǎn)化， 篩選獲得 了 熒光強(qiáng)度和 遺傳 性狀穩(wěn)定 的轉(zhuǎn)化子 ，同時(shí)利用綠色熒光蛋 白標(biāo)記的 轉(zhuǎn)化子 研究了番茄枯萎病原菌 在植株 體內(nèi) 及根際土內(nèi)的定殖特性 ， 主要研究結(jié)果如下： 1. 從 福建省 的 漳州、 福州 、廈門(mén) 等茄科作物主產(chǎn)區(qū) 采集了番茄、辣椒、茄子 表現(xiàn)枯萎病癥狀的植株進(jìn)行分離鑒定，獲得 40株鐮刀菌，其中 35株為尖孢鐮刀菌，進(jìn)一步的致病性確定了尖孢鐮刀菌是這 3種茄科作物枯萎病的致病菌株。 2 采取 導(dǎo)的方法 ，優(yōu)化番茄 尖孢鐮刀菌的 綠色熒光蛋白（ 轉(zhuǎn)化體系 。轉(zhuǎn)化的最適條件： 培養(yǎng) 12h 的新鮮菌絲 在 4 解液（ 20 mg/潰酶 ， 10 mg/壁酶 ） 中 ， 28 ， 70 r/件下 ， 酶解 h。對(duì)所得轉(zhuǎn)化子 的 生物學(xué)特性研究 表明 ，標(biāo)記后的菌株在菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)速度 、 等 條件下的生長(zhǎng) 特性與野生型菌株基本相同。 通過(guò)穩(wěn)定性篩選獲得 了 熒光強(qiáng)度、 遺傳 性狀穩(wěn)定 的轉(zhuǎn)化子 。 3利用 激光共聚焦掃描顯微鏡跟蹤觀察 了綠色熒光蛋白標(biāo)記 菌株在番茄植株內(nèi)的侵染 特性 ， 結(jié)果表明， 處理后的第 3 d、第 6 d 時(shí)，可見(jiàn)分子孢子萌發(fā)后從植株的根系侵入，此時(shí)植株的地上部無(wú)明顯變化； 第 10 d 時(shí)，菌絲體已到達(dá)植株的根系及莖基部維管束組織 ，植株的 根及 莖 基部 出現(xiàn)褐變現(xiàn)象 ；第 17 d 時(shí)，植株莖基部的菌 絲量增多， 番茄植株個(gè)別枝條萎焉，且莖基部出現(xiàn)了明顯的褐變 。 4. 跟蹤觀察了 因標(biāo)記菌株在不同 性質(zhì) 土壤中的 32 天的 定殖 情況 ，結(jié)果表明，標(biāo)記菌株能夠在不同性質(zhì)的土壤內(nèi) 至少 定殖 1 個(gè)月 ，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其定殖密度逐漸下降。 其中在水稻田土里存活能力最好，在沙土里存活能力最差。 關(guān)鍵詞： 茄科；尖孢鐮刀菌；綠色熒光蛋白； 侵染； 定殖 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 of is of to be of . to of by as as 1. 40 of 35 F. by 2. To . of . as 8 C 2h 20 r/ mL of an 0 mg/0 mg/8 C 70 r/, h. pH of as 3. of . in in 7 by -6 or of to At 0 in of 7 of in 4. . in to of of 2 . at in in in 1 第一章 前言 1. 茄科枯萎病的發(fā)生與危害 科枯萎病的分布 全世界茄科植物大約 80 屬 3000 種，分布范圍廣泛，遍及溫 帶及熱帶地區(qū)；我國(guó)共有 24 屬 105種 35 變種 1。包括枸杞屬、天仙子屬、曼陀羅屬、煙草屬、番茄屬、辣椒屬等。茄科蔬菜包括茄子、辣椒、番茄、馬鈴薯等，在蔬菜中占有重要地位，是百姓生活中必不可少的蔬菜美食，因此培育優(yōu)良的茄科蔬菜品種對(duì)于滿足社會(huì)生產(chǎn)、生活等方面的需要，具有重大的理論和實(shí)踐意義 2。 由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病，對(duì)茄科作物危害最大，防治困難，作物受害面積大，給農(nóng)民生產(chǎn)增收帶來(lái)很大困難，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，成為影響茄科蔬菜生產(chǎn)的一個(gè)重要病害 3。 尖孢鐮刀菌（ 是 一種世界性分布的病原真菌，存在于 各種土壤中， 甚至在極端環(huán)境 也可分離到 4。例如，辣椒枯萎病在國(guó)外早有報(bào)道， 20世紀(jì) 50年代在我國(guó)由俞大紱首次報(bào)道 ， 目前已廣泛分布于陜西、甘肅、廣西、四川、湖南、北京、浙江、山西等省 5。而番茄枯萎病在我國(guó)南方地區(qū)分布較多，影響較大，例如在廣西、廣東、福建等省，但是在北方寒冷地區(qū)如黑龍江省也逐漸流行開(kāi)來(lái) 6。尖孢鐮刀菌的寄主范圍也 十分 廣泛，目前已報(bào)道的被尖鐮孢菌嚴(yán)重為害的作物有香蕉、番茄、辣椒、棉花、蘿卜、西瓜、黃瓜、草莓、鷹嘴豆、甘蔗 、 郁金香 等多種植物。 生原 因 近年來(lái)，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，同時(shí)為了適應(yīng)人們對(duì)膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)整及優(yōu)化，我國(guó)茄科作物的種植面積不斷擴(kuò)大，在給廣大農(nóng)民帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，茄科作物病蟲(chóng)害也越來(lái)越嚴(yán)重。 當(dāng)前，國(guó)內(nèi)茄科作物的主要種植品種包括了辣椒、番茄、茄子、馬鈴薯等，為農(nóng)業(yè)主栽品種。這幾種作物常見(jiàn)病害有：灰霉病、黃萎病、枯萎病及青枯病等，主要病原菌有真菌、細(xì)菌，還有病毒導(dǎo)致的病害。但這些病害中，尤以枯萎病致病菌導(dǎo)致的病害最為廣泛、損失最為嚴(yán)重。一些種植戶由于管理不善或其他原因?qū)е铝丝菸〉陌l(fā)生與快速蔓延，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。分析有 以下幾個(gè)主要原因： 連作致病，我國(guó)農(nóng)村大部分地區(qū)的茄科種植戶相對(duì)穩(wěn)定，連作通常在 3萎病菌在病殘?bào)w和土壤中腐生，連年繁殖積累導(dǎo)致病原不斷增加。而發(fā)病率也不斷攀升，有的田塊達(dá)到 80 %以上。 種子帶菌， 枯萎病原菌以菌絲體或厚垣孢子隨病殘?bào)w在土壤中或附著在種子上越冬。帶菌的種子和帶有病殘?bào)w的有機(jī)肥是無(wú)病區(qū)的初始感染源，病原菌從幼苗移栽傷口侵入到維管束內(nèi)并繁殖蔓延，引起作物萎蔫。 蟲(chóng)害導(dǎo)致，部分田塊的土壤中存在有一定量的線蟲(chóng)等地下害蟲(chóng)，病原菌從害蟲(chóng)危害后的傷口侵入根部從而導(dǎo)致感染。 肥水管理不當(dāng)， 施肥水平較高的大棚其枯萎病發(fā)病率明顯高于施肥水平較低的大棚，原因是植株根系處于高肥水土壤環(huán)境中，生長(zhǎng)緩慢，加之低地溫形成根腐傷口，病原菌隨水傳播。同時(shí)肥料結(jié)構(gòu)對(duì)該病的影響也較大，氮、磷肥施用過(guò)多，而鉀肥和有機(jī)肥的施用不足，造成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)旺，植株機(jī)體的抗病性降低，雨天后放晴及氣溫升高，多方面因素導(dǎo)致了感病機(jī)率增加 7。 播危害 隨著生產(chǎn)集約化程度的提高，茄科作物保護(hù)地的種植面積逐年擴(kuò)大且存在重茬，導(dǎo)致茄科病害日趨嚴(yán)重，其中枯萎病最為普遍，嚴(yán)重影響了蔬菜品質(zhì)及產(chǎn)量，直接影響了農(nóng)戶的經(jīng)濟(jì)收入。 自本世 紀(jì)初（ 1905）發(fā)現(xiàn)番茄枯萎病以來(lái)，在世界上大部分國(guó)家均有發(fā)生 8。如今的番茄枯萎病福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 已成為其主要病害之一，發(fā)病規(guī)模越來(lái)越大，有的地方發(fā)病率達(dá)到 80 %，病株率在 10 %，減產(chǎn)10 %，給番茄生產(chǎn)帶來(lái)巨大威脅 9。辣椒枯萎病是由半知菌亞門(mén)尖孢鐮刀菌辣椒專化型（ 染引起的。在發(fā)病地區(qū)，該病的發(fā)病率一般為 15 %，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70 %，有時(shí)甚至導(dǎo)致絕收，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病在國(guó)外早有報(bào)道 10， 20世 紀(jì) 50年代在我國(guó)由俞大紱最早鑒定 11。以后，北京李明遠(yuǎn)等（ 1987） 12、浙江葛起新（ 1991） 13等也有記述。目前陜西、甘肅、廣西、四川、湖南、北京、浙江、山西等地已相繼有此病的報(bào)道。保護(hù)地茄子的土傳病害較為嚴(yán)重，有些病害的病菌在土壤中存活時(shí)間可長(zhǎng)達(dá) 3用化學(xué)藥劑很難控制，如枯萎病、黃萎病等非常頑固，難以防治。一旦條件適宜，可能會(huì)造成大流行。而老菜區(qū)，發(fā)病率逐年提高，嚴(yán)重地塊發(fā)病率在 50 %，甚至絕收，給生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失 14。 枯萎病是種土傳病害，主要危害植株維管束，一般 在作物花期或結(jié)果期開(kāi)始發(fā)病，癥狀自下而上逐漸顯現(xiàn)，該病傳染性強(qiáng)，但病程較為緩慢，一般 15同種蔬菜作物的具體表現(xiàn)癥狀有差異 ：番茄枯萎病在開(kāi)花結(jié)果期始發(fā)，發(fā) 病初期僅莖的一側(cè)自下而上出現(xiàn)凹陷區(qū)，致一側(cè)葉發(fā)黃，變褐后萎焉枯死；也有的從植株距地面近地葉序始發(fā)，逐漸向上蔓延。剖開(kāi)病莖，維管束變褐，濕度大時(shí)，病部產(chǎn)生粉紅色霉層，即病菌的分生孢子梗和分生孢子，無(wú)乳白色粘液流出，有別于青枯病 15,16；茄子枯萎病，病株葉片自上而下逐漸變黃枯萎，癥狀多表現(xiàn)在一、二層分支上，有的同一葉片僅半邊黃，另一半健 康如常，該病易于黃萎病混淆，需要 17；甜椒、辣椒枯萎病，發(fā)病初期根部或根頸處常發(fā)生水漬狀褐色斑點(diǎn)，嫩芽和嫩葉生長(zhǎng)緩慢，色澤暗，發(fā)病輕的在晴天中午萎蔫，早晚和陰天恢復(fù)正常，可持續(xù) 2期根頸處及主根、側(cè)根基部皮層干裂，容易剝落，植株下部葉片大量脫落，莖基部皮層發(fā)生水漬狀腐爛，莖稈和葉片迅速凋萎。發(fā)病后期，病株側(cè)根很少，植株很容易被拔起。相對(duì)濕度較大時(shí)，病部長(zhǎng)出豐茂的白色菌絲或藍(lán)綠色霉?fàn)钗?。莖基部近地面段干腐或出現(xiàn)縱向枯死的長(zhǎng)條斑。折斷莖稈可見(jiàn)根頸部維管束變褐，外部也常呈褐色。病株地下部 根系也呈水浸狀軟腐，皮層極易剝落，木質(zhì)部變成暗褐色至煤煙色 18 病規(guī)律 番茄枯萎病以菌絲體，厚垣孢子隨病殘?bào)w在土壤、糞肥或附著在種子上越冬番茄種子帶菌，成為下一年的初次侵染源，病菌主要從根部、根莖部的傷口侵入，然后在維管束中大量繁殖，阻塞導(dǎo)管并產(chǎn)生毒素。毒素在植株體內(nèi)上下擴(kuò)散。植株在導(dǎo)管被阻和毒素的雙重作用下使整株枯死。帶病種子的調(diào)運(yùn)是本病遠(yuǎn)距離傳播的途徑。田間病菌的傳播主要靠流水和帶菌土壤。土壤潮濕，連作，耕作時(shí)傷根，生長(zhǎng)勢(shì)弱，氮肥施用過(guò)量或缺少鉀肥的地塊均易發(fā)病。 而枯萎病株的空間分布格局亦是該病原菌種群的重要屬性之一，由物種的遺傳特性和生態(tài)環(huán)境條件決定。 番茄枯萎病喜高溫高濕。發(fā)病程度與土溫關(guān)系很大。發(fā)病最適土溫為 26 ，最高為 33 ，21 以下病害受抑制。暴雨過(guò)后，天氣晴朗，氣溫回升有利于病害的擴(kuò)展蔓廷，特別在酸性較大的土壤，病害擴(kuò)展更快。就番茄生育期看，發(fā)病高峰期出現(xiàn)于植株生長(zhǎng)中后期；從季節(jié)看，夏植番茄和 911冬末初春播種移栽， 319。辣椒枯萎病由鐮刀菌引起，只危害辣椒和甜椒。病原菌主要以厚 垣孢子在土壤中越冬，在土壤中可進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的腐生生活，據(jù)報(bào)道，該病菌在土壤中存活年代為 6菌主要借助灌溉水或雨水傳播，也可隨病土借風(fēng)吹到別處。辣椒枯萎病的發(fā)生的最適溫度為 24 ，高于 35 或低于 17 均不利于其發(fā)育。排水不良、畦面凹凸不平、干濕不均的地塊發(fā)病嚴(yán)重。在適宜發(fā)病條件下 2周即出現(xiàn)死株現(xiàn)象。潮濕或水漬田易發(fā)病，重茬地， 秧苗老化、土壤過(guò)酸、缺鉀肥或線蟲(chóng)多的地方易加劇病害的發(fā)展 20。 茄子枯萎病多發(fā)生在成株期 ， 病原菌以菌絲體或厚垣孢子隨病殘?bào)w在土壤中或附著在種子上越冬 。 在溫 度達(dá) 25 ， 土壤潮濕時(shí)， 移栽中傷根時(shí) 極利于發(fā)病。 當(dāng) 氣溫在21 以下或 33 以上 時(shí) 病害受到抑制 21。 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 3 2. 茄科枯萎病的病原菌 枯萎病是一種世界性分布的土傳病害，由鐮刀菌屬真菌寄生引起 22。目前已知的鐮刀菌有：串珠鐮刀菌 （ F. ，串珠鐮刀菌膠胞變種 （ F. ，本色鐮刀菌 （ F. ，半裸鐮刀菌 （ F. ，銳頂鐮刀菌 （ F. ，燕麥鐮刀菌 （ F. ，木賊鐮刀菌 （ F. ，尖孢鐮刀菌 （ F. 禾谷鐮刀菌 （ F. ，網(wǎng)脈鐮刀菌 （ F. ，桑布鐮刀菌 （ F. ，黃色鐮刀菌 （ F. 茄病鐮刀菌 （ F. 等 23。茄科作物枯萎病國(guó)內(nèi)外早有報(bào)道，其中尖孢鐮刀菌 （ F. 是其主要致病菌，包括非致病菌、植物致病菌以及人類致病菌，除了草和大多數(shù)木本作物，大多數(shù)栽培作物都是致病菌的寄主 24， 尖孢鐮刀菌屬半知菌類 （ 梗孢目（ 痤孢科（ 鐮刀菌屬（ 植株被尖孢鐮刀菌侵染后，發(fā)病癥狀多種多樣，一般導(dǎo)致維管束枯萎、植株枯黃、球莖和根腐爛，植株生長(zhǎng)衰弱 22， 造成重大經(jīng)濟(jì)損失，成為影響茄科蔬菜生產(chǎn)的一個(gè)重要病害。 尖孢鐮刀菌 （ 的分類相當(dāng)復(fù)雜，關(guān)于種的區(qū)分 也 比較含糊。尖鐮孢菌的形態(tài)學(xué)和生理學(xué) 特征 變異很大，一般只能達(dá)到種間分類的水平。威倫威伯等人 根據(jù)該菌的巨型和微型分生孢子的結(jié)構(gòu)：包括它們的形狀 ，中隔膜的出現(xiàn)及數(shù)量，分生孢子的顏色，厚垣孢子的有無(wú)以及菌絲體培養(yǎng)物其它某些可測(cè)定的特征建成尖鐮孢的分類體系。而辛德和漢森則將威倫威伯的劃分體系加以簡(jiǎn)化，根據(jù)它們的形態(tài)學(xué)將尖鐮孢劃分為種，而根據(jù)它們的分離株系或小種的致病力大小創(chuàng)立出各種形式的?；?25。 不同專化型在不同地區(qū)的分布又有所不同，這種差異反應(yīng)了尖孢鐮刀菌對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的選擇，表現(xiàn)在其對(duì)不同環(huán)境利用的生長(zhǎng)特性上。朱育菁等對(duì)尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)特性進(jìn)行了深入研究 26。藍(lán)江林研究了溫度對(duì)尖孢鐮刀菌菌株生長(zhǎng)的影響 27。 番茄枯萎病由尖孢鐮刀菌番茄專化型 引起，在 1895 年英國(guó)