實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)設(shè)計(jì)大綱實(shí)驗(yàn)名稱：普通小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV)感染模型比較 課題來(lái)源：自選 設(shè)計(jì)班級(jí)：2004級(jí)檢驗(yàn)本科班 設(shè)計(jì)人員：羅坤 設(shè)計(jì)日期：2007年5月26日 指導(dǎo)老師：張曉 陳建敏 成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)教研室2007年制一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的意義：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的意義，國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，存在的問(wèn)題，解決問(wèn)題的思路。目的與意義比較研究BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的特點(diǎn),建立理想動(dòng)物模型, 為研究發(fā)病機(jī)理和防治措施奠定基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀人呼吸道合胞病毒( human respiratory syncytial virus, RSV) 是全球嬰幼兒下呼吸道感染首位病毒病原體, 幾乎所有兒童兩歲前感染過(guò)至少一次RSV1,年齡越小病情越重, 再感染率高, 與哮喘發(fā)生密切相關(guān)2。免疫缺陷者更易感染, 臨床癥狀更為嚴(yán)重,常致死亡3。每年住院治療的50%-75% 嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎和25% 40% 的肺炎是RSV直接引起, 1 歲內(nèi)嬰兒RSV感染率68.8%, 1-2 歲感染率達(dá)82.6%100%。嬰兒期急性RSV 下呼吸道感染使非特應(yīng)體質(zhì)和特應(yīng)體質(zhì)兒童發(fā)生哮喘危險(xiǎn)性都比普通兒童明顯增加, 是哮喘的獨(dú)立危險(xiǎn)因素4雖然已有許多抗RSV 制劑和疫苗的研究, 但尚無(wú)安全有效的防治方法。抗RSV 制劑的研究需要建立理想的動(dòng)物模型, 但目前已建立的系列感染模型均不夠滿意。肺組織RSV抗原保護(hù)性免疫僅能維持?jǐn)?shù)月, 福爾馬林滅活疫苗不能起到保護(hù)作用反而加重病情, 至今RSV 仍無(wú)安全有效的治療藥物和預(yù)防疫苗, 脫氧核酶等新型抗RSV制劑正在研究中, 已在體外無(wú)細(xì)胞體系和細(xì)胞模型中表現(xiàn)抗病毒活性, 需要建立恰當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型, 進(jìn)一步在體內(nèi)研究其抗病毒作用5。從RSV 發(fā)現(xiàn)至今,已建立的黑猩猩、獼猴、雪貂、牛、棉鼠、豚鼠和小鼠等感染模型各有優(yōu)勢(shì)和局限6, 除靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物可出現(xiàn)臨床癥狀, 其他都是無(wú)癥狀隱性感染7。BALB/c小鼠為近交繁殖產(chǎn)生，其對(duì)多種病原體具有易感性，利用小鼠建立模型的優(yōu)點(diǎn)是它易獲得, 遺傳背景清楚而均一, 基因改造技術(shù)成熟, 已有多種商品化試劑, 是目前應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但小鼠不是RSV 自然宿主, 我們以往實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BALB/c 鼠感染RSV 沒(méi)有臨床癥狀, 肺內(nèi)病毒復(fù)制水平相對(duì)低, 病毒滴度下降快, 帶毒時(shí)間短, 限制了治療效果的觀察8。裸小鼠采用nu+雌鼠與nunu雄鼠交配方法產(chǎn)生，這種無(wú)毛小鼠是由于第11號(hào)染色體等位基因突變引起的，裸小鼠主要特征是無(wú)毛、裸體和無(wú)胸腺，缺乏成熟T細(xì)胞的免疫功能，B淋巴細(xì)胞正常，成年裸小鼠較普通小鼠有較高水平的NK細(xì)胞活性，目前未做過(guò)裸小鼠RSV感染模型，對(duì)其優(yōu)勢(shì)和局限尚不完全清楚。存在的問(wèn)題：目前雖然已有許多抗RSV 制劑和疫苗的研究, 但尚無(wú)安全有效的防治方法，RSV感染具體發(fā)病機(jī)制也不夠清楚，其發(fā)病機(jī)制和抗RSV 制劑的研究需要建立理想的動(dòng)物模型, 但目前已建立的系列感染模型均不夠滿意。解決問(wèn)題的思路： 復(fù)制BALB/c鼠和裸鼠RSV感染模型 ，不同時(shí)間空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺組織病毒滴度, 計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)情況, 免疫熒光和免疫組化檢測(cè)RSV 抗原, 光鏡和電鏡檢查肺組織病理學(xué)改變，比較研究BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的特點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：1 BlackCP. SystematicReviewoftheBiologyandMedical Management ofRespiratory Syncytial Virus InfectionJ. Respiratory Care, 2003; 48( 3) :209- 233.2 Holt PC, S1y PD.Interactions between RSV infection, asthma andatopy: unraveling the complexities J. J Exp Med, 2002; 196( 10) :1271- 1275.3 Meissner HC, RennelsMB, PickeringLK, et al.Risk of severe respiratorysyncytial virus disease, identification of high risk infants and recommendationsfor prophylaxis with palivizumabJ.Pediatr Infect Dis J, 2004;23( 3) : 284- 285.4 OddywH, de Merk NH, S1y PD, et a1. The effects of respiratory infections,atopy and breastfeeding on childhood asthma J.Eur Respir J,2002; 19( 5) :899- 905.5 ZhaoC- A,ZhaoX- D,YuH- Get al. Inhibitionofrespiratory syncytialvirus replication in cultured cells by RNA cleaving DNAzyme J.Chin JPediatr, 2003; 41( 8) : 594- 598.6 Schmidt AC, Johnson TR, Peter JM, et al.Respiratory syncytial virusand other pneumoviruses: a review of the international symposium- RSV2003J.Virus Research, 2004; 106 : 1- 13.7 McArthur- Vaughan K, Gershwin LJ.A rhesus monkey model of respiratorysyncytial virus infectionJ.J Med Primatol, 2002; 31( 2) : 61- 73.8 Lian G- L, Yu H- G, ZhaoX- D, et al.Establishment of respiratory syncytialvirus infection model in miceJ. J Xian JiaotongUniversity( MedicalSciences) , 2003; 24( 4) : 329- 332. 二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目標(biāo),擬解決的主要問(wèn)題, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)專(zhuān)業(yè)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)，可行性分析,預(yù)期結(jié)果，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)工作時(shí)間安排）。（一）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目標(biāo)，擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題設(shè)計(jì)目標(biāo)比較研究BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的特點(diǎn),以建立理想動(dòng)物模型擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的復(fù)制，對(duì)試驗(yàn)性RSV 感染的模型進(jìn)行分組與實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)計(jì)（主要內(nèi)容包括：遺傳背景，微生物質(zhì)量控制，育種繁殖，飼養(yǎng)管理，動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)技術(shù)）（1）遺傳背景BALB/c鼠遺傳背景：近交系BALB/c小鼠裸小鼠遺傳背景：采用nu+雌鼠與nunu雄鼠交配方法產(chǎn)生的同源導(dǎo)入近交系小鼠。（2）微生物質(zhì)量控制BALB/c小鼠微生物質(zhì)量要求：普通級(jí)動(dòng)物要求。裸小鼠微生物質(zhì)量要求： SPF（無(wú)特定病原體）或無(wú)菌要求 （3）育種繁殖BALB/c小鼠育種繁殖：繁殖方法：近交繁殖初始動(dòng)物的選擇：挑選一對(duì)或幾對(duì)具有育種目標(biāo)要求的性狀的全同胞兄妹性別鑒定：1、雄鼠的生殖器距肛門(mén)較遠(yuǎn)2、雄鼠生殖器與肛門(mén)之間長(zhǎng)毛3、雄鼠的生殖器較雌鼠大4、雌鼠乳頭較雄鼠明顯性成熟期：35-55日齡；實(shí)配年齡：60日齡左右；成熟時(shí)體重：20克以上發(fā)情鑒定：動(dòng)情期小鼠外陰部腫脹紅潤(rùn)，撫摸其身體出現(xiàn)脊柱前凹、抬臀等行為現(xiàn)象配種：動(dòng)情前期交配 交配形式：采用全同胞兄妹交配形式妊娠診斷：摸胎法、陰道涂片法、外形涂片法、直腸檢查法育種代數(shù)：作為親本的全同胞兄妹（初始動(dòng)物）記為0代，按雌雄1：1進(jìn)行交配，所生后代記為第1代，從中又選留滿意的一對(duì)或幾對(duì)全同胞兄妹作親本，按雌雄1：1進(jìn)行交配，以此類(lèi)推，直到20代以上個(gè)體選擇：選擇留繁殖力強(qiáng)，生活力強(qiáng)，特別是目標(biāo)性狀和基因保種方法：平行線系統(tǒng)擴(kuò)大繁殖生產(chǎn)方法：交通信號(hào)燈方法裸小鼠育種繁殖:繁殖方法：近交繁殖（同源導(dǎo)入近交）初始動(dòng)物的選擇：挑選一對(duì)或幾對(duì)具有育種目標(biāo)要求的性狀的全同胞兄妹性別鑒定：1、雄鼠的生殖器距肛門(mén)較遠(yuǎn)2、雄鼠的生殖器較雌鼠大3、雌鼠乳頭較雄鼠明顯發(fā)情鑒定：動(dòng)情期小鼠外陰部腫脹紅潤(rùn)，撫摸其身體出現(xiàn)脊柱前凹、抬臀等行為現(xiàn)象配種：動(dòng)情前期交配交配形式：采用nu+雌鼠與nunu雄鼠交配方法，雌雄比例為1：1，有時(shí)可采用1：2或1：3妊娠診斷：摸胎法、陰道涂片法、外形涂片法、直腸檢查法（平均每胎所得純合子仔鼠能占仔數(shù)的550，離乳率97，14胎生育恒定，一年存活率達(dá)100 ，最長(zhǎng)生存期可達(dá)752 d。）育種代數(shù)：作為親本nu+雌鼠與nunu雄鼠記為0代，按雌雄1：1進(jìn)行交配，所生后代記為第1代，從中又選留滿意的一對(duì)或幾對(duì)全同胞兄妹作親本，按雌雄1：1進(jìn)行交配，以此類(lèi)推，直到20代以上個(gè)體選擇：選擇留繁殖力強(qiáng)，生活力強(qiáng)，特別是目標(biāo)性狀和基因保種方法：平行線系統(tǒng)擴(kuò)大繁殖生產(chǎn)方法：交通信號(hào)燈方法（4）飼養(yǎng)管理BALB/c小鼠飼養(yǎng)管理:BALB/c小鼠環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室的溫度為18-19，相對(duì)濕度為40%-70%，每小時(shí)換氣次數(shù)為10-20次，噪聲在60分貝以下，每立方米空氣中氨濃度在14mg以下，工作照度為150-300lxBALB/c小鼠設(shè)施：開(kāi)放系統(tǒng)BALB/c小鼠籠器具：采用無(wú)毒塑料籠具，墊料選用具良好吸濕性、無(wú)毒性、無(wú)異味、塵埃少的材料如電刨花，墊料須經(jīng)高壓蒸汽滅菌BALB/c小鼠飼喂：飼喂小鼠全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，飼料的消毒滅菌應(yīng)達(dá)到相應(yīng)等級(jí)小鼠微生物控制的要求。飼喂采取“少量勤添”的原則，每周喂料3-4次，飲水應(yīng)保證連續(xù)不斷，每周換水2-3次，墊料每周更換1-2次BALB/c小鼠飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生消毒：做好室內(nèi)的清潔、消毒、及飼料籠器具的清洗消毒，每次飼養(yǎng)完后，用苯扎溴銨擦拭籠架、地板，每月定期徹底噴霧消毒1次裸小鼠飼養(yǎng)管理:裸小鼠環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室的溫度為18-19，相對(duì)濕度為40%-70%，每小時(shí)換氣次數(shù)為10-20次，噪聲在60分貝以下，每立方米空氣中氨濃度在14mg以下，工作照度為150-300lx，空氣潔凈度為100000級(jí)裸小鼠設(shè)施：屏障系統(tǒng)或隔離系統(tǒng)裸小鼠籠器具：采用無(wú)毒塑料籠具，墊料選用具良好吸濕性、無(wú)毒性、無(wú)異味、塵埃少的材料如電刨花，一般所有的籠具、墊料、飼料、飲水等都得經(jīng)過(guò)滅菌消毒 裸小鼠飼喂：每周飼喂全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料23次。飼料、飲水、墊料及鼠籠均用雙層包布包裝高壓蒸汽滅菌消毒。進(jìn)室前經(jīng)緩沖室紫外燈照射后去除外層包布，才能進(jìn)入繁殖室及實(shí)驗(yàn)室裸小鼠飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生消毒： 繁殖室設(shè)在空氣過(guò)濾十萬(wàn)級(jí)環(huán)境中放置層流柜作為裸小鼠繁殖飼養(yǎng)條件。啟用前，先用2新潔而滅全面擦拭，然后按消毒區(qū)域的容積用高錳酸鉀15 g，In2加福爾馬林15 mL混和熏蒸。最后經(jīng)紫外燈照射，細(xì)菌培養(yǎng)陰性才使用。啟用后我們的常規(guī)消毒是：進(jìn)實(shí)驗(yàn)室前后紫外燈照射30 rain，每2周用2新潔而滅擦拭墻壁、天花板，每一個(gè)月用過(guò)氧乙酸噴射消毒。每三個(gè)月用甲醛和高錳酸甲熏蒸一次(用備用實(shí)驗(yàn)室輪流消毒和使用)。每三個(gè)月將層流柜的過(guò)濾材料拆下進(jìn)行清洗。每年更換一次過(guò)濾材料。飼養(yǎng)人員定期入繁殖室進(jìn)行飼養(yǎng)管理操作。進(jìn)室前需淋浴并用新潔而滅常規(guī)泡手、消毒、穿無(wú)菌衣、帶襪的無(wú)菌褲、戴口罩、帽子。外層穿上手術(shù)隔離衣，并帶手術(shù)膠手套及無(wú)菌紗手套。每次操作完畢，用新潔而滅抹臺(tái)面及地面。常規(guī)每周換兩次籠具，投放3 4 d的飼料與飲水。每周加兩次雞蛋和瓜子及一次維生素。2、實(shí)驗(yàn)專(zhuān)業(yè)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用BALB/c鼠和裸小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。處理措施：感染RSV。觀察指標(biāo)：感染RSV 后不同時(shí)間空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺組織病毒滴度, 計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)情況, 免疫熒光和免疫組化檢測(cè)RSV 抗原, 光鏡和電鏡檢查肺組織病理學(xué)改變3、實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)結(jié)果用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示, 兩兩組間比較用t 檢驗(yàn), 各組間比較用方差分析。= 0.05,P0.05 認(rèn)為有顯著性差異。4、實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線BALB/c小鼠C ：感染6 天的BALB/c 小鼠B ：感染3 天的BALB/c 小鼠A ：對(duì)照BALB/c 小鼠D ： 對(duì)照裸鼠裸小鼠F ：感染6 天的裸鼠E ：感染3 天的裸鼠不同時(shí)間空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺組織病毒滴度, 計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)情況, 免疫熒光和免疫組化檢測(cè)RSV 抗原, 光鏡和電鏡檢查肺組織病理學(xué)改變實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法（1）隨機(jī)抽樣：選正常成年健康體重相近的BALB/c小鼠30只和裸小鼠30只，分別將30只BALB/c小鼠和30只裸小鼠按體重由小變大編號(hào)后，從隨機(jī)數(shù)字表中查取隨機(jī)數(shù)字，依次抄錄于小鼠編號(hào)下。具體方法：兩種動(dòng)物編號(hào)為130號(hào)，30只BALB/c小鼠按照能被3除的規(guī)律：不余到A組，余1到B組，余2到C組 ；30只裸小鼠BALB/c小鼠按照能被3除的規(guī)律：不余到D組，余1到E組，余2到F組 （2）實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分六組： A ：對(duì)照BALB/c 小鼠 B ：感染3 天的BALB/c 小鼠C ：感染6 天的BALB/c 小鼠 D ： 對(duì)照裸鼠E ：感染3 天的裸鼠F ：感染6 天的裸鼠（3）模型復(fù)制:1 .病毒和細(xì)胞培養(yǎng):Hep- 2 細(xì)胞接種RSV 標(biāo)準(zhǔn)A2 株病毒, 含2% 胎牛血清( FBS) DMEM培養(yǎng)至病變達(dá)90%100%, 吸取培養(yǎng)液, 4, 3000g 離心10min收集上清, - 80儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.病毒接種: BALB/c小鼠和無(wú)特殊病原菌( specific pathogen free, SPF) 級(jí)812 周齡、雌性裸鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉0.06mg/g 麻醉后, 感染組鼻腔緩慢滴入2106PFU/ ml RSV A2 株病毒液50l, 陰性對(duì)照組滴入50l 2% FBS DMEM。(4)取材:病毒分離和滴度分析:感染后不同時(shí)間處死小鼠, 無(wú)菌條件下取左肺、肝臟和脾臟稱重, 按10ml/g( wt/vol) 加入預(yù)冷組織平衡液, 勻漿制備肺臟、肝臟和脾臟組織懸液, 4, 2500g 離心10min, 取上清接種于Hep2 細(xì)胞, 2% FBS 1640 培養(yǎng)基, 37 , 5% CO2 培養(yǎng), 逐日觀察細(xì)胞病變。同時(shí)取肺組織懸液上清空斑形成實(shí)驗(yàn)分析肺組織病毒滴度。(5) 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定:1.空斑形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度:3105/ml Vero 細(xì)胞接種至6 孔板, 10%FBS 的1640 培養(yǎng)至單層致密無(wú)孔細(xì)胞, 接種10 倍倍比稀釋的病毒液100l, 每個(gè)濃度設(shè)復(fù)孔, 未感染病毒為對(duì)照孔。病毒吸附2h 后覆蓋含1.5%的瓊脂糖凝膠和2% FBS 的1640 培養(yǎng)基, 培養(yǎng)5 天, 5mg/ml MTT 顯色, 計(jì)數(shù)空斑, 計(jì)算病毒滴度: PFU/ml= 稀釋度 P= 該濃度下各孔空斑數(shù); n= 復(fù)孔數(shù); v= 每孔接種病毒液體積(ml)2.支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞計(jì)數(shù):感染后第3 天、6 天和9 天處死小鼠, 氣管插管, 預(yù)冷生理鹽水0.5ml 灌洗2 次, 收集支氣管肺泡灌洗液( BALF) , 血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。4, 1000g 離心10min, 取細(xì)胞沉渣涂片,Wright 染色, 顯微鏡下計(jì)數(shù)200 個(gè)白細(xì)胞, 按中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)分類(lèi)計(jì)數(shù)。3. 直接免疫熒光實(shí)驗(yàn):取感染后第3 天小鼠BALF 離心細(xì)胞沉渣涂片, 4丙酮固定干燥, 按Light Diagnostics Respiratory panel 1 DFA 免疫熒光試劑盒說(shuō)明書(shū)( Chemicon, USA) 鑒定RSV 抗原, 熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。4. 肺組織病理學(xué)檢查:感染后第3 天、6 天處死小鼠, 取未經(jīng)支氣管肺泡灌洗的右肺組織, 一部分4%多聚甲醛固定, 常規(guī)蘇木素- 伊紅( HE) 染色, 光鏡觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。另一部分立即2.5%戊二醛固定, 送重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室包埋、制成超薄切片, 透射電鏡檢查。5. 免疫組織化學(xué)檢查:RSV 抗原免疫組織化學(xué)染色SP 染色試劑盒( 北京中杉生物技術(shù)公司) , 一抗是針對(duì)RSV 整個(gè)病毒抗原的山羊多克隆抗體( USBiological, USA) 。4%多聚甲醛固定肺組織, 常規(guī)切片, 各步操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行, DAB 顯色后顯微鏡下觀察。同一標(biāo)本未滴加一抗的切片作陰性對(duì)照。圖像分析采用北航真彩色病理圖像分析系統(tǒng)4.0, 平均光密度反映染色強(qiáng)弱。（三）可行性分析1.小鼠易獲得,易飼養(yǎng);小鼠遺傳背景清楚而均一, 基因改造技術(shù)成熟, 已有多種商品化試劑,2.實(shí)驗(yàn)器械容易解決;本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒僮鞑粡?fù)雜;3.實(shí)驗(yàn)所需費(fèi)用不多; 實(shí)驗(yàn)時(shí)間不長(zhǎng)。