丙型肝炎臨床檢驗技術發(fā)展現(xiàn)狀與展望【關鍵詞】 HCV 抗原檢測 核心抗原 核酸檢測技術(NAT) 同時檢測 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的一種重要的世界性傳染病1,這種病毒主要經(jīng)由血液傳播，也可能存在其他傳播途徑如母嬰傳播、性傳播和家庭內(nèi)接觸傳播。約有近半數(shù)的HCV感染傳播途徑不明確。丙型肝炎的流行呈全球性，是歐美及日本等國家終末期肝病的最主要原因。根據(jù)WHO統(tǒng)計，全球HCV的感染率約為3，估計約2億人感染了HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約有3.5萬例。目前尚無治療丙型肝炎的疫苗，也沒有有效的治療方法。因此防控丙型肝炎傳染源及阻斷傳播途徑最為有效的手段就是早期準確診斷并及時發(fā)現(xiàn) HCV感染者。從傳染源和傳播途徑兩方面控制丙型肝炎2。正因為如此世界各國都在不遺余力地研究診斷丙型肝炎的新技術。自1989年建立了丙肝病毒抗-HCV檢測方法以來,隨著醫(yī)學檢測技術和儀器的不斷發(fā)展，丙型肝炎的檢測技術一直處于不斷發(fā)展中。到目前為止，丙型肝炎檢測技術主要有抗-HCV檢測、HCV-RNA核酸擴增檢測、HCV核心抗原的檢測以及同時檢測抗-HCV和HCV核心抗原4種類型。本文將對丙型肝炎臨床檢驗技術的發(fā)展與展望做一綜述，現(xiàn)報道如下。 1 抗-HCV的檢測 最早出現(xiàn)的HCV檢測技術是抗-HCV的檢測。由于HCV在病人外周血液中的含量及病毒抗原的含量很低，這就使得用常規(guī)方法難以直接檢測，經(jīng)過十幾年的不斷改進和發(fā)展，其檢測方法又演變出多種,如:雙抗原夾心 ELISA、間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(間接 ELISA)、重組免疫印跡法(RIBA)、蛋白芯片檢測法以及免疫層析法。在這些方法之中，重組免疫印跡法 (RIBA)是抗體檢測的金標準，蛋白芯片檢測法主要用于抗-HCV的分型。而ELISA由于其操作簡單，檢測設備廉價，因此成為應用最廣的抗體檢測技術。 根據(jù)出現(xiàn)時間的先后以及使用抗原的不同,抗-HCV檢測技術可分成三代。第一代抗-HCV IgG試劑盒所用的抗原來自病毒基因組非結構區(qū) (C100)，它的使用使 HCV的輸血感染率下降了80%以上。但其缺陷是:靈敏度較低,抗體檢出時間較晚, 敏感性也較高，達到8090，但假陽性較高。第二代試劑除了包被C100抗原外又加入了HCV核心區(qū)多肽C223和非結構區(qū)抗原C33C?？?C22-3和抗-C33C感染后出現(xiàn)較早,敏感性和特異性明顯提高，感染后812周即可檢測。且對 HCV的特異性較好,二者聯(lián)合應用可進一步提高檢出率。第三代HCV抗體ELISA試劑中采用了重組的NSS多肽，核心區(qū)抗原比例相對下降,而相應地增加了非結構區(qū)的NSS區(qū) C33C抗原的比例,添加了NSS區(qū)抗原使其敏感性和特異性得到進一步改善。 上述三代抗-HCV檢測方法多采用間接 ELISA,雖然也有過雙抗原夾心直接檢測抗-HCV的報道3,但由于HCV抗原存在不穩(wěn)定性,因此至今仍無商品化的試劑盒。目前我國市售的抗- HCV試劑盒普遍是采用間接法的第三代抗-HCV ELISA試劑盒和膠體金試劑盒,其特異性可以達到92%100%。但由于各廠家使用的HCV基因重組抗原的質量和各抗原片段包被比例有所不同，從而使各廠家試劑的靈敏度和特異性存在一定的差異，導致抗一HCV檢測結果的不一致，產(chǎn)生漏檢和假陽性等4，未能解決在正常ALT者和健康獻血者存在的假陽性問題。加上少部分免疫功能不正常的HCV感染者，則不能檢出抗一HCV。另外，由于“窗口期”的存在，仍有一定的漏檢率5。目前抗-HCV的檢測方法仍有改進的潛力，隨著對HCV的研究不斷深入,更多的 HCV蛋白會被發(fā)現(xiàn),其中新型核心蛋白和外膜蛋白被認為能有效提高抗-HCV的靈敏度,但其對抗體的檢出率依賴于抗原的獲得方法,可能與抗原的構象表位有關6,7。 2 HCV-RNA核酸擴增檢測技術(Nucleic-acid Amplification Technology NAT) 從外周血中檢出HCV RNA是HCV復制活躍的可靠指標,在感染2個星期內(nèi)的血清中可檢測到HCVRNA,在感染自然恢復前血清中 HCVRNA將達到一個高峰8, 目前NAT檢測被國內(nèi)外部分機構作為 HCV感染的確認方法。但HCV RNA在達到峰值或重新出現(xiàn)前數(shù)天或數(shù)周內(nèi)偶爾也可能檢測不到9。同時HCV RNA還受進食的影響,易與血中脂質及脂蛋白結合,降低檢出率10。因此在一定程度上影響了NAT檢測方法的完美。另外由于NAT檢測技術本身在技術和設備上要求較高,且耗時、實驗步驟較多(其中任何步驟出現(xiàn)問題均影響其檢出),因此該方法也容易因污染而出現(xiàn)假陽性,難以在常規(guī)工作或基層實驗室推廣,限制了其應用的普遍性。 NAT檢測技術同為檢測HCV RNA,但不同的廠商發(fā)展出不同的方法和技術,其中PCR技術發(fā)展得最為迅速,也得到了最廣泛的應用,最早的是 RT-PCR,然后是套式PCR,現(xiàn)在是實時熒光定量PCR,檢測靈敏度特異性不斷提高,且實現(xiàn)了全自動定量檢測。最新的NAT研究有環(huán)介導等溫基因擴增技術(LAMP)以及基因芯片技術11,12,由于LAMP技術操作簡單,且無需特殊儀器,具有廣闊的應用前景。 3 HCV抗原的檢測 目前報道有兩類HCV抗原包括非結構抗原和核心抗原的檢測可作為HCV感染的指標。血清中HCV抗原的檢測有利于 HCV感染患者的早期發(fā)現(xiàn),特別是某些免疫功能紊亂、免疫功能低下的患者和某些不產(chǎn)生抗體的攜帶者。HCV核心抗原與 HCV RNA的動力學變化密切相關,可以作為HCV復制的標志13。 近年來對HCV抗原的檢測方法的研究不斷取得進展,關鍵點在于單克隆抗體的研制以及抗原抗體復合物解離劑的研究。近期美國Ortho公司已推出了用雙抗體夾心法定性或定量檢測血清樣品中總的或游離的HCV核心抗原ELISA試劑盒,與 RT-PCR方法相比，具有操作簡單、耗時短、對實驗環(huán)境要求較低以及假陽性率低等特點,在臨床上可用于HCV血清學轉換前的早期急性丙型肝炎診斷、抗-HCV陽性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析等14。HCV核心抗原存在的時間較短(約2770d),所以HCV核心抗原的檢測還要結合抗-HCV的結果。同時HCV核心區(qū)基因的變異也可能影響了HCV核心抗原的檢測,比如HCV核心區(qū)49位氨基酸的突變就降低了抗原測定的敏感性15。改進現(xiàn)行試劑盒的主要途徑是提高單克隆抗體對于天然抗原的構象表位的親和力。 對于非結構蛋白的檢測主要為NS3、NS4和NS5位點的蛋白16,由于這部分蛋白出現(xiàn)變異的概率較大,目前僅見報道。 4 同時檢測抗-HCV和HCV核心抗原 聯(lián)合檢測抗原抗體的思路是HCV篩查試劑盒和血清學檢測的發(fā)展方向。目前主要把HCV核心抗原和外周蛋白抗體及部分核心抗體相結合的檢測試劑盒17。HCV核心抗原是HCV感染者體內(nèi)出現(xiàn)的早期感染指標，幾乎與HCV RNA同時出現(xiàn)，核心抗原和HCV RNA的動力學變化密切相關。 HCV核心抗原檢測用雙抗體夾心法定性或定量檢測血清樣品中的HCV核心抗原。該方法不受被檢測樣品中抗-HCV的干擾,檢測結果準確可靠?？捎糜贖CV早期急性丙型肝炎診斷，抗-HCV陽性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析18。目前已有兩家商品化的試劑盒面世,但是這兩種試劑盒都使用兩步檢測,而且檢測時間都較長（超過2h）,不利于快速的篩查和POCT工作。另外這兩種試劑盒都不能區(qū)分陽性樣本中抗原和抗體的存在情況,不利于進一步分析病情。 綜上所述,無論HCV檢測技術的怎么發(fā)展，都必須秉著快速、準確和有效這些原則。由此可以預測未來HCV檢測技術會朝著兩個方向發(fā)展,一方面是要求技術上的快速、精確反應 HCV感染狀況的檢測，降低假陽性的概率，使人們盡早發(fā)現(xiàn)病情。另一方面是有助于治療HCV和療效觀察的檢測，不斷優(yōu)化治療HCV的方法，爭取早日研究出治療HCV的疫苗。對于第一種方向,人們較為容易理解,因為隨著實驗技術的不斷進步,HCV檢測的靈敏度逐步提高，HCV感染的“窗口期”將不斷縮短。第二種方向也是當前分子診斷領域的方向,人們可以通過新的檢測方法或是幾種 HCV檢測方法的綜合應用來判斷病人的病情,從而給予臨床治療提供及時幫助和指導。 參 考 文 獻 1 張賀秋丙型肝炎病毒核心抗原檢測技術國內(nèi)外臨床研究應用情況J丙型肝炎病毒核心抗原檢測技術研究與應用論文匯編，1-8 2 買制剛丙型肝炎臨床檢驗技術現(xiàn)狀與發(fā)展J中國衛(wèi)生檢驗雜志，200818(1)：190-191. 3 張賀秋,王國華,陳坤,等.丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法酶聯(lián)免疫試劑的初步臨床評價J.臨床輸血與檢驗, 2006, 8(1):12-13. 4 王福生ELISA和PCR法篩查無償獻血者結果的分析J細胞與免疫學雜志.2010,26(4)：398. 5 謝立，吳曉東丙型肝炎病毒檢測方法的研究進展及其臨床意義J.世界華人消化雜志，2005,13(7)：884886. 6 魏葆,李金明.丙型肝炎病毒感染篩檢中抗原表位的應用及其研究進展J中華肝臟病雜志,2006,14(12):955-957. 7 邵圣文,武文斌,于建國,等.丙型肝炎病毒F蛋白抗原性及患者血清F抗體流行率的研究J.中華肝臟病雜志,2006, 14(12):890-893. 8 Castillo I,Rodr guez-IÌigo E, Bart olomJ,et alHepatitis C virus replicates in peripheral blood mononuclear cells of patients with occulthepatitis C virus infectionJ.Gut,2005,54(5):682-685. 9 陳朝霞,閔保華,陳延平.影響HCV-RNA熒光定量PCR檢測的因素及其對策J國際檢驗醫(yī)學雜志,2007, 28(02):175-176. 10 Yatsuhashi H,YanoM.The present state and problems of HCV blood screening system in blood productsJ.Nippon Rinsho,2001,59(7):1303-1307. 11 李啟明，馬學軍，周蕊，等.環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因檢測中的應用J病毒學報, 2006, 22(5)：334-338 12 陳姝,楊光,崔金環(huán),等膜芯片技術診斷乙型和丙型肝炎病毒與基因分型J現(xiàn)代預防醫(yī)學，2007，34(05)：817819 13 Lee S, Kim YS, JoM, et al.Chip-based detection of hepatitis C virus using RNA ap tamers that s pecifically bind to HCV core antigen J.Biochem Biophys Res Commun,2007,358 (1):47-521. 14 Ansaldi F, B Bruzzone G, Testino M, etal.Combination of hepatitis C virus antigen and antibody immunoassay as a new tool for early di-agnosis of infectionJ.J Viral Hepat,2006,13:5-10. 15 Kmieciak D,Biernacka-Lukanty J, Migdalski P,et al.A correlati on between the heter ogeneity of hypervariable regi on 1 of E2 glycop roteinof Hepatitis C virus (HCV) and HCV antibody p r ofile: a case studyJ.Acta Virol,2005,49(2):97-103. 16 Dipti CA, Jain SK, Navin K.A novel recombinant multiepitope pro-tein as a hepatitis C diagnostic intermediate of high sensitivity and specificityJ.Protein Expr Purif,2006,47(1):319-328. 17 Schnuriger A,S Domingue