大鼠腸粘膜不同狀態(tài)下轉(zhuǎn)化生長因子的表達 作者：姚文柱胡家露吳開春崔大祥 【關(guān)鍵詞】 轉(zhuǎn)化生長因子 關(guān)鍵詞: 轉(zhuǎn)化生長因子;腸粘膜/損傷;修復(fù);抗體 摘 要:目的 動態(tài)觀察轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）在不同腸粘膜病理狀態(tài)下的表達，探討TGF在腸粘膜損傷后修復(fù)過程中所起的作用. 方法 以巴西日圓線蟲（Nippostrongylus bras-iliensis，Nb）感染大鼠建立腸粘膜損傷修復(fù)模型，手術(shù)取出不同感染階段大鼠小腸腸段，標(biāo)本冰凍保存，切片.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測TGF的表達. 結(jié)果 在大鼠腸粘膜感染Nb后發(fā)生的損傷至修復(fù)過程中，TGF，TGF1的表達發(fā)生了明顯的規(guī)律性的變化，即TGF先是表達于腸絨毛隱窩區(qū)域的上部，接著逐漸向腸絨毛的頂端區(qū)域轉(zhuǎn)移;而TGF1先是主要表達于腸絨毛的頂端部位及隱窩區(qū)域的上部，隨之頂端部位的表達逐漸減少，最后主要定位表達于隱窩區(qū)域的上部.固有膜內(nèi)TGF，TGF1也有表達，但粘膜損傷前后及修復(fù)過程中，其表達強度及部位無明顯變化. 結(jié)論 TGF，TGF1在粘膜損傷后可能通過在粘膜上皮細胞表達部位的變化，促進細胞分化、遷移和增殖，與粘膜損傷后修復(fù)關(guān)系密切. Keywords:transforming growth factor;intestinal mucosa/iusures;ristitution;antibody Abstract:AIM To investigate the role of TGFand TGFduring the all course of the restitution of wounded gastroin-testinal epithelia after injury in vivo.METHODS Rat small intestine was infected with Nippostrongylus brasiliensis（Nb）as the model of epithelia injury-and-restitution.Rat intestinal fragments were obtained surgically and preserved frozen，and then sliced up.The expression of TGFand TGFwas as-sessed by immunohistochemistry.RESULTS An expansion of the proliferative compartment and increased turnover of in-testinal epithelial cell were seen in rat intestine of this model.Expression of TGFand TGFpeptides was shown in both the epithelial cell and lamina propria compartment.Different patterns of TGFand TGF1expression were seen within the epithelium cell of rats with intestinal injury and restitution compared with untreated controls.In control groups，the strongest staining was present in epithelia cells located on the villus tips for TGFand upper cypt regions for TGF1.After Nb infection，the expression of TGFwas seen in the upper crypt regions first and migrated towards the villus tips which was consistent with the process of restitution;On the con-trary，the expression of TGF1was seen in the villus tips first and migrated towards the upper crypt regions conse-quently.The expression of these peptides within lamina pro-pria was not changed.CONCLUSION Epithelial restitution is associated with compensatory changes in expression of TGFand TGF1in the epithelial cell compartment while the lamina propria does not seem to be significantly affected. 0 引言 體外TGF，TGF1對腸道粘膜損傷后修復(fù)的調(diào)節(jié)作用已有多篇文獻付諸報道1 ，且結(jié)論趨于一致:這兩種生長因子對細胞的增殖有一種互相影響的平衡調(diào)節(jié)作用.通過對腸道粘膜上皮細胞株系的研究發(fā)現(xiàn)，TGF可以刺激、促進上皮細胞的增殖，而同時TGF1是一個潛在的抑制因素2 ;另外，它們均可以調(diào)節(jié)上皮細胞的其他功能，如TGF調(diào)節(jié)電解質(zhì)及營養(yǎng)成分的攝取3 ，TGF1在調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生過程中起著關(guān)鍵作用4 .但在體內(nèi)的研究卻很少5 ，為了探討粘膜損傷后愈合過程中這兩種因子的作用，我們設(shè)計了一種動物模型，旨在觀察在粘膜損傷后至愈合過程的不同階段，TGF，TGF1有無表達、表達部位及表達程度的變化，完善TGF，TGF1對粘膜上皮調(diào)整作用的體內(nèi)研究. 1 材料和方法 1.1 材料 兔抗鼠TGF，TGF1，多克隆抗體博士得公司;ABC Kit博士得公司;DAB Sigma公司;正常羊血清，華美生物公司;APES，武漢博士得公司;SPF大鼠;巴西日圓線蟲（Nippostrongylus brasilien-sis，Nb）. 1.2 方法 6周齡雌性SPF大鼠飼養(yǎng)于空氣層流凈化間，大鼠飲用水經(jīng)高壓消毒，飼料經(jīng)60 CO照射使用.實驗用大鼠分為5組，每組5只.大鼠皮下接種Nb幼蟲6d后獲取成蟲，按500條成蟲/只外科剖腹法用18號針頭注入大鼠幽門后5cm十二指腸處，建立腸粘膜損傷修復(fù)模型;分別接種Nb成蟲后4，8，12和16d，用過量乙醚麻醉致死大鼠，獲取距幽門20cm處腸段2cm，液氮保存，冰凍切片.正常大鼠十二指腸處注入生理鹽水作為對照.ABC免疫組化染色步驟:取出冰凍切片，室溫放置15min;3mol尿素中浸泡30min，PBS洗滌5min;10mL L-1 H2 O2 中浸泡30min，PBS振蕩洗滌35min;10mL L-1 正常羊血清封閉切片15min;加兔抗鼠TGF mAb（1 100），4反應(yīng)24h，PBS浸洗35min;加生物素二抗（1 200），37溫育1h，PBS浸洗35min;加ABC復(fù)合物，37溫育1h，PBS浸洗35min;加0.5g L-1 DAB（含DAB/H2 O2 過氧化氫顯色，顯微鏡下控制時間，水洗5min;蘇木素襯染，系列乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片.用正常羊血清替代一抗做陰性對照，用已知陽性片重復(fù)染色做陽性對照.免疫組化染色結(jié)果判定以組織、細胞中棕色或棕褐色顆粒為陽性，每張切片取5個高倍視野，根據(jù)陽性細胞的多少分為+（<30%）， （30%60%）， （>60%）3級. 統(tǒng)計學(xué)處理:2 檢驗，顯著性界限定為P<0.05. 2 結(jié)果 未經(jīng)Nb感染的正常大鼠腸粘膜上，TGF主要表達于腸絨毛的頂端，TGF主要表達于腸絨毛隱窩區(qū)域的上部;感染Nb后，TGF則先是主要表達于腸絨毛隱窩區(qū)域的上部，逐漸向腸絨毛的頂端上移，而TGF主要表達于腸絨毛的頂端區(qū)域，且漸移向腸絨毛隱窩區(qū)域的上部.固有膜內(nèi)TGF，TGF1也有表達，但粘膜損傷前后及修復(fù)過程中，其表達強度及 部位無明顯變化.不同病理情況下TGF，TGF1表達強度及分布見Tab1，2. 表1 不同病理情況下TGF的表達強度及分布略 表2 不同病理情況下TGF的表達強度及分布略 3 討論 3.1 正常大鼠腸粘膜TGF的表達 本研究中，所有正常大鼠腸粘膜標(biāo)本TGF，TGF免疫組化染色顯示，TGF主要表達于腸絨毛的頂端，TGF主要表達于腸絨毛隱窩區(qū)域的上部.與Dignass等6 研究結(jié)果一致.說明生理情況下，TGF，TGF對于維持腸粘膜上皮的代謝平衡起著重要的調(diào)節(jié)作用.關(guān)于其機制目前尚不十分清楚.現(xiàn)在大家認(rèn)為，整個胃腸道粘膜細胞均可產(chǎn)生TGF，先是以160AA的前體分子散布于細胞表面，若是遇到特異性蛋白分子刺激后，則以50AA的分子形式釋放. 至于膜結(jié)合部分的生物學(xué)功能尚不清楚.預(yù)測可能與刺激相鄰細胞EGF/TGF受體引起旁分泌有關(guān).TGF的生物學(xué)功能主要與調(diào)節(jié)細胞的分化、遷移及營養(yǎng)等相關(guān).TGF的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)為炎癥、胚胎發(fā)育、細胞的生長、分化和免疫功能及組織修復(fù)等方面的調(diào)節(jié)作用.TGF1，TGF2，TGF3功能相似，一般情況下，TGF對間質(zhì)起源的細胞起刺激作用，而對上皮或神經(jīng)外胚層來源的細胞起抑制作用4 .另外，TGF1能促進成纖維細胞合成膠原蛋白、纖維粘蛋白及蛋白多糖等細胞外基質(zhì)，同時促進細胞外基質(zhì)特異性表面膜受體的表達.還可誘導(dǎo)蛋白水解酶抑制劑的產(chǎn)生從而降低其對細胞外基質(zhì)的降解，籍此完成對炎癥、組織損傷的修復(fù)的調(diào)節(jié)作用7 .部分學(xué)者已闡明，TGF1具有調(diào)控細胞周期及參與細胞凋亡的功能，亦可能依此作用參與腸粘膜表層細胞的代謝平衡的調(diào)節(jié)5 . 3.2 不同病理狀態(tài)情況下TGF的表達 在不同病理狀態(tài)情況下，5組20例標(biāo)本的免疫組化結(jié)果顯示:在大鼠腸粘膜感染Nb后發(fā)生損傷至修復(fù)過程中，TGF，TGF1的表達發(fā)生了明顯的規(guī)律性的變化，即TGF先是表達于腸絨毛隱窩區(qū)域的上部，接著逐漸向腸絨毛的頂端區(qū)域轉(zhuǎn)移;而TGF先是主要表達于腸絨毛的頂端部位及隱窩區(qū)域的上部，隨之頂端部位的表達逐漸減少，最后主要定位表達于隱窩區(qū)域的上部.既往實驗說明，TGF對于多種細胞株具有營養(yǎng)作用，應(yīng)用TGF可以減少乙醇或應(yīng)激等引起大鼠發(fā)生潰瘍的危險.TGF具有維持粘膜表皮完整性的作用，其機制可能主要通過促進細胞分化與遷移，而非分裂.體外培養(yǎng)的腸粘膜細胞單細胞層經(jīng)過劃傷等方法可以造成粘膜損傷模型，若在培養(yǎng)基中加入TGF1，則可以明顯加速劃傷邊緣的細胞向缺損區(qū)域遷移、延伸，若同時加入TGF1和抗TGF1，則上述現(xiàn)象不會發(fā)生.Dignass等1 在一組實驗中同時觀察了TGF，TGF1，IL-1，IL-6，EGF，PDGF，TNF，IFN等多種細胞因子對粘膜損傷模型中粘膜上皮細胞的作用，說明TGF1肯定具有促進細胞遷移的作用.Yanaka等8 通過測定電阻抗和滲透性的方法，利用豚鼠胃粘膜體外損傷修復(fù)模型觀察了TGF1的作用，發(fā)現(xiàn)TGF1具有明顯促進粘膜損傷愈合的功能，但是若有膠原抗體存在，TGF1的作用則延遲;該結(jié)果提示TGF1很可能通過促進膠原的合成和沉積，從另一角度促進粘膜創(chuàng)傷的愈合.Wahl7 也觀察到，如果皮下注射TGF1，可以導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域的炎性細胞浸潤，誘發(fā)血管生成和纖維化，促進膠原和細胞外基質(zhì)的沉積.所以說，假如要確定一種細胞因子為影響損傷愈合的最關(guān)鍵的因子的話，那么該因子無 疑是TGF1. 3.3 固有膜內(nèi)TGF，TGF1的表達 固有膜內(nèi)TGF，TGF1也有表達，但粘膜損傷前后及修復(fù)過程中，其表達強度及部位無明顯變化.說明TGF，TGF1在粘膜損傷前后及修復(fù)過程中主要可能依靠自分泌或旁分泌的形式來調(diào)節(jié)粘膜細胞的生物學(xué)功能.固有膜內(nèi)的TGF，TGF1對粘膜細胞的增殖和分化影響較小. 參考文獻: 1Dignass AU，Podolsky DK.Cytokine modulation of intestinal epithelial restitution:Central role of transforming factorJ.Gastroenterology，1993;105（3）:1323-1332. 2Kobayashi O，Watanabe S，Hirose M，Sato N.Effects of trans-forming growth factor on the wound repair of cultured rabbit gastric mucosal cell J.J Gastroenterol Hepatol，1996;11（2）:129-136. 3Carolina C，Stuart E，Daniel K.Trasforming growth factorregulation of migration in wounded rat intestinal epithelial monolayers J.Gastroenterology，1993;105（2）:93-101. 4Yanaks A，Muto H，F(xiàn)ukutomi H，Ito S，Silen W.Role of transforming growth factor beta in the restitution of injured guinea pig gastric mucosa in vitro J.Am J Phy