大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定徐索文肖平喜陳健文樂康沈曉燕黃河清劉培慶【摘要】目的建立大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)模型，為體外研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機制提供重要的實驗手段。方法采用改良的植塊貼壁法，成功建立大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)模型；分別用倒置顯微鏡和SABC試劑盒對培養(yǎng)細(xì)胞進行形態(tài)學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)和免疫熒光鑒定(平滑肌細(xì)胞特異性的-SM-actin)。結(jié)果原代培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞在接種后3天開始從組織塊周圍游出，光鏡下培養(yǎng)細(xì)胞呈梭形，放射狀生長和典型的“峰谷”狀生長；免疫組化和熒光染色顯示胞漿內(nèi)平滑肌肌動蛋白陽性表達，證實培養(yǎng)的細(xì)胞為血管平滑肌細(xì)胞。結(jié)論本法簡便、可靠、經(jīng)濟、短期內(nèi)可獲大量高純度、功能良好的血管平滑肌細(xì)胞，可作為研究動脈粥樣硬化和移植血管再狹窄機制的有效模型。【關(guān)鍵詞】大鼠；胸主動脈；植塊法；血管平滑肌細(xì)胞AbstractObjectiveToestablishtheculturemodelofrataortavascularsmoothmusclecells(VSMCs)toprovideimportantexperimentalmethodforthepathogenesisresearchofatherosclerosisinvitro.MethodsEmployingtheexplantstechnique,theprimaryandsub-culturewerecompletedbymodifiedtissue-pieceinoculationandtrypsindigestionrespectively.Theculturedcellswereidentifiedbyphasecontrastmicroscopyandimmunohistochemicalandimmunofluorescentstaining.ResultsAfter3daysofinoculationoftissue-pieces,VSMCsmigratedfromthevesselpieces.Theculturedcellsshowedthetypical“hillsandvalleys”morphologicalfeaturesunderthemicroscope.Immunohistochemicalandimmunofluorescentstainingwithmonoclonalantibodyagainstmouse-SM-actindemonstratedthesecellswerepositive.ConculsionItisasimpleandreliablemethodforobtaininghighlypurifiedandsatisfactoryVSMCsinshortterm,providingafavorableexperimentalplatformforresearchintothemechanismofvascularproliferousdiseasessuchasatherosclerosisandrestenosis.Keywordsrat；thoracicaorta；explantsmethod；vascularsmoothmusclecells血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)的異常增殖、遷移、泡沫化及凋亡與冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)和經(jīng)皮冠脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTCA)術(shù)后血管再狹窄、頸動脈球囊損傷術(shù)致新生內(nèi)膜形成(neointimaformation)及動脈粥樣硬化(atherosclerosis)密切相關(guān)14。因此，研究防治VSMCs增殖與遷移成為血管生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。本研究在參考國內(nèi)外文獻的基礎(chǔ)上58，結(jié)合自己的經(jīng)驗，采用改良的植塊貼壁法成功建立了大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)模型。1材料與方法1.1動物與試劑SPF級雄性SD大鼠1只，體重(15010)g，中山大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號(粵監(jiān)證字2006A064)。DMEM(Gibco)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(trypsin,Sigma)、T25塑料培養(yǎng)瓶(Costar)、特異性鼠平滑肌肌動蛋白抗體、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)、FITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗(SantaCruzBiochem)1.2大鼠VSMCs的分離與原代培養(yǎng)SPF級雄性SD大鼠1只,重約150g，頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡消毒2min，同時用酒精澆灌大鼠的胸腹部，移入超凈臺內(nèi)。無菌條件下迅速取出全段胸主動脈,立即移入含冷PBS的無菌平皿中。使用1ml的一次性注射器拔去針尖后吸取PBS清洗去除血污，眼科鑷去外膜結(jié)締組織，此時將潔凈血管轉(zhuǎn)移到另一含冷PBS的無菌平皿中，用眼科剪小心剪去血管絨毛后用兩彎鑷反向牽拉去除外膜，再用眼科彎鑷穿過血管沿兩端來回牽拉一次，縱向剖開血管，使內(nèi)膜面朝上,并用彎鑷攤平血管，再將血管轉(zhuǎn)移到含DMEM(10%胎牛血清)的無菌平皿中，用DMEM培養(yǎng)液清洗中膜層平滑肌數(shù)次后，用眼科彎剪剪切成約1mm3大小的組織塊；將組織塊(約15個小塊/段血管)均勻貼放于25cm2培養(yǎng)瓶底的一處角落，間距0.1cm；向瓶內(nèi)加入2ml含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶直立置于37、5%CO2培養(yǎng)箱中6h，使組織塊干涸并與瓶壁牢固貼附。6h后再次翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織塊浸沒于培養(yǎng)液中,培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3天后，細(xì)胞從組織塊邊緣游出后更換培養(yǎng)液，隔天換液1次；當(dāng)細(xì)胞80%融合時,即可傳代。1.3VSMCs的傳代培養(yǎng)當(dāng)組織塊周圍外長的細(xì)胞相互匯合達80%融合時，即可傳代：超凈臺內(nèi)，吸棄舊培養(yǎng)液,將組織塊轉(zhuǎn)入一新培養(yǎng)瓶加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。用不含血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，加入0.125%胰酶和0.02%EDTA混合消化液2ml，室溫下消化20s后轉(zhuǎn)移到37培養(yǎng)箱中消化1min，鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮、間隙增大并有少數(shù)細(xì)胞脫落時，棄消化液，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液10ml終止消化并反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，按13接種，細(xì)胞密度保持在1106cells/ml，約3天長滿單層，用同法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。1.4臺盼藍染色鑒定傳代細(xì)胞活力取消化傳代的第3代VSMCs懸液9滴，加入1滴0.4%臺盼藍液(Sigma)，立即混勻后吸取1滴于細(xì)胞計數(shù)板上，置光學(xué)顯微鏡下觀察：不著色細(xì)胞為活細(xì)胞。隨機計數(shù)5個視野，共計數(shù)500個細(xì)胞，按成活率=不著色細(xì)胞數(shù)/500100%計算細(xì)胞成活率。1.5VSMCs的鑒定1.5.1VSMCs的形態(tài)學(xué)觀察組織塊接種2天后，在倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞大小、形態(tài)、生長特點及排列方式等，并拍照記錄。1.5.2VSMCs的免疫組化鑒定取第3代對數(shù)生長期的細(xì)胞懸液以1106cells/ml接種到預(yù)先放置蓋玻片的6孔板中,置37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長成致密單層時取出蓋玻片,PBS漂洗5min3次，4%多聚甲醛室溫下固定2030min，PBS再次漂洗5min3次，然后按照SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒說明書逐條進行操作(一抗是抗鼠平滑肌肌動蛋白單克隆抗體)。然后以蘇木素復(fù)染，封固，并于相差顯微鏡下觀察攝照。以細(xì)胞胞漿呈棕黃色為陽性細(xì)胞,計數(shù)500個細(xì)胞,計算陽性率。1.5.3免疫熒光染色取第3代細(xì)胞進行細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，1%TritonX-100滲透細(xì)胞膜30min,正常山羊血清37封閉60min,加一抗(-SM-actin1：200稀釋，Boster)4孵育過夜,PBS洗3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(SantaCruz)37避光孵育1h，PBS洗3次，加入5g/mlHoechest33342，室溫孵育510min，PBS充分沖洗，甘油封片，移熒光顯微鏡下(Olympus,Tokyo,Japan)觀察攝片。1.6VSMC的生長曲線取生長狀況良好的第3代細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化傳代，制成細(xì)胞密度1104cells/ml的單細(xì)胞懸液，接種于24孔板，500l/孔，置37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24h收集3孔，加入50lMTT(5mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4h，傾去液體，加入750lDMSO溶解，振蕩10min，轉(zhuǎn)移至96孔板中，后在酶標(biāo)儀上讀取570nm的OD值，計算其均值。以培養(yǎng)時間為橫軸，細(xì)胞活力(OD570nm)為縱軸，用Sigmaplot10.0軟件繪制VSMC的生長曲線。1.7VSMCs的凍存與復(fù)蘇取第2代對數(shù)生長期細(xì)胞，并于凍存前一天換液。消化細(xì)胞將其收集于離心管，計數(shù)，離心棄上清，加凍存液(DMSO、血清、DMEM培養(yǎng)基以163配制，現(xiàn)配并置于4備用)，使細(xì)胞的最終密度為51061107/ml，分裝入1.2ml凍存管中，置4冰箱冷卻1h后轉(zhuǎn)入-20冰箱冷卻2h，最后在-80冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中凍存。復(fù)蘇時從液氮罐中取出凍存管，直接投入37水浴箱中，使其在1min內(nèi)融化。酒精棉球擦拭凍存管，移入超凈臺，用吸管吸出細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移入15ml離心管中，加含20%血清的培養(yǎng)液，離心棄上清，再次加入培養(yǎng)液稀釋后接種于培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。2結(jié)果2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察原代培養(yǎng)2天后，組織塊周邊可見絲狀物，第3天可見有少許細(xì)胞以垂直方向從組織塊邊緣游出(圖1A)，但不是所有的組織塊周邊都有。第6天,植塊周圍形成明顯的細(xì)胞生長暈(圖1B)，細(xì)胞呈放射狀排列,進而形成細(xì)胞簇；細(xì)胞形態(tài)多樣，呈梭形、多角形、星形或不規(guī)則形，有的發(fā)出細(xì)胞突起；胞漿豐富，均質(zhì)透明；核卵圓居中，偶見23個核仁。VSMCs彼此融合、細(xì)胞密集、平行排列，密度低時常交織呈網(wǎng)狀，密度高時則呈漩渦狀或者柵欄狀，在第2周形成典型的“峰”-“谷”狀生長的結(jié)構(gòu)特征，不見“鋪路石狀”排列的內(nèi)皮細(xì)胞，可見此法培養(yǎng)的VSMCs純度很高。而且，隨著萌出細(xì)胞數(shù)量的增多和細(xì)胞的增殖，細(xì)胞間相互融合，部分重疊，2周左右可逐漸鋪滿整個瓶底，進行首次傳代。A細(xì)胞動態(tài)學(xué)觀察血管平滑肌細(xì)胞從組織塊中游出(100)；B:組織塊貼壁6天后形態(tài)學(xué)觀察(100)A:VSMCsmigratedfromaortatissuesegment(100).B:VSMCsmorphologyafter6daysinculture(100)圖12.2細(xì)胞鑒定2.2.1免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定第3代細(xì)胞經(jīng)特異的-SM-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，高倍鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)大量棕色、與細(xì)胞長軸平行的纖維細(xì)絲，即平滑肌肌動蛋白絲。核卵圓形居中，呈淡藍色,見圖2A和2B。2.2.2免疫熒光染色95%以上的培養(yǎng)細(xì)胞-SM-actin免疫熒光染色陽性，見圖2C。2.3臺盼藍染色結(jié)果計數(shù)500個細(xì)胞，其中11個為陽性，約有98%的細(xì)胞染色呈陰性，表明培養(yǎng)的細(xì)胞消化傳代后成活率較高。2.4VSMCs的生長曲線以培養(yǎng)天數(shù)(day)為橫軸，細(xì)胞活力(OD570nm)為縱軸，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制VSMC的生長曲線(圖3)。如圖所示，VSMCs以1104cells/ml密度接種后第2天出現(xiàn)對數(shù)生長期，35天出現(xiàn)平臺期，第6天出現(xiàn)衰退期。3討論3.1VSMCs在動脈硬化研究中的應(yīng)用血管平滑肌細(xì)胞是血管壁的主要細(xì)胞成分，是血管中膜惟一的細(xì)胞類型，同時又是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持血管張力的主要細(xì)胞成分之一。近年來，隨著分子和細(xì)胞生物學(xué)研究的深入，人們對VSMCs表型的轉(zhuǎn)化(收縮型-合成型)、增殖、遷移、分化、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌等方面的認(rèn)識不斷深化。目前認(rèn)為：VSMCs從血管中膜遷移到內(nèi)膜、增殖并分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)以及泡沫化是動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等病理過程形成和發(fā)展中的重要因素2,9。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細(xì)胞有兩種表型：收縮型和合成型。收縮型對舒縮血管的物質(zhì)可發(fā)生反應(yīng)，而合成型可對一系列生長調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子進行基因表達，并能合成細(xì)胞外基質(zhì)(ExtracellularMatrix，ECM)。血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移會引起VSMCs由生理狀態(tài)下的收縮型向高度增殖的合成型的表型變化并由中膜遷移到內(nèi)膜10,11。此外，VSMCs的凋亡在不穩(wěn)定性斑塊形成中扮演重要角色12。VSMCs的特征性抗原標(biāo)記主要有-SM-actin、Calponin、Caldesmon等10，本實驗采用應(yīng)用最廣泛的-SM-actin免疫組化和免疫熒光鑒定VSMCs，結(jié)果顯示95%以上的培養(yǎng)細(xì)胞呈陽性，說明通過本方法可獲得純度較高的VSMCs。因此，體外平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)為研究動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)病機制及其防治提供了實驗基礎(chǔ)。X軸：培養(yǎng)天數(shù)；Y軸：570nm光密度值Xaxisrepresentsthedaysinculture；YaxisrepresentstheOpticlDensityreadat570nm圖3血管平滑肌細(xì)胞的生長曲線Fig3ThegrowthcurveVSMCs3.2組織貼壁法與酶消化法的比較大鼠平滑肌細(xì)胞細(xì)胞株主要有A7r5、A10。商業(yè)化的人源性動脈平滑肌細(xì)胞可從ATCC()及CascadeBiologics()購買，但需要購買專門的平滑肌生長培養(yǎng)基，價格昂貴。原代培養(yǎng)的方法主要有酶消化法和組織塊貼壁法。組織塊貼壁法13,14，由于其血管需求量少、成本低、組織來源廣泛的優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于血管生物學(xué)研究。其組織來源主要有大鼠胸主動脈15、大鼠肺動脈16、兔股動脈17、人大隱靜脈17、臍動脈13、冠狀動脈11等。酶消化法雖然培養(yǎng)周期短，但有以下缺點：(1)所需組織量較大，且消化酶(如膠原酶、彈力酶)價格昂貴，因此實驗成本較高；(2)酶作用時間不易掌握，消化作用容易受溫度影響且消化酶本身對細(xì)胞有毒性作用，影響細(xì)胞貼壁；(3)操作復(fù)雜，污染機會較大。組織塊培養(yǎng)法具有獲得平滑肌細(xì)胞純度高、量多、操作簡單的優(yōu)點，避免酶消化法的上述缺點18，而且本法取材量少，只需1只大鼠即可滿足后續(xù)實驗要求。但此法不足之處是原代培養(yǎng)周期長。一般實驗用第38代VSMCs。3.3改良組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMC的關(guān)鍵培養(yǎng)過程中可以有以下幾點體會：(1)組織塊培養(yǎng)的營養(yǎng)需求：筆者在原代培養(yǎng)時選用20%胎牛血清，傳代培養(yǎng)采用10%的胎牛血清。(2)動物年齡的選擇：選取的是體重為150g的大鼠，因為年幼者的組織塊有更好的增殖潛能，原代培養(yǎng)成活率高。(3)VSMCs分離方法的創(chuàng)新：分離中膜血管平滑肌時，本法采用的是用眼科彎鑷反向牽拉去除外膜，同時用彎鑷插入血管腔輕輕擦拭去除內(nèi)膜，避免刀片刮內(nèi)膜層引起中膜損傷，從而徹底