浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 中文摘要 近年來(lái)，噬藻體對(duì)藍(lán)藻高度專一的致死性使得它在治理藍(lán)藻水華中的潛在作用引 起了高度重視。本論文的研究目的主要是研究南太湖水域浮游植物種群年度變化特 點(diǎn)，進(jìn)而提取能特異性感染優(yōu)勢(shì)種群的噬藻體并加以證實(shí)。 研究主要通過(guò)對(duì)南太湖近岸水域連續(xù)1 2 個(gè)月水樣的采集和鑒定，分析浮游植物 的種群組成、年度變化以及優(yōu)勢(shì)種群豐度變化情況，并從水樣以及藻細(xì)胞中提取噬藻 體對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行感染，通過(guò)藻液的顏色變化證實(shí)感染現(xiàn)象的存在，通過(guò)生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)定 量檢測(cè)噬藻體對(duì)銅綠微囊藻9 1 2 的感染情況，用p c r 技術(shù)檢測(cè)噬藻體目的基因，用 光鏡以及電鏡來(lái)觀察藻細(xì)胞感染前后的細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)改變。 主要結(jié)果： 1 、從2 0 0 8 年1 1 月到2 0 0 9 年l o 月，采集的浮游植物屬于藍(lán)藻門、硅藻門、綠藻門、 甲藻門、金藻門共5 門1 1 個(gè)屬，其中微囊藻是該水域的第一大優(yōu)勢(shì)種群，魚(yú)腥藻 是第二大優(yōu)勢(shì)種群。 2 、7 月份、8 月份水樣依次過(guò)0 4 5 9 m 、0 2 2 9 m 濾膜后加入到對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的藻液中， 兩周后，與對(duì)照組相比，銅綠微囊藻9 1 2 、魚(yú)害微囊藻1 0 0 5 、水華微囊藻1 0 2 8 的實(shí)驗(yàn)組顏色均無(wú)明顯變化；而濃縮后的6 月份、7 月份、8 月份水樣對(duì)銅綠微囊 藻9 1 2 藻液均有不同程度的感染現(xiàn)象。 3 、6 月份、7 月份、8 月份、9 月份水樣依次過(guò)0 4 5 9 m 、0 2 2 9 m 濾膜后經(jīng)梯度稀釋 加入到對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的銅綠微囊藻9 1 2 藻液中，6 天后，未經(jīng)稀釋的水樣對(duì)藻細(xì)胞 生長(zhǎng)存在明顯的抑制作用。 4 、6 月份、7 月份的藻細(xì)胞噬藻體提取液對(duì)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的銅綠微囊藻9 1 2 、魚(yú)害微囊 藻1 0 0 5 均有不同程度的感染現(xiàn)象，而對(duì)水華微囊藻1 0 2 8 則無(wú)感染現(xiàn)象。 5 、噬藻體的p c r 檢測(cè)顯示，濃縮的6 月份水樣的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)了目的條帶，大小約為 4 0 0 b p ，其他各組均未出現(xiàn)目的條帶。 6 、銅綠微囊藻9 1 2 被病毒感染之后，細(xì)胞變得較為圓滑，不再呈現(xiàn)群體狀態(tài)，而變 得較為分散，細(xì)胞膜與細(xì)胞器開(kāi)始分離，細(xì)胞膜漸漸溶解，細(xì)胞器嚴(yán)重?fù)p傷，藻 細(xì)胞最終裂解死亡。 i i i 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 主要結(jié)論： 1 從2 0 0 8 年1 1 月到2 0 0 9 年1 0 月南太湖水域浮游植物共5 門1 1 個(gè)屬，呈現(xiàn)多樣性 特點(diǎn)，全年藍(lán)藻占優(yōu)勢(shì)，其中微囊藻是全年的優(yōu)勢(shì)種群，魚(yú)腥藻是第二大優(yōu)勢(shì)種群。 2 通過(guò)對(duì)藻細(xì)胞感染前后的顯微形態(tài)以及超微結(jié)構(gòu)變化，并通過(guò)p c r 技術(shù)對(duì)目的基 因的定性檢測(cè)，證實(shí)了南太湖水域中存在能特異性感染銅綠微囊藻9 1 2 的噬藻體。 關(guān)鍵詞：南太湖；浮游植物；藍(lán)藻；微囊藻；銅綠微囊藻9 1 2 ；噬藻體 i v 浙江火學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 a b s t r a c t r e c e n t l y , i th a sa t t r a c t e dg r e a ta t t e n t i o nt h a tc y a n o p h a g ep l a y sap o t e n t i a lr o l ei n c o n t r o l l i n gt h ea l g a lb l o o m sf o rh i g hh o s t s p e c i f i c i t y t h i sp a p e ra i m e dt oi n v e s t i g a t et h e a n n u a l c h a n g e so fp h y t o p l a n k t o np o p u l a t i o 塢t h e n e x t r a c t c y a n o p h a g et h a t c o u l d s p e c i f i c a l l yi n f e c tt h ed o m i n a n ts p e c i e sa n di d e n t i f yi t i nt h ep r e s e n ts t u d y , n e a r s h o r ew a t e rs a m p l e so fs o u t h e r nt a i h ul a k ew e r ec o l l e c t e d c o n t i n u o u s l yf o r12m o n t h s t h e n ，t h ec o m p o s i t i o n ，a n n u a lc h a n g e so fp h y t o p l a n k t o n p o p u l a t i o na n da b u n d a n c eo fd o m i n a n ts p e c i e sw e r ea n a l y z e d f u r t h e r m o r e ，c y a n o b a c t e r i a w a si n f e c t e db yc y a n o p h a g ee x t r a c t e df r o mw a t e rs a m p l e sa n da l g a e v i r a li n f e c t i o nw a s c o n f i r m e dt h r o u g hc o l o rc h a n g e sa n dc y a n o p h a g ei n f e c t i o no fm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a912 w a sd e t e c t e dq u a n t i t a t i v e l yt h r o u g hg r o w t hi n h i b i t i o no fc y a n o b a c t e r i a m e a n w h i l e ，t h e p u r p o s eg e n eo fc y a n o p h a g ew a se s t i m a t e db yp c ra n dm o r p h o l o g i c a lc h a n g e sa n d u l t r a s t r u c t u r a lc h a n g e sw e r ed e t e c t e db yo p t i c a lm i c r o s c o p e sa n dt e m m a i nr e s u l t s ： 1 f r o mn o v e m b e r2 0 0 8t oo c t o b e r2 0 0 9 ，p h y t o p l a n k o ns p e c i e s ，b e l o n g i n gt o11g e n e r ao f 5p h y l ai n c l u d i n gc y a n o p h y t a ，b a c i l l a r i o p h y t a ，c h l o r o p h y t a ，p y r r o p h y t a ，c h r y s o p h y t a ， w e r ec o l l e c t e d m i c r o c y s t i sw a st h ef i r s td o m i n a n ts p e c i e sa n da n a b a e n aw a st h es e c o n d d o m i n a n ts p e c i e s 2 t h ej u l y sw a t e rs a m p l ea n dt h ea u g u s t sw a t e rs a m p l ew e r es u c c e s s i v e l yf i l t e r e d t h r o u g ho 4 5 - g ma n do 2 2 g mm e m b r a n e sa n dt h e ni n o c u l a t e di n t oe x p o n e n t i a l l yg r o w i n g c u l t u r e so f m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a 912 ，m i c r o c y s t i s i c h t h y o b l a b e 10 0 5a n d m i c r o c y s t i s - f l o s a q u a e10 2 8 t h ec u l t u r e sw e r ei n c u b a t e df o rt w ow e e k s c o m p a r e dt ot h e c o n t r o lg r o u p ，n os i g n i f i c a n tc o l o rc h a n g e sw e r eo b s e r v e di nt e s tg r o u p s h o w e v e r , v a r y i n g d e g r e e so fi n f e c t i o nc o u l db eo b s e r v e dw h e nt h ej u n e sw a t e rs a m p l e ，t h ej u l y sw a t e r s a m p l ea n dt h ea u g u s t sw a t e rs a m p l ew e r ec o n c e n t r a t e d 3 t h ej u n e sw a t e rs a m p l e ，t h ej u l y sw a t e rs a m p l e ，t h ea u g u s t sw a t e rs a m p l ea n dt h e s e p t e m b e r sw a t e rs a m p l ew e r es u c c e s s i v e l y f i l t e r e d t h r o u g ho 4 5 一g m a n do 2 2 一g m m e m b r a n e s t h e nt h e s ew a t e rs a m p l e s b yg r a d i e n t d i l u t i o nw e r ei n o c u l a t e di n t o e x p o n e n t i a l l yg r o w i n gc u l t u r e so fm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a9 1 2 s i xd a y sl a t e r , t h eg r o w t h v 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 o fc y a n o b a c t e r i aw a ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e db yt h ew a t e rs a m p l ew i t h o u td i l u t i o n 4 v a r y i n gd e g r e e so fi n f e c t i o nw e r eo b s e r v e dw h e nt h ec y a n o p h a g ee x t r a c t e df r o mt h e j u n e sa l g a ea n dt h ej u l y sa l g a ew a ss e p a r a t e l yi n c u b a t e di n t ot h ee x p o n e n t i a l l yg r o w i n g c u t u r e so fm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a9 1 2a n dm i c r o c y s t i si c h t h y o b l a b e 1 0 0 5 ，b u tt h e i n f e c t i o nw a sn o to b s e r v e df o rm i c r o c y s t i s - f l o s a q u a e10 2 8 5 t h ep c rr e s u l t so ft h ec y a n o p h a g es h o w e dt h a tp u r p o s eg e n eb a n do f4 0 0 b pw a so n l y o b s e r v e di nt h ec o n c e n t r a t e dj u n e sw a t e rs a m p l e ，b u tw a sn o to b s e r v e di no t h e r s 6 t h ec e l l so fm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a912i n f e c t e db yt h ec y a n o p h a g eb e c a m er o u n d i s hi n s h a p ea n dd i s p e r s e d ，n o ti nc o l o n y m e a n w h i l ec e l lm e m b r a n e sa n do r g a n e l l e sb e g a nt o s e p a r a t e ，c e l lm e m b r a n e sw e r ed i s s o l v e dg r a d u a l l y , o r g a n e l l e sw e r ed a m a g e ds e v e r e l ya n d c e l l sw e r ef i n a l l yl y s e d m a i nc o n c l u s i o n ： 1 t h ep h y t o p l a n k t o np o p u l a t i o ni nt h es o u t h e mt a i h ul a k ef r o mn o v e m b e r2 0 0 8t o o c t o b e r2 0 0 9b e l o n g e dt o11g e n e r ao f5p h y l a i nt h ew h o l ey e a r , m i c r o c y s t i sw a st h ef n s t d o m i n a n ts p e c i e sa n da n a b a e n aw a st h es e c o n dd o m i n a n ts p e c i e s 2 i tw a sc o n f i r m e dt h a tc y a n o p h a g et h a tc o u l ds p e c i f i c a l l yi n f e c tm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a 912e x i s t e di nt h es o u t h e r nt a i h ul a k et h r o u g hm o r p h o l o g i c a lc h a n g e s ，u l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e so fc y a n o b a c t e r i ab e f o r ea n da f t e ri n f e c t i o na n dq u a l i t a t i v ea n a l y s i sf o rp u r p o s e g e n eb y p c r k e yw o r d s ：s o u t h e r nt a i h ul a k e ；p h y t o p l a n k t o np o p u l a t i o n ；m i c r o c y s t & ；m i c r o c y s t i s a e r u g i n o s a9 1 2 ；c y a n o p h a g e v i 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 插圖清單 v l i 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 浙江大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究 成果。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě) 過(guò)的研究成果，也不包含為獲得浙墊太堂或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的 材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并 表示謝意。 學(xué)位論文作者簽名：漂嵌修 簽字日期： 9 年月 日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū) 本學(xué)位論文作者完全了解浙婆太堂有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送 交本論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)浙婆太堂可以將學(xué) 位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索和傳播，可以采用影印、縮印或掃 描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。 學(xué)位論文作者簽名：泳舸 簽字日期： 9 年蝴盜日 導(dǎo)師簽名： 簽字日期：渺年蘆 月寥日 浙江大學(xué)碩：卜學(xué)位論文 南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 致謝 研究生生涯即將結(jié)束，離校日期也漸漸迫近，回首兩年半的求學(xué)經(jīng)歷，有因?yàn)閷?shí) 驗(yàn)失敗長(zhǎng)久的沮喪，也有實(shí)驗(yàn)成功瞬間的喜悅；有穿梭于校區(qū)間的忙碌，也有駐足于 太湖邊的愜意。一路走來(lái)，慶幸有許多師長(zhǎng)，親人，朋友，同學(xué)的幫助和鼓勵(lì)，希望 在此之際表達(dá)我深深的感恩之情。 首先要感謝我的導(dǎo)師郭宗樓教授，在課題選擇和實(shí)驗(yàn)研究的整個(gè)過(guò)程中得到了郭 老師的悉心指導(dǎo)和熱情幫助，在我攻讀碩士研究生期間，也深深受益于郭老師的關(guān)心、 愛(ài)護(hù)和諄諄教導(dǎo)。作為老師，循循善誘，點(diǎn)撥迷津，讓人如沐春風(fēng)；作為長(zhǎng)輩，關(guān)懷 備至，身體力行，讓人感念至深。郭老師不但使我樹(shù)立了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲杏^念，還使我明 白了許多為人處世的道理，在此謹(jǐn)向郭老師表示我最誠(chéng)摯的敬意和感謝。 其次要特別感謝我的課題指導(dǎo)老師徐立紅教授，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到論文寫(xiě)作，傾注了 徐老師大量的心血，兩年來(lái)，徐老師淵博的專業(yè)知識(shí)，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，精益求精的 工作作風(fēng)對(duì)我產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，時(shí)刻激勵(lì)著我要嚴(yán)格要求自己，不斷努力學(xué)習(xí)，善 于發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，不要懼怕任何困難，徐老師的教導(dǎo)自己將受益終生。 本論文的順利完成，離不開(kāi)各位老師和同學(xué)的關(guān)心和幫助，在此要感謝分析測(cè)試 中心黎軍英老師在本文電鏡實(shí)驗(yàn)中給予的支持，感謝梁婧和鄭群同學(xué)在本文p c r 實(shí) 驗(yàn)中提供的幫助，感謝徐進(jìn)、邢鳴鸞、季林丹，謝蕾、孫瑜、孟冠敏、張亞莉、李覃， 王昊、程玉生、呂朝陽(yáng)、莫涵、胡榮祥、陳亞男等同學(xué)和黃樸老師在日常工作和生活 中給予的支持和幫助，感謝室友高樹(shù)曉、蔡紅輝、裴明黎、康海權(quán)、吳從元、孫錚、 胡晟、吳明生、王陪炯、丁曉、胡帥、程偉光在生活上的照顧，伴我度過(guò)了難忘的讀 書(shū)生涯。 最后，感謝所有關(guān)心和幫助過(guò)我的朋友、同學(xué)和親友，感謝我的家人給予我巨大 的支持和信心，無(wú)論身處何處，都能感受到家人的牽掛和祝福，特別感謝摯友張紅芳 一直以來(lái)的陪伴和支持，一路走來(lái)，風(fēng)雨同舟，在未來(lái)的日子，自己一定努力學(xué)習(xí)和 工作，不辜負(fù)他們的期望! 梁興飛 2 0 1 0 年2 月 1 1 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 第一章緒論 藍(lán)藻( 或藍(lán)細(xì)菌e y a n o b a c t e r i a ) 是地球上最早出現(xiàn)的光合自養(yǎng)生物，它們利用水 作為電子供體，利用太陽(yáng)能將e 0 2 還原成有機(jī)碳化合物，并釋放出自由氧。藍(lán)藻是 地球上生命系統(tǒng)演化的產(chǎn)物，同時(shí)也強(qiáng)烈地影響著地球生命系統(tǒng)的演化，在地球生物 圈形成和發(fā)展過(guò)程中起到了關(guān)鍵性作用( 謝平，2 0 0 7 ) ，它極大地改變了巖石圈、大 氣圈和水圈的物理化學(xué)性質(zhì)。藍(lán)藻的釋氧光合作用使大氣圈中自由氧緩慢積累，大氣 圈開(kāi)始氧化，自由氧分壓逐漸增加，為真核生物的起源創(chuàng)造了條件。隨著真核生物的 到來(lái)，大氣氧濃度出現(xiàn)了劇烈的增加，建造了一個(gè)堅(jiān)實(shí)的臭氧層，并揭開(kāi)了陸地生命 的新紀(jì)元藍(lán)藻作為重要的初級(jí)生產(chǎn)者，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。固氮藍(lán)藻在維持全球 土壤和水體肥力方面起著十分重要的作用( r a j ，1 9 9 0 ) 。藍(lán)藻在未來(lái)食物生產(chǎn)和太陽(yáng)能 轉(zhuǎn)化方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值( p a e r le ta 1 ，2 0 0 1 ) ，盡管如此，藍(lán)藻對(duì)人類的危害卻依 然明顯，特別是藍(lán)藻的大量繁殖造成藍(lán)藻水華的爆發(fā)，給人們的生活和生產(chǎn)帶來(lái)了巨 大的危害。 近年來(lái)，人口的快速增長(zhǎng)以及社會(huì)經(jīng)濟(jì)迅猛發(fā)展導(dǎo)致化肥的使用量急劇增加，再 加上含磷洗衣粉的大量使用，未經(jīng)處理的富含n 、p 的生活污水和農(nóng)業(yè)上未被利用的 n 、p 等大量排入內(nèi)陸水體，使全球范圍內(nèi)的水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重( 饒欽止等， 1 9 8 0 ；朱廣偉等，2 0 0 5 ) ，而形成水華的藻類( 主要是藍(lán)藻) 的大量繁殖正是水體富 營(yíng)養(yǎng)化的重要表征之一。 太湖是中國(guó)的第三大淡水湖，地處長(zhǎng)江下游、滬寧杭三角中心以太湖為中心的 太湖流域，包括江蘇南部、浙江北部和上海市以及安徽省的一小部分，總面積 3 6 5 0 0 k m 2 流域內(nèi)有3 7 個(gè)大中城市以及縣級(jí)市，其中包括上海、蘇州、無(wú)錫、常州、 嘉興、湖州等大城市，總?cè)丝? 0 0 0 萬(wàn)人。近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展，大量的 污染物被排入太湖水中，引起了大量的污染( 黃漣平等，2 0 0 1 ；李恒鵬等，2 0 0 7 ；蘇 嫂麗等，2 0 0 9 ) 。據(jù)水質(zhì)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，從2 0 世紀(jì)8 0 年代初期到1 9 9 5 年，太湖水域 水質(zhì)呈明顯下降趨勢(shì)，全湖平均總氮、總磷等主要指標(biāo)較1 0 年前增加一倍以上，原 來(lái)以2 類水質(zhì)為主的水體現(xiàn)在已變?yōu)? 類水為主，2 類水水域面積由6 9 0 縮小到 浙江大學(xué)碩十學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 1 5 0 ，3 類水由3 0 o 擴(kuò)大到7 0 o ( 楊堅(jiān)波等，2 0 0 4 ) 。從總體上看，太湖水體表現(xiàn) 出明顯的富營(yíng)養(yǎng)化特征，且呈迅速發(fā)展的趨勢(shì)。目前太湖地面水普遍達(dá)到3 - 4 類，局 部地區(qū)已達(dá)到5 類，富營(yíng)養(yǎng)化程度則上升了一個(gè)半到兩個(gè)等級(jí)。由于富營(yíng)養(yǎng)化程度的 加劇，導(dǎo)致浮游植物大量繁殖，藻類經(jīng)常爆發(fā)，且爆發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，已經(jīng)由原來(lái)的夏季 擴(kuò)展到現(xiàn)在的春、夏、秋3 季( 王興民等，2 0 0 6 ) ，藻類爆發(fā)的區(qū)域也不斷擴(kuò)大，已 由原來(lái)的梅梁湖等局部發(fā)展到了湖心以及南太湖水域( 周小寧等，2 0 0 7 ；周立國(guó)等， 2 0 0 8 ) 。 太湖藍(lán)藻的演變也經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的發(fā)展歷程，2 0 世紀(jì)5 0 年代初，太湖的浮游植物 以隱藻和硅藻占優(yōu)勢(shì)，夏季雖然藍(lán)藻數(shù)量最多，但主要由小型種群組成，形成水華的 微囊藻數(shù)量不多( 饒欽止，1 9 6 1 ) 。1 9 6 0 年，科學(xué)家對(duì)太湖1 7 7 個(gè)采樣點(diǎn)收集的浮游植 物分析得出，從個(gè)體數(shù)來(lái)看，西太湖藍(lán)藻占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占藻類總量的9 6 6 ，而東太 湖以硅藻占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占藻類總量的7 1 8 ，藍(lán)藻占9 9 。藍(lán)藻的分布幾乎遍及全 湖，在西北部比較集中，在藍(lán)藻中以微囊藻和魚(yú)腥藻的數(shù)量最多，分布最廣( 陳洪達(dá) 等，1 9 6 5 ) 。2 0 世紀(jì)8 0 年代，對(duì)太湖的浮游植物種群季節(jié)分布顯示，太湖夏秋季藻類 生物量中藍(lán)藻、硅藻和隱藻平分秋色( 孫順才等，1 9 9 3 ) ，而2 0 世紀(jì)9 0 年代，通過(guò)對(duì) 太湖梅梁灣藻類研究得出，太湖梅梁灣藻類生物量夏季藍(lán)藻( 偶爾有綠藻) 占據(jù)絕對(duì) 優(yōu)勢(shì)( 陳宇煒等，1 9 9 8 ) ，進(jìn)入2 1 世紀(jì)后，藍(lán)藻在太湖全年中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)( 許秋瑾等， 2 0 0 5 ；s o n g ，e ta 1 ，2 0 0 7 ；l i u ，e ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 藍(lán)藻的大面積爆發(fā)形成了大量的水華，造成了魚(yú)蝦的大量死亡。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)， 太湖流域每年因水污染造成的經(jīng)濟(jì)損失約為5 0 億人民幣，大規(guī)模藍(lán)藻水華的暴發(fā)降 低了水資源的利用效能，引起了嚴(yán)重的生態(tài)問(wèn)題，許多藍(lán)藻特別是微囊藻屬 ( m i c r o c y s t i s ) 是產(chǎn)毒的，毒素釋放到水體中后，敗壞了水質(zhì)，危害了人類及其它生 物的健康( c h e ne ta 1 ，2 0 0 5 ；x i ee ta 1 ，2 0 0 5 ) ，因此，抑制產(chǎn)毒藍(lán)藻繁衍、防止水華的暴 發(fā)已經(jīng)成為關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，治理藍(lán)藻污染有很多方法，如通過(guò)引水、換水稀釋水 中的污染物質(zhì)，以此來(lái)降低藻類的濃度( 華榮生，2 0 0 1 ) ，但是補(bǔ)水量太小起不到凈化 作用，而提高補(bǔ)水量又造成資源的大量浪費(fèi)；另外采用過(guò)濾、吸附、機(jī)械清除的辦法 ( 李秉柏，2 0 0 7 ) ，雖然從一定程度上起到了治理的效果，但是治標(biāo)不治本，而且成本 較高。而采用一些化學(xué)的方法雖然能夠及時(shí)有效的控制藍(lán)藻的生長(zhǎng)，但往往會(huì)造成二 次污染( 和麗萍，2 0 0 0 ；尹海川等，2 0 0 5 ) 。 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 噬藻體( e y a n o p h a g e ) 是一種侵染原核藻類的病毒，是浮游病毒的重要組成部分。 噬藻體對(duì)宿主藍(lán)藻高度專一的致死性使得它在治理藍(lán)藻水華中的潛在作用引起了研 究者的高度重視( f u h r m a n ，1 9 9 9 ；t o m a r u e ta 1 ，2 0 0 4 ) ，人們發(fā)現(xiàn)在自然發(fā)生的藍(lán)藻水華 中加入過(guò)量的噬藻體能夠?qū)е滤{(lán)藻的大量減少( s h e r m a ne ta 1 ，1 9 7 8 ) 目前，盡管對(duì) 藍(lán)藻水華的產(chǎn)生機(jī)制已經(jīng)研究了很多，但是最近研究發(fā)現(xiàn)，除了光照、溫度等物理因 子以及n 、p 等化學(xué)物質(zhì)的影響外，大量噬藻體對(duì)藍(lán)藻的裂解可能是非常重要的控制 藍(lán)藻水華的影響因子( y u k a r ie ta 1 ，2 0 0 7 ；s t o d d a r de ta 1 ，2 0 0 7 ) 。一般來(lái)說(shuō)，藍(lán)藻水華總 是保持季節(jié)性周期出現(xiàn)，集中出現(xiàn)在早春和晚秋，但是藍(lán)藻水華并不會(huì)經(jīng)常發(fā)生，其 中一個(gè)很重要的因素就是噬藻體在水體微生物群落的更替中扮演了非常重要的角色， 潛在地控制了藍(lán)藻的生長(zhǎng)。近年來(lái)，藍(lán)藻水華頻繁暴發(fā)，淡水水域中噬藻體的生態(tài)作 用也越來(lái)越受到重視( z h a oc ta 1 ，2 0 0 2 ；s t e p h e ne ta 1 ，2 0 0 5 ；t a k a s h ie ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 雖然對(duì)噬藻體的生態(tài)作用以及分子生物學(xué)研究已獲得了不少成就，但主要集中于 海洋當(dāng)中，淡水噬藻體的研究很少，尤其是能夠裂解引起水華微囊藻的噬藻體并沒(méi)有 太多的報(bào)道，因此，研究淡水水域中噬藻體的生態(tài)作用對(duì)防治藍(lán)藻繁殖有著重要的意 義，而提取能裂解微囊藻的噬藻體則是關(guān)鍵的一步。本課題研究的目的主要是分析南 太湖水域浮游植物的種群組成、年度變化特點(diǎn)以及優(yōu)勢(shì)種群豐度變化規(guī)律，在此基礎(chǔ) 上，從太湖水體中提取能特異性感染優(yōu)勢(shì)種群的噬藻體，研究噬藻體對(duì)藍(lán)藻的感染情 況，通過(guò)對(duì)感染前后藻細(xì)胞的顯微形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)變化以及p c r 定性檢測(cè)來(lái)證實(shí)噬 藻體的存在，為進(jìn)一步分離和擴(kuò)陪噬藻體提供基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步探討淡水噬藻體的生 態(tài)作用提供參考。 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 第二章南太湖浮游植物種群季節(jié)變化 本研究通過(guò)對(duì)南太湖近岸水域從2 0 0 8 年1 1 月到2 0 0 9 年10 月連續(xù)1 2 個(gè)月水樣 的采集、固定以及鑒定，分析該水域浮游植物的種群組成、年度變化特點(diǎn)以及優(yōu)勢(shì)種 群豐度變化情況，為研究南太湖優(yōu)勢(shì)種群變化特點(diǎn)提供參考，也為進(jìn)一步分離特異性 感染優(yōu)勢(shì)種群的噬藻體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2 1 材料 2 1 1 主要試劑 魯哥氏染液( l u g o l s ) ：將6 9 碘化鉀溶于2 0 m l 水中，待其完全溶解后，加4 9 碘充分搖動(dòng)，全溶后加入8 0 m l 水即可。 2 1 2 主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器 載玻片，蓋玻片，浮游生物網(wǎng)，浮游植物計(jì)數(shù)框，電子顯微鏡。 2 2 方法 2 2 1 采樣地點(diǎn) 從2 0 0 8 年1 1 月到2 0 0 9 年1 0 月共1 2 個(gè)月，每月采樣一次，采樣點(diǎn)位于湖州市 太湖大壩近岸水域( 緯度3 0 。9 4 0 0 0 9 7 ，經(jīng)度1 2 0 。1 - 1 2 0 。1 2 8 ) ，如圖2 1 所示。 2 2 2 水樣采集及固定 取表層水樣( o 5 m ) ，4 。c 保存并于2 4 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，將采集的水樣3 0 m l ， 充分搖勻后加入i 5 魯哥氏染液固定，4 0 c 保存。 2 2 3 浮游植物鑒定 浮游植物鑒定由中國(guó)科學(xué)研究院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)完成。 4 * 缸太學(xué)mi ：學(xué)位論文南太湖浮神植物種群季節(jié)變化嶷碰蒜伴的韌步研究 田2 1 太瑚采樣點(diǎn)位置 2 3 結(jié)果 2 3i 浮游植物種群組成 表2 1 為南太湖水域采樣點(diǎn)浮游植物種群組成由表可知，從2 0 0 8 年1 1 月到2 0 0 9 年1 0 月共1 2 個(gè)月中，采集的浮游植物屬于藍(lán)藻門、硅藻門、綠藻門，甲藻門、盒藻 門共5 門1 1 個(gè)屬，其中硅藻門種類最多，共5 個(gè)種屬，分別為直鏈蒹屬、小環(huán)蕤屬、 橋彎藻屬、脆軒藻屬針桿藻屬；藍(lán)藻門合有2 個(gè)種屬，分別為馓囊藻屬和魚(yú)腥藻屬： 綠蒹門含有兩個(gè)種屬，分別為纖維藻和表藻：另外甲藻門和金蒹門各臺(tái)有一類種屬， 分別為隱藻屬和舟形藻屬，各個(gè)月份浮游植物的顯微圖片如圖2 2 所示 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 表2 1 浮游植物種群組成 t a b l e 2 1c o m p o s i t i o no fp h y t o p l a n k t o np o p u l a t i o n 采樣時(shí)間浮游植物種群 6 浙江人學(xué)i 學(xué)位皓立南太湖浮游植物種群乖1 t 變化噓藻體的初步研究 廣 田2 2 浮游植物種群顯微圖片 f i 9 2 2m i c m g r a p h so f p h y t o p l a n k t o np o p u l m i o n 一，一一一 新 學(xué)硎l 學(xué)位論立南 湖浮游植物種群季節(jié)變化艇蘸體的糾步研究 2 32 浮游植物種群年度變化 圖2 3 為從2 0 0 8 年1 1 月到2 0 0 9 年1 0 月采樣點(diǎn)浮游植物種群年度變化情況，以 該種群在浮游植物中所占的百分比來(lái)反映種群數(shù)量隨時(shí)問(wèn)變化的規(guī)律。其中，2 0 0 8 年1 1 月份，樣品中未見(jiàn)任何藻細(xì)胞，2 0 0 8 年1 2 月份，微囊藻所占的百分比為8 0 ； 2 0 0 9 年1 月和2 月，浮游植物種群比較少，各個(gè)種群的數(shù)量也比較少；從2 0 0 9 年3 月份開(kāi)始到5 月份，徽囊藻數(shù)量開(kāi)始增多，微囊藻種群所占的百分比開(kāi)始上升，分別 為5 0 、5 6 、9 4 ；6 月以后一直到8 月份，微囊藻占統(tǒng)治優(yōu)勢(shì)，所占百分 匕幾乎 為1 0 0 ；9 月和1 0 月微囊藻所占百分比下降，為9 0 l 月 i | 直鏈 橋彎 _ & # - 舟形 n 針# i | * m g _ 隱菲 卜ii n o v 0 8d t j n b0 9m m t 0 9a p r 4 0 9m a v t 0 9j m - 0 9j n l 4 1 9 a u 0 9s e p0 9 o c i _ 0 9 時(shí)問(wèn)( 月份) 囤2 3 浮游植物種群年度變化 f i 9 23 a n n u a lc h a n g e s o f p h y l o p l a n k t o np o p u l a t i o n 2 33 微囊藻種群豐度變化 表2 , 2 為從2 0 0 9 年3 月到2 0 0 9 年8 月期間，微囊藻種群的豐度變化情況，數(shù)量 計(jì)數(shù)采用浮游植物計(jì)數(shù)框，將樣品搖勻后，取01 m l 于計(jì)數(shù)框中進(jìn)行計(jì)數(shù)。由表可知 從3 月開(kāi)始一直到6 月份，采樣點(diǎn)的微囊藻種群數(shù)量逐漸增加，到6 月份達(dá)到最大值， 之后微囊藻種群數(shù)量逐漸下陣。 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 表2 2 微囊藻種群豐度 時(shí)間微囊藻數(shù)量( 萬(wàn)個(gè)l ) 2 0 0 9 年3 月 2 0 0 9 年4 月 2 0 0 9 年5 月 2 0 0 9 年6 月 2 0 0 9 年7 月 2 0 0 9 年8 月 2 4 討論 目前關(guān)于太湖水域浮游植物群落組成和優(yōu)勢(shì)種群演化的研究比較廣泛，但主要集 中于五里湖和梅梁灣( 宋曉蘭等，2 0 0 7 ；錢奎梅等，2 0 0 8 ；陳家長(zhǎng)等，2 0 0 9 ) ，對(duì)南 太湖水域浮游植物群落組成的研究則相對(duì)較少。目前已知的南太湖水域浮游植物種群 共有2 4 3 屬種7 個(gè)門，其中藍(lán)藻門9 8 屬，綠藻門6 4 屬，硅藻門3 9 屬，裸藻門2 1 屬，隱藻門1 3 屬，甲藻門6 屬，金藻門2 屬( 原居林等，2 0 0 9 ；趙漢取等，2 0 0 9 ) 。 本次研究發(fā)現(xiàn)南太湖水域浮游植物種群呈現(xiàn)多樣性特點(diǎn)，對(duì)采樣點(diǎn)浮游植物種群的逐 月分析鑒定顯示，浮游植物種群分別屬于藍(lán)藻門、硅藻門、綠藻門、甲藻門、金藻門 共5 門1 1 個(gè)屬，其中藍(lán)藻門含有2 個(gè)屬，分別為微囊藻屬和魚(yú)腥藻屬，而對(duì)微囊藻 屬鑒定結(jié)果顯示，微囊藻種類很多，包含有惠氏微囊藻、魚(yú)害微囊藻、銅綠微囊藻、 水華微囊藻、挪氏微囊藻、卷曲微囊藻等，說(shuō)明微囊藻種群也呈現(xiàn)多樣性特點(diǎn)。 太湖浮游植物種群演化經(jīng)歷了比較大的變化，2 0 世紀(jì)5 0 年代初，以夏季藍(lán)藻數(shù) 量最多，隱藻、硅藻和綠藻次之，其他季節(jié)隱藻和硅藻在數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；6 0 年 代，西部湖區(qū)夏季藍(lán)藻數(shù)量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；8 0 年代，夏秋季藻類生物量中藍(lán)藻、硅藻 和隱藻平分秋色；9 0 年代，藍(lán)藻( 偶爾有綠藻) 占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；2 1 世紀(jì)夏季藍(lán)藻一 統(tǒng)天下。本次研究發(fā)現(xiàn)，從2 0 0 8 年1 1 月到2 0 0 9 年1 0 月采樣點(diǎn)浮游植物優(yōu)勢(shì)種群一 直是藍(lán)藻，特別是微囊藻，而其他門類的藻類則不占優(yōu)勢(shì)。除去2 0 0 8 年1 1 月份由于 氣溫突然變冷，浮游植物幾乎全部死亡，沒(méi)有監(jiān)測(cè)到浮游植物外，從2 0 0 8 年1 2 月到 2 0 0 9 年1 0 月這1 1 個(gè)月中，微囊藻在每個(gè)月份均能檢測(cè)到，其中微囊藻占絕對(duì)優(yōu)勢(shì) 蛆鉈舳舭黔 0 6 3 9 8 3 刁7 3 6 8 8 8 1 8 0 6 1 3 2 7 9 5 3 2 9 4 0 4 l 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 的月份共有9 個(gè)月，特別是從3 月份開(kāi)始，天氣逐漸變暖，湖水溫度上升后，加上 光照和富營(yíng)養(yǎng)化的影響，微囊藻快速繁殖，湖水中微囊藻豐度迅速上升，數(shù)量逐漸增 加，從6 月份開(kāi)始一直到8 月份，微囊藻幾乎占據(jù)了浮游植物的1 0 0 ，很少見(jiàn)到其 它浮游植物。 除微囊藻外，魚(yú)腥藻在浮游植物中比重也比較大，僅次于微囊藻，研究發(fā)現(xiàn)，從 2 0 0 8 年1 1 月到2 0 0 9 年1 0 月這1 2 個(gè)月中，魚(yú)腥藻在6 個(gè)月份出現(xiàn)過(guò)，開(kāi)始出現(xiàn)的 時(shí)間為4 月份，晚于微囊藻，所占比重為全年最高的4 3 ，之后，隨著微囊藻的大量 繁殖，魚(yú)腥藻所占比重開(kāi)始下降，到5 月份，魚(yú)腥藻所占的百分比為6 ，而當(dāng)微囊 藻在6 月份到8 月份占統(tǒng)治優(yōu)勢(shì)后，魚(yú)腥藻沒(méi)有出現(xiàn)。到9 月份之后，微囊藻比重下 降，魚(yú)腥藻又開(kāi)始出現(xiàn)，所占比重為1 0 左右 近年來(lái)，太湖富營(yíng)養(yǎng)化程度加劇，藍(lán)藻水華頻頻暴發(fā)，而引起水華的藍(lán)藻主要包 括微囊藻和魚(yú)腥藻兩種，這兩種藍(lán)藻所產(chǎn)生的藻毒素除了直接對(duì)魚(yú)類、人畜產(chǎn)生毒害， 也是引發(fā)肝癌的重要誘因之一( d a w s o n ，1 9 9 8 ；s e k i j i m ae ta 1 ，1 9 9 9 ；k o h o u t e ke ta 1 ， 2 0 0 7 ) ，防治產(chǎn)毒藍(lán)藻的過(guò)度繁殖迫在眉睫，噬藻體的生態(tài)作用使得它在治理藍(lán)藻水 華中的潛在作用引起了研究者的高度重視，尤其是研究能夠裂解引起“水華”微囊藻 的噬藻體對(duì)了解淡水噬藻體的生態(tài)作用以及進(jìn)一步防治藍(lán)藻有著非常重要的意義。 l o 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 第三章從南太湖水樣及藻樣中提取噬藻體 本研究通過(guò)采集2 0 0 9 年6 月到2 0 0 9 年9 月南太湖水域的水樣以及藻樣，進(jìn)一步 從水樣和藻細(xì)胞中提取噬藻體，并對(duì)對(duì)數(shù)期的藻液進(jìn)行特異性感染，通過(guò)藻液的顏色 變化證實(shí)噬藻體的感染，通過(guò)生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)噬藻體對(duì)銅綠微囊藻9 1 2 的感染 情況，用p c r 技術(shù)檢測(cè)噬藻體目的基因，用光鏡以及電鏡來(lái)觀察藻細(xì)胞感染前后細(xì) 胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)改變，通過(guò)以上方法證實(shí)南太湖水域中存在能特異性感染銅綠微囊 藻9 1 2 的噬藻體。 3 1 材料 3 1 1 主要試劑 聚7 , - - 醇6 0 0 0 ( p e g6 0 0 0 ) ，氯化鈉，氯仿，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。 3 1 2 藻種與培養(yǎng)基 藻種： 銅綠微囊藻9 1 2 ( m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a9 1 2 ) ，魚(yú)害微囊藻1 0 0 5 ( m i c r o c y s t i s i c h t h y o b l a b ek u t z1 0 0 5 ) ，水華微囊藻1 0 2 8 ( m i c r o c y s t i s - f l o s - a q u a e1 0 2 8 ) ，水華魚(yú)腥 藻2 4 5 ( a n a b a e n a f l o s a q u a e2 4 5 ) 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)， 培養(yǎng)條件為采用b g l l 培養(yǎng)基，光照強(qiáng)度為2 0 0 0 1 u x ，溫度為3 0 0 c ，光暗周期為 1 2 h ：1 2 h 。 b g l l 培養(yǎng)基： w o r k i n gs o l u t i o n g l n a n 0 3 1 5 k 2 h p 0 4 3 h 2 0 0 0 4 m g s 0 4 7 h 2 0 o 0 7 5 c a c l 2 2 h 2 0 0 0 3 6 c i t r i ca c i d0 0 0 6 f e r r i ca m m o n i u mc i t r a t e0 0 0 6 e d t a ( d i n a t r i m s a l t ) 0 0 0 6 n a 2 c 0 3 0 0 0 6 1 l 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 a 5 + c os o l u t i o nlm l a d dt o10 0 0m lo fd i s t i l l e dw a t e r c o m p o s i t i o no ft h ea 5 + c o s o l u t i o n h 3 8 0 3 2 8 6 9 m n c l 2 h 2 0 1 8 1 9 z n s 0 4 7 h 2 0 0 2 2 9 c u s 0 4 5h 2 0 0 0 8 9 n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 0 0 3 9 9 c o ( n 0 3 ) 2 6 h 2 0 0 0 5 9 3 1 3 水樣處理用液 魯哥氏染液： 將6 9 碘化鉀溶于2 0 m l 水中，待其完全溶解后，加4 9 碘充分搖動(dòng)，全溶后加入 8 0 m l 水即可。 t mb u f f e r ： lm o l l ir i s e l ( p h7 5 )5 0 m l m g s 0 4 7 h 2 0 2 9 加水至1 l 3 1 4 電鏡實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑 0 2 m 磷酸緩沖液( p b s ) 的配制： 0 2 m o l l 磷酸氫二鈉溶液( a 液) 6 1 0 m l 0 2 m o l l 磷酸二氫鈉溶液( b 液) 3 9 0 m i 將a 液與b 液體混合后配成0 2 m 母液 2 5 戊二醛溶液： 0 2 mp b s m l5 0 m l 2 5 戊二醛水溶液m l 1 0 m l 雙蒸水加至m l1 0 0 m l s p u r r 包埋劑配方： v c d 樹(shù)脂 1 0 9 d e r 7 3 6 8 9 1 2 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文南太湖浮游植物種群季節(jié)變化及噬藻體的初步研究 n s a d m a e 3 1 5p c r 實(shí)驗(yàn)試劑 t e m ： 1 0 m m o 扎 1 0 m m o 兒 o 5 15 0 9 9 m l 3 1 6 主要儀器 2 6 9 0 4 9 t d s h c l ，p h 8 0 e d t a s d s 蛋白酶k 電子天平( s a r t o r i u s 公司，德國(guó)) a p 9 9 2 5 溶劑過(guò)濾器( 天津奧特賽恩斯儀器有限公司，中國(guó)) m i c r o f u g e 低溫高速離心機(jī)( b e c k m a l l 公司，美國(guó)) 智能人工氣候箱( 寧波海曙，中國(guó)) 泰仕照度計(jì)( 杭州正東電子有限公司，中國(guó)) 血球計(jì)數(shù)板( 上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠，中國(guó)) 超凈臺(tái)( 蘇凈集團(tuán)安泰公司，中國(guó)) 超聲波清洗儀( b r a n s o n 公司，美國(guó)) 電子顯微鏡( o l y m p u s 公司，日本) 超速離心機(jī)( b e c k m a n 公司，美國(guó)) 超低溫冰箱( s o l o w 公司，美國(guó)) 透射電鏡( j e o l j e m 1 2 3 0t e