致謝 本論文是在導師范廣涵教授和劉承宜教授的親切關懷和悉心指導下完成的。 兩位導線在論文的選題、實驗設計、文章修改、論文撰寫等各方面傾注了大量的 精力和一山血。范廣涵教授寬闊的胸懷、淵博的知識、求實嚴謹?shù)墓ぷ鲬B(tài)度、對科 研工作一絲不茍、精益求精的作風；劉承宜教授嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度、敏捷的才思以 及高效的工作方法，深深地影響著我，令學生終身受益。借完成博士論文工作之 際，謹向兩位導師表示我深深的謝意! 感謝導師廖?？〗淌趥魇诘墓鈱W專業(yè)知識以及科研工作方法! 感謝劉頌豪院士的關心和教誨! 感謝華南師范大學研究生處的各位老師、信息光電子科技學院的蘭曼娜老 師、光電子材料與技術(shù)研究所的郭志友教授、孫慧卿和鄭樹文老師對我學習和工 作上的關懷和支持! 感謝華南師范大學物理系的程敏熙博士在光學實驗測試上的指導和幫助! 感謝華南師范大學體育學院領導和運動人體科學教研室的全體老師對激光 運動醫(yī)學實驗室建設的支持和幫助! 感謝段銳老師、朱玲同學、李燕同學、黃平同學、蔡雄偉同學、殷建玲同學、 劉魯同學、王浩博士、潭春華同學、曹明德同學、李成長同學多年來的友好合作 及真誠的友誼! 感謝在百忙之中評審和前來參加我論文答辯的各位教授! 最后，謹向所有曾經(jīng)關心、鼓勁和幫助過本論文工作的老師、同學、親人和 朋友表示我衷心的感謝1 4 中文摘要 發(fā)光二級管( 1 i g h te m i t t i n gd i o d e ，l e d ) 是一種高亮度、高效率、長壽命的 新型固體光源。被廣泛應用于大屏幕顯示，交通信號燈，多媒體信息存儲，照明 等領域，無論是產(chǎn)值還是產(chǎn)量，在半導體光電器件中均占據(jù)主導地位。近年來， 研究開發(fā)l e d 在生命科學中的應用受到日益廣泛的關注，本論文的工作主要是 研制出l e d 生物光源，然后用該光源進行細胞生物學實驗。 論文的第一章，首先從非相干單色光的細胞生物效應、光生物調(diào)節(jié)作用機理、 光生物調(diào)節(jié)中非共振作用的特征、以及生物信息模型( b i m p ) 等幾方面，論述和 確立了研制l e d 生物光源的理論依據(jù)。接著第二章簡要綜述了最近幾年來l e d 在生命科學領域中的研究進展，主要包括l e d 在植物、動物、人體臨床、生物 醫(yī)學材料、環(huán)境監(jiān)測和科研方面的應用。由于在l e d 光生物刺激研究中，對光 源的照射劑量、光強調(diào)節(jié)和光強的均勻性等參數(shù)的要求非常準確，而目前的l e d 生物應用裝置又缺乏這些功能，因此，開發(fā)出一套針對不同生物實驗對象，光強 高、中、低搭配的l e d 光源將是十分必要的，該生物光源的研制，將使l e d 這 種新型光生物實驗技術(shù)進一步標準化和實用化， 第三章進行了l e d 生物光源的研制，采用透鏡組擴大光束、透鏡陣列聚焦 和點陣光曲面聚集光能三種光路設計，設計出可用于動物細胞和組織培養(yǎng)使用 的，低強度、中等強度和較高強度的l e d 生物光源。在這三種光源中，是通過 選擇每個光源中的四個工作參數(shù)來調(diào)節(jié)輸出光的輻射照度。實際測試數(shù)據(jù)表明： 低強度光源輸出的輻射照度范圍為o 0 0 2 1 0 9 9 6 1 ( w m 2 ) ，在直徑2 0 m m 的照射 面積內(nèi)所測輻射照度的標準偏差為o 0 2 w m 2 ( n = 4 0 ，m e a n ：o 7 1w m 2 ) ；中等強度 光源輸出的輻射照度范圍為o 3 5 7 9 1 1 2 2 8 6 ( w m 2 ) ，在直徑3 0 m m 照射面積內(nèi) 所測輻射照度的標準偏差為o 0 2 w m 2 ( n = 6 0 ，m e a n ：6 3 7w 協(xié)2 ；較高強度光源輸 出的輻射照度范圍為1 7 l i o ( w m 2 ) ，在直徑4 0 m m 照射面積內(nèi)所測輻射照度的 標準偏差為0 0 2 w m 2 ( n = 8 0 ，m e a n ：7 1 5 4w m 2 ) 。經(jīng)檢驗這三種光源在被照射面 上的輻射照度都呈勻稱分布，對測試所得數(shù)據(jù)，使用統(tǒng)計分析軟件s p s s 擬合得 出三種光源的輻射照度經(jīng)驗計算公式，它們顯著性檢驗的p 值都小于o 0 5 。該系 列光源除了具備光強可調(diào)、分布均勻優(yōu)勢外，還具有波長、波峰寬適宜，以及小 巧、價廉、能耗低、發(fā)熱少等特點，尤其是該生物光源在設計時采用的單元組裝 模式，使得不同強度的光照能夠存同一批生物樣品上實現(xiàn)，大大拓寬了生物實驗 的可選擇性，提高了工作效率和實驗準確性。 第四章和第五章，使用以上自制的中等強度的l e d 生物光源，研究在波長為 6 4 0 1 7 r i m 的l e d 紅光作用下，對細胞的促進增殖和抑制凋亡。 促進增殖方面，是用5 9 3 ( w m 2 ) 和7 1 3 ( w m 2 ) 兩種輻射照度的l e d ，照射所 培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞，4 8 小時后用細胞計數(shù)檢測增殖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)人 皮膚成纖維細胞的增殖在接受8 9 m j c m 2 、2 1 4 m j e r a z 照射劑量后無變化，而在接 受4 2 8 m j c m 2 照射后，與對照組相比有顯著性差異。該實驗結(jié)果支持b i m p 模型， 正如1 3 節(jié)所指出的，促進增殖屬于途徑i i ，8 9 m j c m 2 和2 1 4 m j c m 2 這兩個劑量 滿足b i m p l ，無增殖效應，而4 2 8 m j c m 2 劑量滿足b i m p 2 ，促進增殖。 抑制凋亡方面，是用o 9 州，m 2 ) 和1 0 ( w m 2 ) 兩種輻射照度的l e d ，照射所培養(yǎng)的， 由af 3 ( 2 5 3 5 ) 誘導的鼠嗜鉻細胞瘤細胞系p c i 2 。結(jié)果表明，不同劑量的l e d 照射對細胞調(diào)亡有不同影響，以o ，9 ( w m 2 ) 輻射照度的l e d 照射6 0 分鐘，則能 顯著減少由a0 誘導的p c i 2 細胞調(diào)亡。該實驗結(jié)果可以為探討使用光學技術(shù)這 種綠色療法，來防治老年癡呆病提供一定的啟示。 關鍵詞：發(fā)光二極管；輻射照度；成纖維細胞；p c i 2 細胞；細胞增殖；細胞調(diào) 亡 6 a b s t r a c t l e d s ( i i g h te m i t t i n gd i o d e s ) h a v eb e c o m en e wa t t r a c t i v es o l i dl i g h ts o u r c e sw i t h s u p e r i o r i t yi nh i g hr e l i a b i l i t y , h i g hb r i g h t n e s s 1 0 n gl i f ea n dh i g he n e r g ye f f i c i e n c ya n d e x t e n s i v e l yb e e nu s e di nt h ea r e ao fb i gs c r e e nd i s p l a y i n g ，t r a f f i cs i g n a l l i g h t s ， m u l t i m e d i ai n f o r m a t i o ns t o r a g ea n dl i g h t i n g w h e t h e ri np r o d u c t i o nv a l u eo ri no u t p u t ， l e d sw a sd o m i n a t i n go v e rt h es e m i c o n d u c t o rp h o t o e l e c t r i c i t y a p p a r a t u s i nr e c e n t y e a r st h ep o t e n t i a lf o rt h ed e v e l o p m e n to fl e d sf o rs t u d yo f t h ev i s i b l el i g h tf u n c t i o n i nl i f es c i e n c ei sa l s ow e l lr e c o g n i z e dd e s p i t et h ed i f f i c u l t i e st ob eo v e r c o m e i nt h i s p a p e rt h r e el e db i o l o g yl i g h ts o u r c e sw e r ed e v e l o p e da n dh a v eb e e nu s e df o rc e l l b i o l o g ye x p e r i m e n t s i nt h ef i r s tp a r to ft h i st h e s i s ，t h er e a s o n so f d e v e l o pl e db i o l o g yl i g h ts o u r c e h a v eb e e nd i s c u s s e df r o mt h ee f f e c t so fn o n e o n c e m h o m o c h r o m yl i g h to nc e l l s ，t h e m e c h a n i s m sa n dn o n r e s o n a n c ec h a r a c t e r so fp h o t o b i o m o d u l a t i o no nc e l l s ，t h e b i o l o g i c a l i n f o r m a t i o nm o d e lo f p h o t o b i o m o d u l a t i o n ( b i m p ) o f l o w i n t e n s i t y l a s e r ( l i l ) p r o p o s e db y p r o f e s s o rl i ut c y r e c e n ta d v a n c e o f i n v e s t i g a t i o n so fl e d s i r r a d i a t i o ni nl i f es c i e n c ew e r es u m m a r i z e di nt h es e c o n d p a r t o ft h i st h e s i s a p p l i c a t i o n so f l e d st op l a n t ，a n i m a lc e l l ，a n i m a lm o d e l ，h u m a nc l i n i c a l ，b i o m a t e r i a l ， e n v i r o n m e n ts u r v e ya n ds c i e n t i f i cr e s e a r c hw e r er e v i e wi nt h el i t e r a t u r e s i ti sh i g h l y i m p o r t a n tf o rp h o t o b i o m o d u l a t i o no n c e l l st om e a s u r ei r r a d i a t i o nd o s e ，l i g h ti n t e n s i t y a n du n i f o r m i t y p r e s e n t l y , l e db i o l o g ya p p l i c a t i o ne q u i p m e n t sa r er a r e l yf u n c t i o n a b o v eb e c a u s eo fi t sb u s i n e s sp u r p o s e s oi ti sn e c e s s a r yt od e v e l o pas e to fl e d b i o l o g yl i g h ts o u r c e sw i t h d i f f e r e n ti n t e n s i t y t h i sw o r kw i l lm a k el e d l i g h tb i o l o g y t e c h n i q u e m o r es t a n d a r d i z a t i o na n d p r a c t i c a l i t y t h r e el e d sb i o l o g yl i g h ts o u r c e sw i t hd i f f e r e n t i n t e n s i t y f o rc e l lo rt i s s u e c u l t u r eh a v eb e e n d e v e l o p e d i nt h en l i r dp a r to f t h i st h e s i s ac o n c a v e ( c o n v e x ) l e n st o e x p a n d t h eb e a m s o f l i g h t ，t of o c u st h er a y so f l i g h ta n d a na r r a yo f l e d s b e i n gs e ti n t h es p h e r ec o n n e c t e dw i t hf r e s n e ll e n s e sa r et h r e en e w l y - d e s i g n e di no b rs y s t e m s i n 7 e a c hs o u r c et h ei l l u m i n a t i o nc a ne a s i l yb ea a j u s t e db ys e l e c t i o no ff o u rp a r a m e t e r s r e s p e c t i v e l y 。t h ei l l u m i n a t i o n sr a d i a t ef r o mt h r e es y s t e m sw e r em e a s u r e da n dt h e i r e x p e r i e n t i a l f o r m u l a ef o r c a l c u l a t i n g i l l u m i n a t i o nw e r eo b t a i n e d b ys p s s t h e i l l u m i n a t i o no fl i g h tf r o mt h et h r e el e d s y s t e m sr a n g e sf r o m ：o 0 0 2 1 t o0 9 9 6 1 w c m 2w i t ht h es p o td i a m e t e r2 0n l r l li nl o wi n t e n s i t yl e d ss o u r c e ，t h es t a n d a r d d e v i a t i o ni s0 0 2w c m 2 ( n = 4 0 ，m e a n ：0 7 1w c m 2 ) ；0 3 5 7 9t o1 1 2 2 8 6w c m 2w i t h t h es p o td i a m e t e r3 0m mi nm o d e r a t e i n t e n s i t yl e d ss o u r c e ，t h es t a n d a r dd e v i a t i o n i s0 0 2 w c m 2 ( n = 6 0 ，m e a n ：6 3 7w c a n 2 ) ；0 3 5 7 9t o 11 2 2 8 6w c m 2w i t ht h es p o t d i a m e t e r4 0l l l i ni n h i 曲i n t e n s i t yl e d ss o u r c e ，t h es t a n d a r dd e v i a t i o n i s0 0 2 w c m 2 ( n = 8 0 ，m e a n ：7 1 5 4w c m 2 ) a l lt h ef o r m u l a eg e tb ys p s sw a ss i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n tf r o mp t e s tf p o 0 5 ) t h em e a s u r e di l l u m i n a t i o n ss h o wn o t o n l y t h e ya g r e e w i t hc a l c u l a t i o n sb u ta l s ot h e i rd i s t r i b u t i o n sa r ea 1 1u n i f o r m i t y t h ef o r m u l a eg e tb y s p s si sr e l i a b l e t h e s el e d s l i g h ts o u r c e sa r en o to n l ya d j u s t m e n t a n du n i f o r m i t yb u t a l s os m a l l e r , l e s se x p e n s i v e ，r e q u i r e dl e s sp o w e r , g e n e r a t e dl e s sh e a t e s p e c i a l l y , t h e p a t t e r n o ft h ec o n s t r u c tb o t ha g g r e g a t ea n dd e s e g r e g a t ei n d e s i g nw a st o r e a l i z e d i f f e r e n tl i g h ti n t e n s i t yi l l u m i n a t i o no ns a l n eb i o l o g ys a m p l ea tt h es a m et i m e t h e s e l e c t i v i t y , w o r ke f f i c i e n c ya n de x p e r i m e n tv e r a c i t yh a v eb e e ni m p r o v eg r e a t l y i nt h ef o u r t ha n df i f t hp a r to f t h i st h e s i s ，t h ei n v e s t i g a t i o n so f r e dl e d s 1 i 曲tw i t h t h e w a v e l e n g t ho f6 4 0 1 7 n mo nc e l l a c c e l e r a t i n gp r o l i f e r a t i o n a n dc o n t r o l l i n g a p o p t o s i su s i n g o u rm o d e r a t ei n t e n s i t yl e d ss o n r c ew e r ec a r r i e dt h r o u g h i np r o m o t ec e l l p r o l i f e r a t i o n ，t h ee f f e c t so fl e d sw i t ht h et w oi r r a d i a n c e so f 5 9 3w m 2a n d7 13w m 2o nt h ed r o l i f e r a t i o no fh u m a ns k i nf i b r o b l a s t sh a v eb e e n e x p l o r e d a f t e r 4 8h o u r s c e l l sw e r ec o u n t e d a f t e r8 9 m j c m 2a n d2 1 4 m j c m 2 i r r a d i a t i o n ，t h ep r o l i f e r a t i o no ft h ec e l l ss h o w e dn od i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t ht h e c o n t r o lg r o u p t h ec e l l sp r o l i f e r a t i o nw a se n h a n c e db y4 2 8 m j c m 2i r r a d i a t i o n t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss u p p o s e db i m p t h el i g h t su s e di nt h ee x p e r i m e n t a r er e dl i g h t s a s1 3h a dp o i n t e do u t e n h a n c i n gp r o l i f e r a t i o nb e l o n g st op a t h w a yt w o ，8 9 m j c m 2 a n d2 14 m j c m 2s a t i s f i e db i m p i ，w h i c h s h o w e dn o p r o l i f e r a t i o np h e n o m e n a 4 2 8 m j c m 2s a t i s f i e db i m p 2 ，w h i c hs h o w e dp r o l i f e r a t i o np h e n o m e n a 8 i nc o n t r o l l i n gc e l l a p o p t o s i s ，m o n o l a y e rc e l l c u l t u r e so fp c i 2i n d u c e db yap w e r ei r r a d i a t e dw i t hl e d sa tt h et w oi r r a d i a n c e so f0 9 | 碚a n d10w m 2 jc e l l a p o p t o s i sw a sc o n f i r m e db yd n af r a g m e n t a t i o na s s a ya n df a s c a nf l o wc y t o m e t e r a s s a y t h er e s u l t ss h o w sd i f f e r e n td o s e so f l e d si r r a d i a t i o nh a v ed i f f e r e n te f f e c t so n t h ea p o p t o s i s t h el e d i r r a d i a t i o n ，w h e nu t i l i z e da tp o w e r o f 0 9 w m 2a n d6 0m i n u t e h a ss i g n i f i c a n t l yd i m i n i s h e dabi n d u c e da p o p t o s i so fp c i 2c e l l s t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t sp r o v i d e du s e f u l n e s sr e v e l a t i o n so fp h o t o t h e r a p e u t i c si np r e v e n t i o na n dc u r e a l z h e i m e r d i s e a s e ( a d ) ， k e yw o r d s ：l i g h te m i t t i n gd i o d e ( l e d ) ，i r r a d i a n c e ，f i b r o b l a s t s ( f b s ) ，p c 1 2c e l l s ， p r o l i f e r a t i o n ，a p o p t o s i s 9 攻讀博士期問所完成的論文 1 劉江，角建瓴，劉承宜，范廣涵l e d 在生物醫(yī)學方面的應用和前景激光雜 志2 0 0 2 ，2 3 ( 6 ) ：1 - 4 2 劉江，范廣涵，劉承宜用于細胞及組織培養(yǎng)的低強度l e d 生物光源激光雜 志2 0 0 3 ，2 4 ( 4 ) ：7 8 8 0 3 劉江，劉承宜，范廣涵用于細胞及組織培養(yǎng)的中等強度l e d 生物光源光學 技術(shù)2 0 0 3 ，2 9 ( 5 ) ：5 2 6 5 2 9 4 劉江，范廣涵，劉承宜用于細胞及組織培養(yǎng)的高強度l e d 生物光源激光生 物學報2 0 0 3 ，1 2 ( 4 ) ：3 0 8 3 1 2 5 劉江，劉承宜，范廣涵用于動物細胞和組織培養(yǎng)的新型l e d 生物光源系列 光子學報2 0 0 4 ，3 3 ( 2 ) ：1 5 1 1 5 4 6 劉江，范廣涵，劉承宜改進實用型l e d 生物光源系列應用激光2 0 0 3 ，2 3 ( 3 ) ：1 4 7 。1 5 1 ( e i 收錄) 7 劉江，劉承宜，范廣涵l e d 技術(shù)在光生物及醫(yī)學等領域的應用( 第十六屆全 國激光學術(shù)會議邀請報告) 中國激光2 0 0 4 增刊，3 l ( 3 ) ：1 - 3 8 l i uj ，l i ut c y , j i a oj l ，f a ng h ，l i us h 2 0 0 4 ，d e s i g no f l i g h t e m i t t i n gd i o d e l i g h ts o u r c e sf o rp h o t o b i o m o d u l a t i o no nc e l l s l a s e r ss u r g m e d s 1 6 ：4 1 ( s c i 收錄) 第一章l e d 生物光源的研制背景 1 1l e d 的特性和用于生物光源的前景 發(fā)光二極管簡稱l e d 0 i g h te m i t t i n gd i o d e s ) 是在半導體p - n 結(jié)為基礎的多層 結(jié)構(gòu)或者是與其類似的結(jié)構(gòu)中通以正向電流時，能夠高效率發(fā)出可見光或其它波 長光的器件，可見光是指人眼睛能感覺到的輻射，波長范圍為紫光3 8 0 n m 到紅 光7 6 0 n m ，目前已有紅外、紅、黃、綠、藍、紫等各種發(fā)光二極管。 l e d 具有把電能直接轉(zhuǎn)化成光能的特點。與自熾燈相比，l e d 具有以下優(yōu) 點 方志烈1 9 9 2 】：( 1 ) 尺寸小、重量輕、易小型化和集成化；( 2 ) 全固體化，機 械性能好，可靠性高；( 3 ) 冷光源，轉(zhuǎn)化效率高；( 4 ) 高亮度、功率小、驅(qū)動電 壓低，可與集成電路匹配使用；( 5 ) 壽命長，亮度半衰期大于1 0 5 小時；( 6 ) 響 應時間短，一般為毫微秒數(shù)量級；( 7 ) 可多色顯示，選擇不同的半導體材料，控 制不同的摻雜元素和濃度，可獲得不同波長的光。 隨著l e d 材料生長技術(shù)的發(fā)展和制備工藝的完善，商品化l e d 的發(fā)光效率 幾乎每十年提高一個數(shù)量級，其性能的提高推動了l e d 的應用發(fā)展，從汽車車 燈、交通指示燈到多媒體信息存儲，從全彩色大屏幕顯示到白光照明，其應用范 圍日益廣闊，可以說已進入千家萬戶，遍及國民經(jīng)濟各部門。 目前生命科學研究中所采用的人工光源按照發(fā)光原理可分為熱輻射和電致 發(fā)光兩大類，如在動植物科研以及生物醫(yī)學材料開發(fā)應用中已經(jīng)普遍使用的白熾 燈、金屬鹵化物燈、各種氣體放電燈( 如熒光燈、高壓鈉燈、高壓氙燈、高壓汞 燈等) a n 激光器等，前面幾種光源給出的光譜都比較寬，無法確定生物反應對什 么波長最強烈，而且產(chǎn)生的熱和紅外輻射較多，需要用濾光片和吸熱濾片將光譜 窄化并降低輻射熱，以獲得符合要求的光譜分布，使光譜半寬窄化的另外方法是 選擇衍射光柵單色儀或棱鏡單色儀，但這些儀器中復雜和昂貴的機械零部件往往 使操作者難度加大，在這些方法中當光能經(jīng)過各種濾光片和多級單色儀后，損失 增大，從而不得不使用更強的光源，增加了能耗。 激光器是目前最好的單色光源，它所給出的光強度高，單色性和相干性都較 好，對細胞的微束照射很有用，近些年來激光用于生命科學研究已經(jīng)取得很大成 功，但激光器目前可供選擇的波長有限，發(fā)射的光束十分細小，而細胞的培養(yǎng)和 生物育種都需要大面積的光源，另外激光的譜線較窄，它一般發(fā)出僅僅o 0 1 r a n 寬的單一波長的光，而大多數(shù)生物實驗并不需要非常窄的光，一般地說半高寬從 幾到幾十納米的光就可以，而這正好是l e d 的光譜半寬范圍，目前l(fā) e d 光譜峰 的半寬最窄已可達到十幾個納米以下，這使得利用l e d 來進行光生命作用機理 的研究成為可能。 近年來隨著l e d 制作水平的飛速進步，尤其是在發(fā)光強度、波長與價格方 面，目前己開發(fā)的l e d 與激光器相比也毫不遜色，甚至更有優(yōu)勢，尤其是在后 兩方面，由于l e d 發(fā)光效率大為提高，如目前最強的橙紅色l e d ( 波長6 1 5 n m ) ， 發(fā)光效率為1 0 0 流明瓦，它所產(chǎn)生的光通量已相當于4 m w 左右的氦氖激光器， 完全可以滿足一般的臨床低強度治療的需要。而在波長、實用性與價格方面，目 前的l e d 則遠遠勝過激光器，同激光器只能輸出幾個有限的波長不同，目前的 l e d 的波長范圍已經(jīng)可以覆蓋整個可見光區(qū)，在實際使用時，還可以將各種不 同波長的l e d 做在同一個光源里使用，這一點又是目前的激光器所不能做到的。 而從實用方面看，激光器的電源技術(shù)要求高，耗能大，泵浦源物質(zhì)的能量轉(zhuǎn)化效 率很低，第一代激光器均需要復雜的水循環(huán)散熱系統(tǒng)才能工作，而半導體激光器 由于技術(shù)含量高，開發(fā)成本高，價格昂貴，也限制了它的應用 j i a n gj i a np i n g 2 0 0 0 ，在市場價格方面，二者更是不可相比，l e d 由于結(jié)構(gòu)簡單、供電電源小 巧、功耗低、壽命長、可靠易推廣，因此它的價格遠遠低于目前市場上的任何一 類激光器。因此，這些原因使得用l e d 這種新光源來代替目前的激光器，進行 生命科學的研究和應用，具有了廣闊的前景和較高的實用價值。 1 2k a r u 關于非相干單色光的細胞生物效應 k a v a 在六年時間里，從動物細胞分子水平上，系統(tǒng)地研究了細菌、酵母菌 和哺乳動物細胞在u l 與可見光作用下的行為，發(fā)現(xiàn)光刺激效應主要與波長、照 射劑量和照射方式有關，而相干光的條件不是必須 k a r u t1 9 8 9 。因此，l e d 可 以代替目前在生物醫(yī)學中普遍使用的激光。 k a r u 對這些不同水平的生物體，用相干性好的激光與相同波段的可見光進 行的對比實驗表明：無論是在d n a 或蛋白質(zhì)的合成速率 f e d o s e y e v a e ta l1 9 8 4 ， k a r u t i1 9 8 4 ，細胞或細菌生長速率 t i p h l o v a1 9 8 6 ，k a v a t i1 9 8 3 ；以及各種酶 的活性i f e d o s e y e v a l 9 8 6 和c a m p 水平 k a r u t l l 9 8 5 ，1 9 8 7 的測試結(jié)果來看， = 者具有相同的刺激效果。而用相干和不相干的紅光在治療消化道潰瘍方面也會 有相同的效果 s a z o n ve ta l1 9 8 5 ，從而說明非相干性可見光同樣可以達到激光 的生物刺激效果。另外，k m - u k a r u1 9 9 8 還根據(jù)大量的實驗結(jié)果從氧化還原電 位的角度提出了這樣的觀點，如果細胞的氧化還原電位已經(jīng)處于細胞可以發(fā)揮i e 常功能的狀態(tài)，細胞對低強度單色光就沒有響應；細胞的氧化還原電位比這個j 下 常值越低，細胞對低強度單色光的響應越大。t u n & 等人 t u n e rja n dh o d el1 9 9 9 進一步指出，只有對那些生物功能需要調(diào)整的生物組織，低強度單色光才能產(chǎn)生 影響。這跟下面要介紹的光生物調(diào)節(jié)作用機理是相符的。 1 3 光生物調(diào)節(jié)作用機理 低強度單色光對生物細胞和組織具有生物調(diào)節(jié)作用，也就是說，既具有刺激 作用，也具有抑制作用，這種生物調(diào)節(jié)作用可能既與單色光的波長、劑量有關， 也與細胞本身的功能狀態(tài)有關。影響低強度單色光生物效應的因素非常復雜，因 此，實驗條件稍有不同就容易導致不同、甚至相反的結(jié)果。 如果單色光的能量剛好與色素的分子能級間隔相匹配，單色光與色素就可以 發(fā)生共振作用。哺乳動物或人的視覺細胞膜上的視色素就可以共振吸收可見光， 但一般非視覺細胞膜上沒有這樣的色素分子。研究表明 k a m1 9 9 8 ，低強度單 色光對非視覺細胞有信號作用。目前光對細胞的調(diào)節(jié)通路可以分為兩類，特異性 通路由細胞色素c 氧化酶 k a r u l 9 8 7 ，1 9 8 9 & 1 9 9 8 ，y u e t a l1 9 9 7 ，e e l l se ta l2 0 0 3 、 血色素 b o r i s e n k oe ta l1 9 9 7 ，s t a d l e re ta l2 0 0 0 ，v y g o v s k ye ta l2 0 0 2 ，m ie t a l 2 0 0 4 、單線態(tài)氧 l i n d g a r d e ta l2 0 0 3 和內(nèi)源性卟啉 k l e b a n o v e ta i2 0 0 3 a 等光敏 物質(zhì) l a v ie ta 1 2 0 0 3 與光發(fā)生共振作用的分子所介導，非特異性通路由與光不能 發(fā)生共振作用的細胞的膜分子所介導 l i u t c yc t a l1 9 9 9 ，2 0 0 0 & 2 0 0 3 a 。 關于低強度單色光的作用機制，目前主要有k a r u k a r u1 9 9 8 的線粒體學說和 劉承宜 l i u t c y l 9 9 9 2 0 0 0 1 等人的生物信息模型學說。k a r u 認為，低強度單色光 可被細胞線粒體中的細胞色素所吸收，隨后不但促進a t p 的合成，而且可以通 過電子傳遞鏈產(chǎn)生的氧化還原反應調(diào)節(jié)細胞的功能。劉承宜等人認為低強度單色 光的生物信息調(diào)節(jié)作用是由細胞膜受體所介導的，細胞膜化學配體的受體可與低 強度單色光發(fā)生非共振作用。按照量子力學，非共振作用可以忽略，然而，當細 胞膜受體處于相干狀態(tài)時，這種非共振作用可被相干狀態(tài)下的受體數(shù)目非線形放 l3 大，只有病理狀態(tài)下的細胞膜受體才會處于相干狀態(tài)，因此，低強度單色光只能 對病理狀態(tài)下的細胞產(chǎn)生效應。病理細胞處于相干狀態(tài)的受體接受光信號以后， 將改變構(gòu)型，并啟動細胞內(nèi)部的信號轉(zhuǎn)導通路。劉承宜等人 l i ue ta l 1 9 9 9 2 0 0 0 2 0 0 3 a 將這種光信號轉(zhuǎn)導稱為協(xié)同光信號轉(zhuǎn)導。 1 4 光生物調(diào)節(jié)中的非共振作用特征 共振作用是特異性的，只要有滿足相應條件的光子和分子，共振作用肯定可 以發(fā)生，非共振作用是非特異性的，因為發(fā)生的幾率很小，需要特殊的條件才可 以發(fā)生。而光生物調(diào)節(jié)作用只能作用于病理的細胞或組織。對于共振作用來說， 只要滿足相應條件的分子系統(tǒng)吸收相同數(shù)目的光子( 光的照射莉量樣) ，效應 應該是相同的，即倒易規(guī)則成立。然而倒易規(guī)則對光生物調(diào)節(jié)作用不成立，根據(jù) 倒易規(guī)則( b u n s e n r o s c o e 規(guī)律) ，當光劑量( 光強乘以光照時間) 保持恒定時， 光化學響應對光強和光照時間是獨立的。但對于光生物調(diào)節(jié)作用，給定劑量的光， 存在一個最佳光強或最佳照射時間 v a nb r e u g e le ta l1 9 9 2 ，k a r u1 9 9 8 ，s c h i n d le t a l2 0 0 1 。光參數(shù)如果不在最佳強度附近，光就沒有生物調(diào)節(jié)作用。這是非共振 作用的第一個最顯著特點。大量實驗證明，這種非共振作用的另外幾個顯著特點 是：第二，低強度單色光所產(chǎn)生的細胞效應非常弱。正如k a r ue k a v a1 9 9 8 所指 出的，盡管低強度單色光的細胞效應很弱，有時甚至觀察不到，關于低強度單色 光的細胞效應研究還是屢見報道。這說明，低強度激光細胞效應確實存在，但效 應很弱，而且只有具備了一定的條件才可以觀察到。第三，幾乎可見光波段的每 一種單色光都可以產(chǎn)生細胞效應 k a r u1 9 9 8 。非視覺細胞不同于視覺細胞，即 使線粒體的細胞色素對可見光有共振吸收，也不會像視色素那樣覆蓋整個可見光 波段，蛋白質(zhì)或核酸等細胞生色團的光譜吸收峰的波長都比可見光短得多，生色 團對可見光的吸收只能是非共振吸，也f 是這種非共振吸收可以解釋所有波段的 可見光都有細胞效應。第四，與共振作用不同的是低強度細胞效應不是精確依賴 于激光的波長或頻率。例如，6 2 0 n m 和6 8 0 n m 的激光都可以促進h e l a 細胞在玻 璃上的黏附 k a r ue ta l1 9 9 6 。第五，非共振吸收的損傷閾值遠遠高于共振吸收。 由于非共振作用的以上這些特點。因此，對大多數(shù)動物細胞或組織的光生物 調(diào)節(jié)作用，光源并不需要非常窄的光，一般來說譜線半寬度從幾到幾十納米就可 以，而這正好是在發(fā)光二級管的波段寬范圍。 1 5 生物信息模型m i m p l 絀胞膜受體非共振吸收單色光信號后所發(fā)生的下游過程與一般信號轉(zhuǎn)導類 似。通過分析大量的基礎與臨床研究，劉承宜等人 l i u e ta l1 9 9 9 & 2 0 0 0 & 2 0 0 3 a ， 劉承宜等1 9 9 7 & 2 0 0 0 提出了光生物調(diào)節(jié)作用的生物信息模型( b i m p ) ，從| 辦同 光信號轉(zhuǎn)導( c o l l e c t i v ep h o t o t r a n s d u c t i o n ) 的角度成功解釋了低強度單色光的信 息功能。將可見光劃分為，u v a ( 3 2 0 4 0 0 n m ) 、紫、藍和綠等冷色和紅外( i r ) 、 紅、橙和黃等暖色兩類。a l m e i d a l o p e s 等人e a l m e i d a - l o p e s e ta l2 0 0 1 研究了 6 7 0 、6 9 2 、7 8 0 和7 8 6n l n 四種波長的激光對人齒齦成纖維細胞的增殖作用，發(fā) 現(xiàn)相同強度的激光誘導的細胞增殖作用與波長無關。這個結(jié)果支持b i m p 對可見 光的分類。 細胞對不同劑量段的暖色光或冷色光作出不同的反應，而且不同細胞的劑量 效應規(guī)律不同。不同細胞的生理過程，有不同的分類。對于血細胞、血管內(nèi)皮細 胞、平滑肌細胞和巨噬細胞等細胞，可以按照信號轉(zhuǎn)導途徑來分類： 生理過程1 ：g s 蛋白介導的信號通路：c a m pf ； 生理過程2 ：g q 蛋白，g i 蛋白或受體關聯(lián)酶介導的信號通路：c a m p4 。 人二倍體成皮膚纖維細胞用氦氖激光照射后，對細胞數(shù)量和膠原蛋白i 型量 進行t n 定。低能量的激光( 低于2 ，9 1 m w ) 和較短的照射時間( 0 5 到2 分鐘) 大多具有促進作用，高能量( 5 9 8 r o w ) 則無影響。值得注意的是，膠原蛋白i 型的產(chǎn)生與細胞的增殖相互拮抗：當細胞增殖提高，則膠原蛋白i 型就會減少 v a l l b r e u g e l e ta l1 9 9 2 。因此，對于成纖維細胞，可以按照細胞的功能來分類： 生理過程1 ：膠原合成 生理過程2 ：細胞分裂 按照b i m p ， 暖色興奮信號生理過程1 冷色興奮信號生理過程2 為了討論的方便，將上述模型稱為b i m p l 。 根據(jù)b i m p 可知，b i m p l 的成立有一定的劑量范圍。當激光的劑量超過 b i m l l 成立的閾值時，可以得到b i m p 2 ： 冷色興奮生理過程1 暖色興奮生理過程2 這個劑量范圍是研究得最多的。b i m p 2 得到了3 0 0 j m 2 低強度h e - n e 激光誘 導牛中性粒細胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)實驗 d u a n e ta l2 0 0 1 1 的直接驗證。用化學發(fā)光法測 量激光誘導中性粒細胞在體外呼吸爆發(fā)，用g e n i s t e i n 等胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子活性 抑制劑研究產(chǎn)生這一效應的信號轉(zhuǎn)導途徑。實驗發(fā)現(xiàn)，酪氨酸蛋白激酶( p t k s ) 抑制劑g e n i s t e i n ( 1 0 0 m ) 完全抑制了這一效應，磷脂酶c ( p l c ) 抑制劑u 一7 3 1 2 2 ( 1 m ) 和蛋白激酶c ( p k c ) 抑制劑c a l p h o s t i nc ( 5 m ) 部分抑制了這一效應。 實驗結(jié)果表明，p t k s 在誘導呼吸爆發(fā)過程中起重要作用； f p t k s p l c p k c n a d p h 氧化酶】這一信號轉(zhuǎn)導途徑可能參與了激光誘導呼吸爆 發(fā)產(chǎn)生的過程。3 0 0 j m 2 屬于第二個劑量段。h e n e 激光屬于暖光。p t k s 介導的 信號通路屬于途徑2 。顯然，b i m p 2 成立。 當激光的劑量超過b i m p ( 2 n 一1 ) 成立的閩值時，根據(jù)b i m p ，可以得到 b i m p 2 n = b i m p 2 ；當激光的劑量