江干區(qū)人民醫(yī)院性病實驗室檢測操作規(guī)程參照標(biāo)準(zhǔn) 1、醫(yī)療機構(gòu)性病門診規(guī)范化管理資料匯編，2、試劑相關(guān)說明書2010.12.1目 錄一、淋病檢查的實驗室技術(shù)2(一)分泌物涂片檢查2（二）淋球菌的分離培養(yǎng)3（三）淋球菌的保存4（四）氧化酶試驗5二、支原體的檢測5三、衣原體檢查6四、梅毒的實驗室檢測7(一)直接鏡檢8（二）非特異性梅毒螺旋體試驗8五、TPHA梅毒螺旋體血凝試驗9一、淋病檢查的實驗室技術(shù)(一)分泌物涂片檢查急性淋菌性尿道炎患者常有大量膿性分泌物。在有些膿細(xì)胞內(nèi)可見革蘭氏染色呈陰性的雙球菌，橢圓或球形，常成雙排列。因形態(tài)特殊，可取患者尿道分泌物制成涂片后染色，檢查有無典型細(xì)胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌，可作為初步診斷的依據(jù)。標(biāo)本采集尿道分泌物、宮頸粘液、尿的離心沉淀物。涂片鏡檢涂片后，待自然干燥后，加熱固定，行革蘭氏染色，油鏡觀察。結(jié)果在急性患者的尿道膿性分泌物革蘭染色涂片中，?？梢姷酱罅考t色多形核白細(xì)胞，有些細(xì)胞中吞噬有淋球菌。多數(shù)多形核白細(xì)胞中并不含淋菌，但不少細(xì)胞中常含有1對或數(shù)對，甚至2030對。淋球菌常存在于細(xì)胞漿內(nèi)。在病期較長或經(jīng)過治療的淋病患者的涂片中淋球菌比較少，有時呈單個、四聯(lián)和八疊狀，且常位于細(xì)胞外。對有些細(xì)菌難以下結(jié)論時，需進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。注意事項1涂片時不要用力涂擦，而應(yīng)將棉拭在玻片上輕輕滾動。涂擦過重，細(xì)胞容易破裂變形，致細(xì)菌從胞內(nèi)溢出。2涂片厚薄適宜。過厚，加之染色過程中脫色時間不足，革蘭染色易呈紫色。因此，脫色時間要視涂片厚薄而定。3固定涂片時，迅速通過火焰23次，避免加熱過度使細(xì)胞變形。熱度以不燙手為宜。4不推薦用涂片檢查來診斷淋菌的直腸和咽部的感染，也不推薦用來作判愈。方法評價涂片檢查方法簡便、有效、價格低廉且有一定的敏感性和特異性。但其特異性隨取材部位的不同而有所不同。男性尿道取材特異性較高，而從女性子宮頸取材特異性較低。因此，世界衛(wèi)生組織不推薦用涂片法來診斷女性患者。革蘭氏染色（一）操作步驟1. 細(xì)菌涂片須經(jīng)火焰固定。2. 先用甲液滴加在標(biāo)本上，加的量以蓋住標(biāo)本為準(zhǔn)，再加等量的乙液，混勻，染3-5秒，用自來水從玻片的一端沖去染液，甩干。3. 滴加適量堿性碘液在標(biāo)本上，3-5秒后，自來水沖洗，甩干。4. 丙酮酒精脫色，脫色的標(biāo)本為：當(dāng)丙酮酒精滴加在標(biāo)本上，不出現(xiàn)藍(lán)色或淡紫色為宜。5. 用堿性復(fù)紅復(fù)染，覆蓋標(biāo)本，3-5秒后，自來水沖洗，待其自然干燥或用吸水紙吸干，油鏡觀察。 （二）淋球菌的分離培養(yǎng)如果標(biāo)本中有淋球菌，則在合適的培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)后可長成菌落。各種細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)各不相同。根據(jù)菌落的大小，表面高起或扁平、光澤、色素和邊緣的情況等，作為細(xì)菌鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。 1方法 （1）取材培養(yǎng)要取得成功，取材部位和方法要準(zhǔn)確。由男性患者前尿道取材時，應(yīng)該用細(xì)小拭子伸入尿道口24cm，取出的分泌物應(yīng)略帶粘膜。從女性患者宮頸取材時，應(yīng)先用溫水濕潤擴陰器（不能用液體石蠟等潤滑油）。應(yīng)讓棉拭充分吸附分泌物。從直腸取材時，應(yīng)將棉拭插入肛門2.5cm以上，如果棉拭碰到糞便，應(yīng)換一個棉拭重取。檢查淋菌性咽炎時，應(yīng)從扁桃體及扁桃體窩取材。為了提高陽性率，可同時取二份標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。（2）培養(yǎng)基由于淋球菌的營養(yǎng)要求復(fù)雜，所用的培養(yǎng)基中應(yīng)含有動物蛋白及細(xì)菌和生長所需的多種因子。目前國內(nèi)常用的是血液瓊脂或巧克力瓊脂。為抑制雜菌，在培養(yǎng)基中可加入少量抗菌素和淋球菌增菌劑，使大多數(shù)雜菌被抑制而淋球菌菌落長得較大，在平皿中幾乎呈純培養(yǎng)，從而提高分離的陽性率。（3）培養(yǎng)條件淋球菌對外環(huán)境變化頗為敏感，對寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，取材后應(yīng)立即接種。接種的平皿應(yīng)先放在37溫箱中預(yù)溫。培養(yǎng)的最適溫度為3536，超過38.5或低于30便生長不良。最初從人體分離時，需用5%二氧化碳環(huán)境，為保持一定的濕度，可在培養(yǎng)缸中放些濕棉球。 2結(jié)果淋球菌平皿上經(jīng)2448小時的培養(yǎng)后，可形成橢圓形、凸起、浸潤、光滑、半透明或灰白色菌落。邊緣呈花瓣狀，用接種環(huán)觸之有粘性。如繼續(xù)培養(yǎng)，菌落面積增大，表面變得粗糙，邊緣出現(xiàn)皺縮。從菌落上取材涂片，形態(tài)有25%較為典型，其他75%為單球菌、四聯(lián)形或八疊形。 3注意事項 （1）取材是培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵。因為淋球菌好發(fā)于柱狀上皮細(xì)胞，取材深度一定要夠，女性患者取材時，將棉拭插入宮頸管，轉(zhuǎn)動并停留1030秒，蘸取少量粘膜，陽性率才高。 （2）對癥狀不典型的男性患者，最好是在晨起排尿前或排尿后23小時后取材。必要時做前列腺按摩取材。 （3）對女性淋病的檢查主張用淋球菌培養(yǎng)。 （4）觀看菌落特征最好在36小時左右。培養(yǎng)24小時，菌落小，難以辨認(rèn)其特征。超過36小時，菌落特征也會有較大改變。 4方法評價培養(yǎng)法對男性及女性標(biāo)本都是適用的，是世界衛(wèi)生組織推薦篩查淋病患者的唯一方法，也是診斷淋病的金標(biāo)準(zhǔn)。（三）淋球菌的保存淋球菌在巧克力瓊脂或血瓊脂上需每天傳代，將血液瓊脂上的培養(yǎng)物洗于無菌的脫脂牛奶中，存放于-25冰箱可保存2個月，于-70，可保存1年，如保存于液氮中，可無限期保存。也可將細(xì)菌洗于30%甘油肉湯培養(yǎng)基（甘油30mL，營養(yǎng)肉湯70ml，121滅菌15分鐘）0.5ml中，低溫冷凍；或?qū)⒕N于巧克力瓊脂斜面，36培養(yǎng)過夜后以滅石蠟覆蓋，蓋好蓋后放37保存。使用時只需從斜面上刮下少許淋球菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，不必將石蠟倒掉。淋球菌在37可存活6個月以上。（四）氧化酶試驗淋球菌具有氧化酶，能使氧化酶試劑氧化，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。1、稱取氧化酶試劑（鹽酸二甲基對苯二胺或鹽酸四甲基對苯二胺）0.1g，溶于10ml蒸餾水中。裝于棕色小瓶，冰箱保存?zhèn)溆谩?、在混有雜菌的淋球菌分離平皿上，如發(fā)現(xiàn)有符合淋球菌特征的菌落，可在其上滴加氧化酶試劑一滴，如菌落在接觸氧化酶試劑1015秒鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色并保持30秒鐘以上（最后變成黑色）者為氧化酶試驗陽性。3、也可先將試劑滴在一張濾紙上，然后挑取可疑菌落與之接觸，或先將菌落涂在濾紙上再滴加試劑，觀察有無紅色出現(xiàn)。菌落顯紅色為陽性。4、氧化酶試驗對快速鑒定淋球菌有一定意義。淋球菌氧化酶試驗陽性，但氧化酶陽性的不全是淋球菌。為了保證有良好的反應(yīng)，不要使用過分陳舊的氧化酶試劑，正常的氧化酶試劑應(yīng)為粉紅色，如試劑已成灰黑色，說明已失效而不應(yīng)再使用。試劑配好后應(yīng)避光保存并盡快用完，因此，每次不要多配。氧化酶試劉遇鐵也會出現(xiàn)紅色而造成假陽性，因此，操作用的接種環(huán)最好用鉑絲做成，在用其它材料時應(yīng)檢查未挑菌落的接種環(huán)在接觸沾有試劑的濾紙時是否有紅色出現(xiàn)。二、支原體的檢測 支原體是介于病毒和細(xì)菌之間的一類無細(xì)胞壁,能用非活體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的最小微生物。人類支原體均屬支原體科范疇，共有14種。其中有常引起呼吸道感染的肺炎支原體，常引起泌尿生殖道感染的解脲支原體(UU)和人型支原體(Mh)。實驗室檢查一、標(biāo)本采集棉拭或疑有感染的分泌液等。由于支原體對熱及干燥很敏感，故宜及早接種。二、分離培養(yǎng)及鑒定解脲支原體含有脲酶，以尿素為能量來源，分解尿素產(chǎn)生NH4+使培養(yǎng)基變堿，人型支原體能利用精氨酸釋放氨，在含有酚紅指示劑的液體培養(yǎng)基中使培養(yǎng)基顏色由黃變紅。三、設(shè)備及材料1、液體培養(yǎng)基內(nèi)含牛心浸液，小牛血清，新鮮酵母浸膏，0.05%尿素，0.002%酚紅和抗生素2、普通恒溫培養(yǎng)箱四、操作用無菌微量移液嘴吸取50ulEPS于培養(yǎng)基中或是把棉拭放入培養(yǎng)基中混勻擠干后取出，37，24-48小時觀察結(jié)果。五、結(jié)果判斷陽性：透明玫瑰紅（或稍有混濁）陰性：黃色或桔黃色；混濁粉紅色可能由細(xì)菌污染也多為陰性。六、方法學(xué)比較支原體直接鏡檢的意義不大，其形態(tài)難與組織細(xì)胞或滲出液中的其它顆粒相區(qū)別，故不利于臨床診斷。用特異性抗體鑒定支原體及血清學(xué)分型的方法有生長抑制試驗、補體結(jié)合試驗、熒光免疫反應(yīng)，但是目前還沒有理想的診斷支原體感染的血清學(xué)方法，確證必須進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定。在固體培養(yǎng)基上UU生長成微小油煎蛋狀菌落，需用Dienes染色后用光學(xué)顯微鏡觀察才能看清楚。三、衣原體檢查衣原體：是介于細(xì)菌與病毒之間的，專性真核細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物。其主要特征是具有獨特的發(fā)育周期，在宿主細(xì)胞內(nèi)能形成光學(xué)顯微鏡可見的細(xì)胞內(nèi)包涵體。衣原體一共有15種血清型，其中可引起男女泌尿生殖系疾病的是DK型。實驗室檢查標(biāo)本采集：標(biāo)本選送的正確與否，直接影響到陽性分離率。因衣原體感染女性子宮頸柱狀上皮細(xì)胞和男性尿道上皮細(xì)胞，為確保采集到足夠的標(biāo)本量，應(yīng)將棉拭沿表面反復(fù)滾動10-30秒，女性避免與陰道接觸，男性在標(biāo)本采集之前一小時內(nèi)不應(yīng)小便。采集時必須從上皮部位用力拭刮，膿性分泌物不適用于衣原體檢查，應(yīng)先清除后再采樣?？乖瓩z測：斑點免疫層析法原理：標(biāo)本窗的吸收墊含有免疫金復(fù)合物（含有抗衣原體屬特異性脂多糖表位和乳膠標(biāo)記的單克隆抗體-小鼠IgG），測試區(qū)包被有特異的抗衣原體抗體，提取液使標(biāo)本窗的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，若待測物含有衣原體抗原則與之結(jié)合，并向膜條滲移，在測試區(qū)被固相抗體所獲，顯出反應(yīng)線，過剩的復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小鼠IgG結(jié)合，顯出質(zhì)控線。反之，陰性標(biāo)本，僅顯示質(zhì)控線。試劑準(zhǔn)備1. 將樣品處理管放在工作臺上，加入6滴溶液A。2. 將采樣拭子放入含有溶液A的樣品處理管中，室溫放置，在處理過程中不斷旋轉(zhuǎn)并在管壁擠壓拭子，盡量使液體流出，重復(fù)多次處理2分鐘。3. 然后加入6滴溶液B，旋轉(zhuǎn)拭子，盡量使液體流出，然后按感染物品的處理方法將拭子丟棄。4. 處理后的樣品如在60分鐘內(nèi)使用，并不影響試劑盒的檢測結(jié)果。5. 注意：用A、B液處理樣本拭子滴加的溶液量應(yīng)相等。操作程序1. 請在操作前仔細(xì)閱讀檢測試劑盒說明書。2. 將檢測試劑盒從密封袋中取出，放置在潔凈、干燥和水平的工作臺上，標(biāo)明樣品編號或名稱。如果檢測試劑盒保存于低于室溫處，須將檢測試劑盒及試劑提前取出，放至室溫后方可使用。3. 將樣品處理管中已處理的樣品滴加23滴至檢測試劑盒的加樣孔中。4. 等待結(jié)果的出現(xiàn)。加樣10分鐘時可判讀結(jié)果。紅線顯示的時間根據(jù)拭子所采集衣原體含量的不同而變化，有些陽性樣品可在60秒鐘后出現(xiàn)結(jié)果。為了確保陰性結(jié)果，請勿在15分鐘后判讀結(jié)果。結(jié)果：1. 陰性結(jié)果：僅質(zhì)控區(qū)（C）有一條紅線，檢測區(qū)（T）無紅線出現(xiàn)。2. 陰性結(jié)果：除質(zhì)控區(qū)外，另有一條紅線出現(xiàn)在檢測區(qū)（T）。3. 無效結(jié)果：質(zhì)控區(qū)不出現(xiàn)紅線，則結(jié)果無效。應(yīng)更換新的檢測試劑盒重復(fù)實驗?？捎檬Ｓ嗟囊烟幚淼臉悠坊蛑匦氯?。4. 注意：當(dāng)檢測線很強時，質(zhì)控線可能相對減弱，此屬正?，F(xiàn)象。臨床意義：作衣原體診斷的參考。結(jié)果陽性表示病人可能有衣原體感染，但需結(jié)合臨床癥狀全面考慮。注意事項：本試驗敏感性為87%，特異性為98.8%。標(biāo)本中需有一定量的抗原，提取的抗原量低于試驗敏感性時可出現(xiàn)假陰性。故試驗結(jié)果陰性時，不能完全排除有沙眼衣原體的感染，這與標(biāo)體采集的數(shù)量不足有關(guān)。操作簡便但敏感性差，且受實驗人員的主觀影響大，技術(shù)水平要求高。易把某些發(fā)光顆粒（白細(xì)胞、上皮細(xì)胞、色素顆粒）誤認(rèn)為沙眼衣原體。四、梅毒的實驗室檢測梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema palidum)感染引起的性傳播疾病.梅毒螺旋體長6-20um,寬0.09-0.18um，有規(guī)則密螺旋，人工培養(yǎng)很難成功。目前的實驗室診斷主要有：皮膚黏膜損傷時用顯微鏡暗視野鏡檢，非梅毒螺旋體血清試驗和特異性梅毒螺旋體試驗。結(jié)合臨床可對梅毒作出肯定、推斷和提示三種判定。臨床懷疑為梅毒的病人，一般先進(jìn)行梅毒常規(guī)篩選實驗。(一)直接鏡檢1、標(biāo)本采取對于一期、二期梅毒可采取病灶分泌物，淋巴結(jié)穿刺物或活檢組織。三期梅毒取活檢組織做檢察。在硬下疳皮膚粘膜取材，需先用浸或生理鹽水的棉花球輕輕檫去覆蓋的枷皮，然后用玻片沾取滲出液。在淋巴結(jié)取材，則先用針頭穿入淋巴結(jié)，注入少量生理鹽水，再吸取少量淋巴液。取材后應(yīng)立即送檢。2、器材暗視野顯微鏡3、操作先用高倍鏡尋找，再轉(zhuǎn)換為油鏡觀察。在鏡下找到小而纖細(xì)，呈緊密規(guī)則的螺旋及特征性的螺旋狀運動即可確診。（二）非特異性梅毒螺旋體試驗非特異性梅毒螺旋體試驗包括性病研究實驗室試驗（venereal disease research laboratory test，VDRL），不加熱血清反應(yīng)素試驗（unheated serum reagin test,USR）和快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗（rapid plasma reagin test,RPR）。其原理是梅毒螺旋體可使被破壞的組織細(xì)胞釋放類脂樣物質(zhì)，螺旋體自身釋放亦產(chǎn)生類脂及脂蛋白。這些物質(zhì)刺激機體產(chǎn)生抗體（IgG或IgM）。這些抗體可與從牛心中提出的心磷脂發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。由于非梅毒螺旋體感染引起的各種急性或慢性組織損傷也可產(chǎn)生類似的抗體，所以這種反應(yīng)是非特異性的，適合用于篩選實驗。下面簡介RPR試驗原理：將標(biāo)準(zhǔn)的心磷脂抗原吸附在特制的活性碳粒上，這種碳?？乖c患者血清混合在一起后，可以與血清中抗心磷脂抗體起反應(yīng)在白色紙卡上形成肉眼可見的黑色凝集顆粒。試劑：RPR試劑盒（試劑公司提供）方法：1）將待檢血清及試劑用前放室溫平衡（23-29），凍干陽性對照血清應(yīng)在試劑前5分鐘用0.2ml生理鹽水溶解。2）吸取待檢血清50l，在卡片圈內(nèi)，并將血清用牙簽或吸液嘴擴展到整個圓圈。3）將盒內(nèi)RPR抗原懸液輕輕搖勻，用專用滴管和針頭吸取抗原于每個血清圈內(nèi)垂直加一滴。4）振蕩或搖動8分鐘后，立即在明亮光線下用肉眼觀察結(jié)果。5）如有需要，陽性標(biāo)本可做1:2 1:4 1:8 1:16和1:32稀釋，按定性試驗方法作定量試驗。結(jié)果判定：陽性反應(yīng)：中等或大塊黑色凝集塊。弱陽性反應(yīng)：散在的小黑色凝集塊。陰性反應(yīng)：黑色均勻分散無凝集塊。必要時應(yīng)再做TPHA試驗確證。注意事項：1、本試劑應(yīng)保存于2-8，效期一年。2、如做半定量試驗，可將待檢血清用生理鹽水作倍比稀釋，然后按上述方法進(jìn)行試驗，以呈現(xiàn)出明顯凝集反應(yīng)的最高稀釋度作為該血清的凝集效價。3、本試驗系非特異性反應(yīng)，需再做TPHA確證。二期梅毒時，如出現(xiàn)弱反應(yīng)和可疑反應(yīng)，應(yīng)將血清稀釋，以排除“前帶現(xiàn)象”。五、TPHA梅毒螺旋體血凝試驗試驗原理：試驗血球為用螺旋體特異性抗原包被經(jīng)過醛化和鞣化的雞紅細(xì)胞，對照血球為沒有用上述抗原包被的經(jīng)過醛化和鞣化的雞紅細(xì)胞，如果是陽性標(biāo)本，當(dāng)和致敏的雞紅細(xì)胞混合后，抗體和抗原的結(jié)合會引起致敏血球的凝集，在血凝板底部形成凝集塊，如為陰性標(biāo)本 ，則血細(xì)胞在孔底形成致密的沉淀。操作方法：1. 在反應(yīng)板的第一排：每孔加25ul（1滴）稀釋液2. 在反應(yīng)板的第二排：每孔加100ul（4滴）稀釋液3. 在反應(yīng)板的第三排和第四排：每孔加25ul（1滴）稀釋液。