免疫組織化學(xué)技術(shù) 免疫組織化學(xué)技術(shù) 基本原理通過免疫學(xué)中抗原抗體結(jié)合反應(yīng) 用特異性抗體 單克隆或多克隆 檢測組織 細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原物質(zhì) 形成抗原 抗體復(fù)合物 此復(fù)合物上帶有事先標(biāo)記的標(biāo)記物 通過與標(biāo)記物相對應(yīng)的檢測系統(tǒng) 如酶底物顯色反應(yīng)可使之呈現(xiàn)某種顏色 從而可檢測組織細(xì)胞內(nèi)的抗原 以達(dá)到診斷 鑒別診斷和研究的目的 組織與細(xì)胞材料的制備免疫組織化學(xué)方法 組織與細(xì)胞材料的制備 組織石蠟切片制作組織冰凍切片制作細(xì)胞爬片制作細(xì)胞涂片制作 切片的制作 組織的固定組織石蠟包埋切片 目的 1 防止組織細(xì)胞的死后變化 防止自溶和腐敗 以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài) 2 使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì) 脂肪 糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì) 以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿 防止組織細(xì)胞的死后變化 防止自溶和腐敗 以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài) 3 使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率 造成光學(xué)上的差異 以便染色后易于鑒別和觀察 4 固定劑兼有硬化作用 使組織硬化 增加組織硬度 便于制片 5 防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu) 6 經(jīng)過固定的組織能對染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰 便于辨認(rèn) 組織材料的固定 固定液的選擇 1 甲醛固定液 10 福爾馬林 10 中性福爾馬林 10 中性緩沖福爾馬林 2 4 多聚甲醛固定液 3 BouinS液及改良BouinS液 4 ZenkerS液 5 ZamboniS液 6 PLP固定液 過碘酸 賴氨酸 多聚甲醛固定液 該固定劑較適合富含糖類組織 對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好 7 PLPD固定液取PLP固定液25ml 加入2 5 重鉻酸25ml 8 KanovskyS液 9 Methacarn固定液 對核內(nèi)抗原的保存效果較好 10 PEG液 11 0 4 對苯醌 12 碳二亞酰胺 戊二醛 ECG G 液 13 丙酮及醇類固定劑 固定時間 固定時間要視組織塊的厚薄 固定液的種類及濃度 溫度而定 原則上 組織塊大小與固定時間成正比 固定液的穿透力及濃度與固定時間成反比 大組織 75 乙醇30 120min 85 乙醇30 120min 95 醇 2h 95 乙醇 2h 95 乙醇 過夜 無水乙醇 30 60min 無水乙醇 30 60min 無水乙醇 60min 120min 二甲苯 和 各15min 可視觀察結(jié)果而定 石蠟 30min石蠟 1 2h 石蠟 2 3h 小組織 75 乙醇30min 85 乙醇30min 95 乙醇 1h 1h 過夜或2h 無水乙醇 和 各30min 二甲苯 15min 10min 10min 肉眼觀察 石蠟 30min 石蠟 30min 石蠟 1 2h 組織石蠟包埋 切片 載玻片的清潔 市售載玻片需經(jīng)清潔液泡24h 流水沖洗 系列乙醇浸泡 涼干涂膠 如需開展原位雜交 還需將玻片240 烤2h 切片粘合劑的使用 1 多聚賴氨酸 分子量300KD 0 5 濃度 2 APES試劑 3 氨基 丙基三氧基硅烷 干凈載玻片 丙酮5min 用鑷子夾住浸入APES試劑 1ml 50ml丙酮 1 3次 純丙酮洗二次 干燥玻片 用鋁箔包好 室溫或4 保存?zhèn)溆?3 鉻礬明膠液 鉻礬0 5g明膠5gH2O21000ml 4 甲醛明膠液 40 甲醛2 5ml明膠0 5gH2O2100ml 切片 石蠟切片 1 連續(xù)切片按序貼在玻片的下1 3 2 52 60 烤片18h 3 切片厚2 4 m 4 切片刀要快 5 編上號 6 切片可在4 保存數(shù)年冰凍切片 1 冰凍切片分固定和新鮮組織 固定組織需經(jīng)庶糖處理24h 冰凍切片 2 冰凍切片后需涼干后立即固定 3 冰凍切片固定后 80 保存?zhèn)溆?細(xì)胞爬片制作 將處理好的蓋玻片放入接種了細(xì)胞的培養(yǎng)瓶或六孔板內(nèi) 待細(xì)胞生長達(dá)到60 以上后取出玻片 用4 的多聚甲醛固定2h以上 可加甘油封存置于零下20度保存 細(xì)胞涂片制作 離心將細(xì)胞收集出來 用預(yù)冷的PBS洗2 3遍 最后用PBS將細(xì)胞重懸 吸取30 50ul 可根據(jù)細(xì)胞量調(diào)整 滴至處理過的載玻片上 然后涂抹均勻 待稍微風(fēng)干以后加4 多聚甲醛溶液覆蓋細(xì)胞 固定2 4小時 在細(xì)胞上加一層甘油放 20 保存 免疫組織化學(xué)方法 熒光標(biāo)記免疫組織化學(xué) 酶聯(lián)免疫組織化學(xué) 熒光標(biāo)記免疫組織化學(xué) 直接法間接法 酶聯(lián)免疫組織化學(xué) ABC法S P法 免疫組化二步法 二步法免疫組化染色步驟 二甲苯脫蠟 梯度酒精置換二甲苯PBS沖洗3次 每次3分鐘根據(jù)每一種抗體的要求 對組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)0 3 過氧化氫甲醇液阻斷20分鐘 以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性PBS沖洗 浸泡5分鐘 3次正常山羊血清室溫封閉10分鐘 甩去血清 加入適當(dāng)稀釋的一抗 37 孵育60分鐘或4 過夜PBS沖洗 浸泡5分鐘 3次滴加多聚螯合物 37 孵育30分鐘PBS沖洗 浸泡5分鐘 3次新鮮配置酶底物顯色液DAB顯色3 10分鐘流水沖洗蘇木素復(fù)染 脫水 透明 封片 顯微鏡觀察拍照IPP軟件分析光密度 抗原修復(fù)方法 真空負(fù)壓抗原修復(fù)法 切片脫蠟至水 0 3 H2O2甲醇真空負(fù)壓處理5分鐘 自來水洗 蒸餾水洗 0 01M檸檬酸鹽緩沖液 PH6 0 真空負(fù)壓干燥箱預(yù)先調(diào)至95 真空負(fù)壓處理10分鐘 待修復(fù)注降至室溫的一 PBS洗3次 隨后按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色 微波輻射抗原修復(fù)法 切片脫蠟至水 0 3 H2O2甲醇處理10分鐘 自來水洗 蒸餾水洗 0 01M檸檬酸鹽緩沖液 PH6 0 于微波爐內(nèi)微波輻射10分鐘 如檢測Er和Pr則需要20輻射分鐘左右 待修復(fù)液降至室溫后 PBS洗3次 隨后按選好的免疫組織化學(xué)的染色方法進(jìn)行染色 高壓抗原修復(fù)法 切片脫蠟至水 0 3 H2O2甲醇處理切片10分鐘 自來水洗 蒸餾水洗 切片放入抗原修復(fù)液中 邊同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰 蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)1 4分鐘 待修復(fù)液恢復(fù)至室溫后 PBS洗3次 隨后按選好的免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色 隔水熱抗原修復(fù)法 切片脫蠟至水 0 3 H2O2甲醇處理切片10分鐘 自來水洗 蒸餾水洗 切片放入0 01M檸檬酸鹽緩沖液 PH0 6 中 邊同容器一起放入水溶鍋中加熱 其間應(yīng)不斷用溫度計測其溫度 待抗原修復(fù)液的溫度達(dá)到有效溫度后 92 即開始計時 持續(xù)40分鐘 待抗原修復(fù)液恢復(fù)至室溫后 PBS洗3次 隨后按選定好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色 電爐加熱抗原修復(fù)法 切片脫蠟至水 0 3 H2O2甲醇處理切片10分鐘 自來水洗 蒸餾水洗 將切片放入抗原修復(fù)液中于電爐上加熱 不時用溫度計測量溫度 當(dāng)達(dá)92 后 即可拔離電源 當(dāng)溫度低于92 時 再插上電源 如此反復(fù)持續(xù)至10分鐘左右 待抗原修復(fù)液降至室溫后 PBS洗3次 隨后按選定的免疫組化染色方法進(jìn)行染色 胃蛋白酶消化法 切片脫蠟至水 0 3 H2O2甲醇處理切片10分鐘 自來水洗 蒸餾水洗 PBS洗3次 1分鐘 次 滴上配制好或商品化的胃蛋白酶 處理切片20分鐘左右 PBS沖洗3次 2分鐘 次 后按選擇好的免疫組化該法進(jìn)行染色 胰蛋白酶消化法 切片脫蠟至水 0 3 H2O2甲醇處理切片10分鐘 自來水洗 蒸餾水洗 PBS洗3次 1分鐘 次 滴上自配的或商品化的胰蛋白酶 處理切片20分鐘左右 PBS洗3次 2分鐘 次 后按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色 注意事項 一 抗體的保存濃縮抗體 有效期內(nèi) 只需放在4 冰箱內(nèi) 保存時間可達(dá)1 3年 即用型抗體 理論上在4 冰箱內(nèi)可保存半年左右 PBS或抗體稀釋液稀釋的抗體 一般只可放置1 2個月 二 出現(xiàn)假陽性的原因組織切片質(zhì)量不佳 造成假象 如刀痕裂縫邊緣的組織著色過深 不能作為判斷陽性的依據(jù) 出血和壞死 紅細(xì)胞的內(nèi)源性過氧化物酶 壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性過氧化物