菌種保藏的重要性 菌種保藏是微生物檢驗工作中的一項常規(guī)技術(shù)科學(xué)保藏和管理關(guān)系到檢驗結(jié)果的正確性 菌種的 2015版指導(dǎo)原則 原則 應(yīng)來自認(rèn)可的國內(nèi)或國外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株 或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株 使用菌種來源 菌種編號2015版CMCC 中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心CMCC F 真菌CMCC B 細(xì)菌協(xié)調(diào)案ATCC美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心NCIMB英國食品工業(yè)與海洋菌種保藏中心NBRC日本技術(shù)評價研究所生物資源中心CIP法國巴斯德研究所菌種保藏中心 菌種保藏的中心任務(wù) 廣泛收集 選擇最適宜的保藏方法 保持菌種的生物學(xué)特性 常用菌種的保藏 菌種保藏的原則根據(jù)微生物菌種的生理 生化特性 盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度 處于休眠狀態(tài) 以減低菌種的變異率 常用菌種的保藏 2015指導(dǎo)原則 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代 從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代 采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存 以保證試驗菌株的生物學(xué)特性 冷凍保藏 在低溫下保藏 一般在低于 30 或 70 是有效的長期儲藏方法 凍干法保藏 是一種長期保藏菌種的方法法 冷藏 在2 8 保藏 是短期儲藏方法 菌種的保藏 低溫 干燥 缺氧 缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都可以抑制微生物的代謝和生長繁殖 因此低溫 干燥和真空是菌種保藏的重要手段 菌種的保藏 工作菌株不可代替標(biāo)準(zhǔn)菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株的商業(yè)衍生物僅可用作工作菌株 標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株 冷凍菌株一旦解凍轉(zhuǎn)種制備工作菌株后 不得重新冷凍或再次使用 菌種的保藏 不同的微生物 應(yīng)根據(jù)其生物特征來選擇最適宜的保藏方法 挑選特征典型的純菌菌落 確定保藏的合適菌體形態(tài) 選擇最適宜的方法保藏 定期檢查 菌種的保藏 瓊脂斜面低溫保藏法 液體冷凍保藏法 制備方法1 蛋白胨 甘油 滅菌 接種 培養(yǎng)18 24小時 保存條件 80 可保存數(shù)年 菌種的傳代和使用 工作菌種傳代次數(shù)不得超過5代 1代是指將活的培養(yǎng)物接種到新鮮培養(yǎng)基中 任何亞培養(yǎng)的形式均被認(rèn)為是轉(zhuǎn)種或傳代一次 基本操作技術(shù) 細(xì)菌的接種 分離和培養(yǎng)接種 將微生物的培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)基上的一種操作技術(shù) 接種 斜面培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基 分離技術(shù) 將細(xì)菌分離成單個細(xì)胞 使其獨立分裂繁殖形成單個菌落的操作技術(shù) 方法平板劃線 分段劃線 連續(xù)劃線涂布分離法傾注分離法等 培養(yǎng) 接種后的培養(yǎng)基 根據(jù)不同微生物生長條件的要求 培養(yǎng)基放在適宜微生物生長的環(huán)境中溫度 濕度 氧氣等 使其生長繁殖的過程 需氣菌培養(yǎng)法 厭氧培養(yǎng)法嗜溫性微生物 15 45 嗜熱性微生物 45 以上 嗜冷性微生物 15 以下 培養(yǎng)后微生物的生長判斷固體培養(yǎng)基有菌落生長或沿穿刺線擴(kuò)散生長 液體培養(yǎng)基渾濁 菌膜 沉淀等 菌種的傳代和使用 凍干菌種 0代 增菌培養(yǎng)蘇醒 1代 增菌培養(yǎng)復(fù)壯 2代 分裝冷凍保存 斜面培養(yǎng)基劃線傳代 3代 使用 分裝冷凍保存 斜面培養(yǎng)基劃線傳代 4代 使用 分裝冷凍保存 斜面培養(yǎng)基劃線傳代 5代 使用 分裝冷凍保存 斜面培養(yǎng)物1 3環(huán) 適宜液體培養(yǎng)基5 10ml 培養(yǎng)18 24h取適當(dāng)量 用滅菌生理鹽水稀釋后比濁 或預(yù)實驗 按比濁結(jié)果或預(yù)實驗將菌液稀釋到相應(yīng)倍數(shù) 平板計數(shù) 取上述稀釋液1ml加入平皿中加入規(guī)定培養(yǎng)基 培養(yǎng) 點計菌落數(shù) 實驗 陽性對照平板計數(shù)也可和試驗同時進(jìn)行 菌液的制備和使用 菌液制備用培養(yǎng)基 2015修訂內(nèi)容 菌液制備用培養(yǎng)基 2015修訂內(nèi)容 菌液制備用稀釋液 2015修定內(nèi)容 菌液貯存 2015修定內(nèi)容 修訂前修訂后菌液制備后若在室溫下放置 應(yīng)在2小時內(nèi)使用 若保存在2 8 可在24小時內(nèi)使用 穩(wěn)定的黑曲孢子懸液可保存在2 8 在驗證過的貯存期內(nèi)使用 菌種的鑒定與復(fù)壯 菌種的衰退由自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象 控制菌種的衰退方法 控制傳代次數(shù)降低突變幾率 采用良好的傳代保藏方法 創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)條件 用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代 采用有效的保藏方法定期檢查 菌種的復(fù)壯采用分離純化的方法 形態(tài)特征 生理生化特征 代謝產(chǎn)物 血清學(xué)等一系列試驗鑒定 證明復(fù)壯后的菌種與原種完全一致 菌種的鑒定與復(fù)壯 微生物鑒定系統(tǒng)是基于不同的分析方法 其局限性與方法和數(shù)據(jù)庫的局限性有關(guān) 微生物鑒定需通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)微生物如模式菌株的特征 基因型和 或表型 相匹配來完成 否則將得不到鑒定的結(jié)果 明確鑒定系統(tǒng)局限性和需要的鑒定水平 屬 種 型 菌種的鑒定 鑒定方法傳統(tǒng)方法增菌 分離 純菌 確認(rèn)試驗 菌落形態(tài) 革蘭染色 顯微鏡下菌體形態(tài) 生化特性及血清學(xué)檢查 依據(jù)伯杰士細(xì)菌鑒定手冊重要的生化試驗氧化酶試驗革蘭氏陰性菌 非發(fā)酵的棒狀細(xì)菌 腸道菌 過氧化氫酶試驗葡萄球菌 鏈球菌 凝固酶試驗 葡萄球菌可能為致病菌以上信息對大部分類型的生產(chǎn)環(huán)境中的微生物的調(diào)查及日常分析 已可提供足夠的信息 2015版 指導(dǎo)原則 菌種的鑒定 純菌的分離微生物的表型表型微生物鑒定通過長時間培養(yǎng)對微生物細(xì)胞的恢復(fù) 增殖是有限的 如有些環(huán)境中的微生物在普通微生物增殖培養(yǎng)基不能恢復(fù) 此外 分離出的受損的培養(yǎng)物可能不能完整表達(dá)其表型屬性 基因型微生物鑒定 菌種的鑒定 微生物分類中使用的表型特征分類特征培養(yǎng)物菌落形態(tài)學(xué) 菌落顏色 形狀 大小和產(chǎn)色素形態(tài)學(xué)細(xì)胞形態(tài)學(xué) 細(xì)胞大小 細(xì)胞形狀 鞭毛類型 內(nèi)容物 革蘭氏染色 芽孢和抗酸染色 孢子形成模式生理學(xué)氧氣耐受性 pH范圍 最適溫度和范圍 耐鹽性生化反應(yīng)碳源的利用 碳水化合物的氧化或發(fā)酵 酶的模式抑制性膽鹽耐受性 抗生素敏感性 染料耐受性血清學(xué)凝集反應(yīng) 熒光抗體化學(xué)分類脂肪酸構(gòu)成 微生物毒素 全細(xì)胞組分生態(tài)學(xué)微生物來源 菌種的鑒定 保藏環(huán)境冷藏或冷凍保存 專用的冰箱 上鎖 專人保