,2016.11.19,G蛋白及其 受體的研究進(jìn)展,講述步驟,01,GPCR的概念,2.由，三個(gè)不同亞基組成。激素與激素受體合誘導(dǎo)GTP跟G蛋白結(jié)合的GDP進(jìn)行交換結(jié)果激活位于信號(hào)傳導(dǎo)途徑中下游的腺苷酸環(huán)化酶。3. G蛋白將細(xì)胞外的第一信使腎上腺素等激素和細(xì)胞內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶催化的腺苷酸環(huán)化生成的第二信使cAMP聯(lián)系起來(lái)。具有內(nèi)源GTP酶活性。,1. G蛋白是指能與鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合，具有GTP水解酶活性的一類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的重要蛋白質(zhì),GPCR分類,1,2,3,其中亞單位在多數(shù)G蛋白中 都非常類似，分子量36kDa左右。亞單位分子量在8-11kDa之間，除Gt外，大多數(shù)G蛋白的亞單位都是相同的。,兩個(gè)亞單位的不同可以將蛋白分為Gs、Gi、Go、Gq、G12及Gt等六類。這些不同類型的G蛋白在信號(hào)傳遞過(guò)程各種發(fā)揮不同的作用,GPCRs的概念,02,1. G蛋白偶聯(lián)受體,是一大類膜蛋白受體的統(tǒng)稱。2.這類受體的共同點(diǎn)是其立體結(jié)構(gòu)中都有七個(gè)跨膜螺旋，且其肽鏈的C端和連接第5和第6個(gè)跨膜螺旋的胞內(nèi)環(huán)上都有G蛋白（鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白）的結(jié)合位點(diǎn)。3.目前為止，研究顯示G蛋白偶聯(lián)受體只見(jiàn)于真核生物之中，而 且參與了很多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。,GPCRs的概念,GPCRs的結(jié)構(gòu)與分類,03,GPCRs的結(jié)構(gòu),GPCRs的分類,04,GPCRGPCRs研究進(jìn)展,GPCR被發(fā)現(xiàn)的歷史,Lefkowitz通過(guò)同位素標(biāo)記的配體結(jié)合等實(shí)驗(yàn)提出配體-受體-效應(yīng)器相互作用的三級(jí)復(fù)合物模型。,Lefkowitz 2011年第一次在原子分辨率闡明了GPCR參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制,3 GPCR工作機(jī)制研究,方法,隨后Lefkowitz實(shí)驗(yàn)室克隆的GPCR,標(biāo)記并分離純化擴(kuò)散型配體的GPCR,諾貝爾獎(jiǎng)得主,諾貝爾獎(jiǎng)得主羅伯特萊夫科維茨,1,2,1,2,b2腎上腺素能受體,異丙腎上腺素,Lefkowitz,腎上腺素受體擴(kuò)散型配體的GPCR的基因克隆,基于這一推論，Lefkowitz，Kobilka等人很快成功克隆了編碼人類b2腎上腺素受體蛋白的cDNA，編碼人類b1腎上腺素受體、人類血小板2腎上腺素受體、5-羥色胺受體以及第一個(gè)孤兒受體等在內(nèi)的一系列受體的基因,工作中得到的信息和技術(shù)也幫助了嗅覺(jué)受體這一超家族的發(fā)現(xiàn)和克隆,諾貝爾獎(jiǎng)得主布萊恩-科比爾卡,2001,2007,2007年，Kobilka利用T4溶菌酶融合蛋白方法解析了第一個(gè)非視紫紅質(zhì)GPCR晶體結(jié)構(gòu)：人beta2腎上腺素受體，他還獨(dú)立地通過(guò)抗體片段介導(dǎo)法解析了人beta2腎上腺素受體的結(jié)構(gòu)。,GPCR工作機(jī)制研究,1.中國(guó)科學(xué)院生物物理所的王江云課題組和山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院的孫金課題組于2015年9月8號(hào)在權(quán)威期刊Nature communications上發(fā)表了研究論文，報(bào)道了他們應(yīng)用最新的非天然氨基酸編碼技術(shù)，揭示了G蛋白偶聯(lián)受體重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的詳細(xì)過(guò)程,研究GPCR,GPCRs的新發(fā)現(xiàn),2. 研究 GPCRs 與 G 蛋白相互作用的傳統(tǒng)技術(shù)包 括免疫共沉淀、免疫共定位、GST 融合蛋白沉降等， 這些技術(shù)自身存在一定的不足，無(wú)法滿足在生理?xiàng)l 件下檢測(cè)受體或蛋白的相互作用。 而B(niǎo)RET、TIRF 及 FRET 等相關(guān)技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題，它們 可以實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、連續(xù)地監(jiān)測(cè)生理狀態(tài)下受體-受體、 受體 -G 蛋白間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系，并且不會(huì)對(duì)細(xì)胞造 成損傷，這為受體與 G 蛋白相互作用的動(dòng)力學(xué)研究 提供了更加便利、準(zhǔn)確的研究手段。,研究GPCR,GPCRs的新發(fā)現(xiàn),1,2,3,獲得第一 個(gè)人 GPCR 的精細(xì)結(jié)構(gòu)，也是第 2 個(gè) GPCR 的高 分辨率晶體結(jié)構(gòu)，該結(jié)果被 Science 雜志評(píng)為 2007 年十大科技進(jìn)展之一.,2008 年 5 月 Midori Murakami1 和 Tsutomu Kouyama 等報(bào)道了從烏賊視細(xì)胞中分離得到的 Rhodopsin 的精細(xì)結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá) 3.7 A，它與牛 Rhodopsin 結(jié) 構(gòu) 基 本 相 似,主 要 區(qū) 別 在 于 牛 Rhodopsin 的 N 末 端 為 無(wú) 規(guī) 卷 曲 ， 而 烏 賊 Rhodopsin 的 N 末端形成了規(guī)則的 螺旋結(jié)構(gòu)， 這可能與其生活的海洋環(huán)境有密切關(guān)系.,2008 年 7 月 Tony Warne 等采用缺失突變 的方法，將火雞 1 腎上腺素受體中不穩(wěn)定的氨基 酸進(jìn)行點(diǎn)突變，,同時(shí)將較長(zhǎng)的 N 末端、C 末端以 及胞內(nèi) loop 進(jìn)行缺失突變，降低其柔性，增加了 穩(wěn)定性，最終獲得了該突變體 2.7 A的精細(xì)結(jié)構(gòu).,研究GPCR,GPCRs的新發(fā)現(xiàn),1,2,1）膽酸鈉；2）飽和 劑量的受體拮抗劑 ZM241385；3） 膽固醇琥珀酸 單酯. 最終獲得了該突變體（A2A-T4L-C）與拮 抗劑 ZM241385 復(fù)合體 2.6 魡 的晶體結(jié)構(gòu)，這也 是第二個(gè)人 GPCR 的高分辨率晶體結(jié)構(gòu).,除了上述兩個(gè)天然分離的 Rhodopsin 的結(jié)構(gòu) 外，另外 3 個(gè)重組表達(dá)得到的 GPCR 晶體結(jié)構(gòu) （見(jiàn)表 ）也為我們提供了兩條可能獲得 GPCR 高 分辨率晶體結(jié)構(gòu)的方法，即融合蛋白法和缺失突 變法.,盡管二者都對(duì)原始蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造， 這樣獲得的晶體結(jié)構(gòu)可能會(huì)與其實(shí)際結(jié)構(gòu)有一 定的差別，但也為我們更多了解該蛋白的結(jié)構(gòu)與 功能關(guān)系提供了重要的參考.,1.近年來(lái)，有些學(xué)者還提出了另外一種可能獲 得高質(zhì)量膜蛋白晶體的方法：盒式突變法. 即采 用漸進(jìn)式的多位點(diǎn)突變技術(shù)，以親水殘基系統(tǒng)性 地替換 GPCR 蛋白跨膜螺旋表面的多個(gè)疏水殘