密級： 論文編號： 中國農業(yè)科學院 碩士學位論文 轉基因水稻中的功能分析 I I 摘 要 在長期的進化過程中植物形成多種適應機制以應答不同的生物脅迫和非生物脅迫，其中轉錄因子激活或者抑制基因的表達是植物適應逆境脅迫的重要方式之一。大量研究表明乙烯反應因子(是植物特有的一類轉錄因子，它在植物生長發(fā)育、逆境脅迫應答等方面具有重要的調控功能。本實驗室 以 用酵母單雜交系統(tǒng)從番茄 到 轉錄因子家族的 一個新 成員 煙草中過表達 明顯提高煙草的耐旱性、耐鹽性和 敏感性，表明 一種多功能 錄因子，深入探討 控下游功能基因的表達是剖析 控植物非生物脅迫抗性機理的關鍵。鑒于水稻在我國農業(yè)生產(chǎn)和糧食安全中的的重要地位以及其相對清楚的生物信息基礎，本實驗擬通過建立轉 稻，在明確 植物非生物脅迫中的功能的基礎上，闡明 能參與的信號調控途徑，為分子設計育種提供優(yōu)良的抗性基因和材料。 首先，通過農桿菌介導 方法獲得并鑒定了 11 個 稻轉基因株系，同時進行繁殖，用轉基因水稻進行非生物脅迫下的生理功能鑒定，即對六日齡幼苗分別進行干旱和 理。實驗表明 夠提高轉基因水稻的抗旱性和滲透脅迫抗性，在 25理 30，野生型水稻 (尖發(fā)生明顯萎蔫，轉 因水稻株系 (生萎蔫的程度較輕，并且轉基因株系根部明顯比野生型發(fā)達 ;在恢復培養(yǎng) 20 天后， 活率為 活率為 活率達到 100。 在干旱處理 下 , 野生型水稻葉片發(fā)生明顯萎蔫，葉片向心卷曲，轉基因株系只有少數(shù)葉片萎蔫。研究發(fā)現(xiàn)， 在正常生長狀態(tài)下，轉基因水稻的脯氨酸含量、胞質總蛋白等滲透調節(jié)物質的含量明顯高于野生型，表明 表達可能通過改變水稻體內滲透調節(jié)物質提高植物非生物脅迫的抗性。我們進一步從從分子水平剖析了高轉基因水稻的非生物脅迫抗性的可能途徑。即通過生物信息分析，從已發(fā)表的文章中挑選啟動子中包含 者 式作用元件的功能基因 ，并以這些基因特異序列部分 設計引物 , 采取 方法檢測這些功能基 因的表達。我們的研究表明轉基因植株中 滲透脅迫相關基因 因的表達量明顯增多 ,并且在氧化脅迫中發(fā)揮重要功能的 因的表達量也明顯高于野生型，說明 過提高了一些相關基因或者下游基因的大量表達從而提高轉基因水稻的非生物脅迫抗性。 關鍵詞 轉基因水稻 ， 非生物脅迫 ， a of to in of to be or of of by as of in BA of is a on be to in of of in a is to in to we NA of 2 5EG of is in is in 0 of in 100% in of of in in to to In to of we of RE in in of of to 文縮略表 英文縮寫 英文名稱 中文名稱 脫落酸 BA 落酸應答元件 性亮氨酸拉鏈 合因子 補 溫調控 嘧啶重復序列 旱應答元件 旱應答元件結合蛋白 烯應答元件 烯應答元件結合因子 ET 烯 JA 莉酸 A- 莉酸激發(fā)子應答元件 溫應答元件 莉酸甲酯 S 鹽 酯酰 作蛋白 rd to 旱應答 分鐘轉速 楊酸應答元件 番茄乙烯應答元件結合因子 1 煙草脅迫誘導基因 1 錄 第一章 緒論 . 1 物對逆境脅迫的應答反應 . 1 物激素 . 1 錄因子在植物逆境信號轉導過程的重要作用 . 3 錄因子的研究進展 . 7 錄因子的結構特征和分類 . 7 錄因子在植物脅迫應答中的作用 . 9 究目的和意義 . 10 第二章 水稻轉化 . 12 驗材料與方法 . 12 驗材料 . 12 驗方法 . 15 驗結果 . 23 化載體構建結果 . 23 性轉基因株系 . 24 基因水稻的繁殖結果 . 26 第三章 過表達 高了轉基因水稻的非生物脅迫抗性 . 27 驗材料與方法 . 27 驗材料 . 27 驗方法 . 27 驗結果 . 27 表達 高了轉基因水稻的抗旱性 . 27 表達 高了轉基因水稻的滲透脅迫抗性 . 28 結 . 29 第四章 生理生化指標測定 . 30 質總蛋白含量的測定 . 30 驗原理 . 30 驗材料與方法 . 30 驗結果 . 31 氨酸含量的測定 . 31 驗原理 . 31 驗材料與方法 . 32 驗結果 . 32 溶性糖含量的測定 . 33 V 驗原理 . 33 驗材料與方法 . 34 驗結果 . 34 結 . 35 第五章 過表達 高了水稻脅迫相關基因的表達 . 36 驗材料與方法 . 36 驗材料 . 36 驗方法 . 36 驗結果 . 37 表達 高了 平的表達 . 37 表達 高了 表達 . 37 結 . 38 第六章 結論 . 39 參考文獻 . 40 致 謝 . 47 作 者 簡 歷 . 48 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒 論 1 第一章 緒論 物對逆境脅迫的應答反應 植物 外界的 生長環(huán)境 具有 動態(tài)性， 植物對生長環(huán)境的依賴性 要求植物迅速應答和有效適應外界環(huán)境條件的改變 ， 長期的進化使植物形成一系列的耐受機制 ， 植物的生理生化、分子水平和細胞 水平都會根據(jù)植物所處的外界環(huán)境作出 相應 的變化。 當植物受到外界環(huán)境脅迫如低溫、干旱、高鹽和病害等 脅迫 后 ，首先，植物感知脅迫信號， 緊接著產(chǎn)生第二信使，第二信使又引起胞內鈣離子水平的改變，這種改變經(jīng)常會引起一個蛋白磷酸化的級聯(lián)反應，最終引起目的蛋白表達或者由轉錄因子控制的特定種類的基因表達。這些基因的表達產(chǎn)物有的直接參與保護細胞，還有一些參與了內源信號分子（如植物激素）的產(chǎn)生，這些信號分子又會引起新一輪的信號轉導 (et 2002)， 這些信號轉導途徑最終使植物作出生理的改變（比如氣孔關閉）、基 因表達的改變、分子修飾以及細胞程序的改變。在對從信號感知開始到最終的應答反應的信號轉導途徑的研究發(fā)現(xiàn)，植物對逆境脅迫的應答反應是一個復雜的網(wǎng)絡調控，不同的脅迫應答途徑相互交錯，同時不同的脅迫應答途徑又具有特異性，從而保證了植物生命活動的高效有序的進行。在這些信號轉導過程中植物激素、轉錄因子、以及轉錄因子與順式作用元件的特異性結合發(fā)揮了重要的作用。 物激素 植物在受到環(huán)境脅迫時會合成一種或幾種特異的植物激素，通過這些植物激素調節(jié)相關基因的表達，改變植物的代謝方式，甚至調控植物的發(fā)育進程以適應外界環(huán) 境條件。 例如 在植物受到干旱或者鹽脅迫時，脫落酸（ 含量就會明顯增加 ( 2002); 用 乙烯處理黑暗中萌發(fā)的種子 能夠引發(fā)典型的“三重反應”。下面將對這兩種多功能激素簡單介紹一下： 落酸 脫落酸（ 調節(jié)植物生長發(fā)育和脅迫應答的一種多功能激素。它促進種子休眠、氣孔關閉、以及提高植物抗逆性如抗脫水、干旱、高鹽、低溫及抗病蟲害和機械損傷等多方面生理功能 (et 2002; et 1994; et 1994; et 1992)。 另外， 植物的非生物脅迫應答中起著更重要的作用，它通過信號轉導誘導特定的轉錄因子表達，這些轉錄因子結合 者 式作用元件參與植物的非生物脅迫應答 (et 2003; et 2005; 國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒 論 2 2004)。 烯 科學家們很早就開始了 對 乙烯在植物體內功能的研究，人們發(fā)現(xiàn) 用 乙烯處理黑暗中萌發(fā)的種子后 ， 植物形態(tài)發(fā)生顯 著的變化 ，表現(xiàn)出頂端彎曲，胚軸和根的生長受到抑制等形態(tài)特征，即“ 三重反應（ ”（ 1995） ， 這使人們認識到乙烯可能在植物的生長發(fā)育方面行使重要功能。后來 的研究發(fā)現(xiàn) ,乙烯作為植物特有的一種激素影響植物發(fā)育的各個階段，包括種子萌發(fā)、花和果實的凋亡、葉片的脫落、果實的成熟、根瘤的形成、細胞的程序性死亡，同時，乙烯在植物生物脅迫和非生物脅迫應答方面起關鍵性的作用（ et 1998）。為深入研究乙烯信號途徑轉導的分子機制 ， 人們利用“三重反應”現(xiàn)象，通過對許多 擬南芥的乙烯 應答 突變體 以及乙烯信號轉導途徑中重要的基因的研究，模式植物擬南芥中乙烯信號轉導途徑的輪廓已日漸明了， 2004 年就對乙烯信號傳導途徑的分子機制的研究進展做了很好的總結 : 圖 1烯信號轉導模式圖（ et 2004） of et 2004） 如圖 1示， 乙烯信號 的 受體 ，包括 ，是 一組類似細菌和酵母的組氨酸雙組分蛋白激酶的跨膜受體蛋白 (et 2001)。 位于乙烯受中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒 論 3 體蛋白下游的 是一個類似 的蛋白激酶 烯受體 和 是乙烯信號轉導途徑的負調控因子 (et 1998; et 2003)。在沒有乙烯存在時 ，乙烯 受體激活下游的 過磷酸激酶途徑（ 使 下游的 乙烯信號傳導途徑成員處于 失活 狀態(tài) ， 從而 關閉乙烯信號途徑； 在有 乙烯存在時 ， 乙烯 通過與乙烯 受體 的 結合， 使 下游 的 去抑制下游傳導途徑的能力 ，乙烯信號途徑 處于激活狀態(tài) (et 2003)。 近來的一些發(fā)現(xiàn)，一些逆境條件可以以不依賴乙烯受體的方式激活植物的乙烯信號途徑， 如 ： 鹽 脅迫 、病 害和水楊酸 信號可以通過 徑 調控 乙烯信號途徑 （ et 2003; et 2003）。 在乙烯信號途徑中， 于 下游， 是乙烯信號 途徑中的第一個轉錄因子， 在 調 控 其它下游 轉錄因子 和 功能基因表達 過程中具有重要作用 (et 1997; et 1998)。 對擬南芥 研究發(fā)現(xiàn)， 穩(wěn)定性受到與 泛素降解 系統(tǒng)相關的 白 控 （ et 2003） ，表明了 泛素降解 系統(tǒng)與乙烯信號傳導途徑有密切關系 。 過形成同源二聚體結合到 類轉錄因子 動子中 的順式元件 而 激活 表達。 錄因子調控著植物抗病相關基因 因和調控植物形態(tài)發(fā)育基因 的 表達 (et 1999; et 2005)。 錄因子在植物逆境信號轉導過程的重要作用 如圖 1示 ,植物通過乙烯信號途徑激活 錄因子 ,錄因子又通過特異性與 合 ,啟動脅迫應答基因的表達 (et 2004)。正如這樣 ,植物在生長發(fā)育過程中感受外界環(huán)境刺激后，通過一系列信號轉導激發(fā)反式作用因子 (轉錄因子 )，而反式作用因子與順式作用元 件結合后，又激活 合酶轉錄復合物，從而啟動基因的轉錄表達，這些基因產(chǎn)物行使不同的功能，最終完成植物對外界信號在生理生化等方面的脅迫應答反應。 在植物的脅迫應答中不同的脅迫信號可以通過多信號途徑的相互作用形成一個迅速、有效、協(xié)調的信號網(wǎng)絡來調節(jié)植物的脅迫應答。在這個過程中轉錄因子與順式作用元件的識別起到重要的作用 (et 2001； et 2003; et 2003)。 錄因子 者寡核苷酸芯片技術為研究植物 非生物脅迫下或 理后植物的基因表達分析提供了非常強有力的工具，近幾年來擬南芥非生物脅迫處理下基因表達分析發(fā)現(xiàn)，在大量脅迫誘導的基因中有許多轉錄因子，說明各種轉錄調控機制在干旱、冷、高鹽等脅迫信號轉導中發(fā)揮重要的作用。 轉錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的 合蛋白，通過它們之間以及與其他相關蛋白之間的相互作用，激活或抑制基因的轉錄，調節(jié)脅迫相關基因的表達。從蛋白質結構分析，轉錄因子一般由 合區(qū)、轉錄調控區(qū)（包括激活區(qū)和抑制區(qū)）、寡聚化位點以 及核定位信號這 4 個功能區(qū)域與中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒 論 4 啟動子順式作用元件或與其他轉錄因子的功能區(qū)域相互作用來調控基因的轉錄表達。典型的轉錄因子一般只有一個 合區(qū)，但有的轉錄因子如擬南芥的 水稻的 含兩個 合區(qū)。少數(shù)轉錄因子不含 合區(qū)或轉錄調控區(qū)，它們通過與含有上述功能域的轉錄因子相互作用對基因轉錄進行調控。在植物中存在大量編碼轉錄因子的基因， 對已完成測序的擬南芥和水稻的基因組進行分析后發(fā)現(xiàn)，兩種模式植物中都有約 1300編碼轉錄因子的基因（ et 2000; et 2002; et 2004）。根據(jù)其 以將它們分為幾個轉錄因子家族 ，轉錄因子家族的名稱一般也與其 植物中，與應答環(huán)境脅迫相關的轉錄因子家族主要有 （ et 2002; et 2002; et 2002; et 2003; et 2004; et 2004; et 2005; 2005; et 2005）。 這些轉錄因子能夠單獨或者協(xié)同調控脅迫誘導基因的表達，形成基因表達調控網(wǎng)絡，在植物的抗逆機制中發(fā)揮重要的作用。以下簡單介紹一下： 族包括 大類轉錄因子 ,它們分別能夠與 G 盒順式作用元件結合。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 式作用元件存在于谷胱甘肽 S轉移酶的啟動子區(qū)以及花椰菜病毒的 35S 啟動子區(qū)，而且與水楊酸和茉莉素信號途徑有關。如擬南芥中的 一些 族成員能夠與 互作用，而后者是水楊酸信號途徑的重要調節(jié)蛋白（ et 002） 。 主要通過與鄰近的作用元件協(xié)同作用以控制不同功能基因（包括抗病相關基因）的表達。 白是新近發(fā)現(xiàn)的一類植物轉錄因子家族 ， 白包含一個或者兩個N 端包含七肽 60 個氨基酸的調控子和 白能夠特異性結合順式作用元件 心序列為 (C/T)） ，進一步 研究表明， 能特異性結合糖應答元件 在擬南芥和水稻中分別有 74 和90 個 員（ et 2004） ， 參與植物病原體 侵害應答和 機械傷害信號應答（ et 2000）。 在許多植物中都已說明 白參與了植物抗病機制 ， 例如，在擬南芥中 ， 夠被 酶級聯(lián)活化，并且 表達能夠減輕細菌和真菌侵染癥狀； 白能夠激活 答基因和抑制 答基因，說明了白可能是 的交織點 。此外 ， 白還可被多種非生物脅迫誘導表達（ et 2000），因此它很可能還參與各種非生物脅迫應答。 2, 族也是新近發(fā)現(xiàn)的一類植物轉錄因子家族，在擬南芥中有一百多個成員（ et 2000）。這些轉錄因子參與調節(jié)營養(yǎng)器官、花和胚的發(fā)育，側根的形成和生長素信號途徑，以及生物和非生物脅迫應答等（ et 2005） ，對白家族進行表達分析 ， 實驗結果表明 族也可能參與光應答 反應、細胞程序性死亡 ， 以及植物衰老。 族是最近發(fā)現(xiàn)的一個非常小的轉錄因子家族，在擬南芥中僅發(fā)現(xiàn)有三個成員（ et 2005）。它的一個顯著特點是優(yōu)先結合單鏈的順式作用元件，目前的研究結果僅顯示它與應答生物脅迫有關（ et 2000;et 2001）。 錄因子將在下文詳細介紹。 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒 論 5 式作用元件 脅迫應答和耐受基因可以根據(jù)它們產(chǎn)物的功能分 為兩大類：一類是 編碼 直接參與脅迫耐受的功能蛋白，如分子伴侶（ 蛋白，與滲透調節(jié)物合成相關的各種酶以及具有解毒作用的酶等；另一類是 編碼 參與脅迫信號轉導的各種蛋白，如蛋白激酶，轉錄因子以及參與磷脂代謝的酶等。對這些基因的啟動子區(qū)進行比較分析，最終分離和鑒定出了很多脅迫相關的順式作用元件 (et 2005)。順式作用元件指與靶基因處于同一條染色體起調控作用的 列，通常不編碼蛋白，位于基因的旁側序列或內含子中。轉錄因子特異性識別順式作用元件 ,這種特異性識別在植物的脅迫應答中發(fā)揮重要的作用，現(xiàn)在已經(jīng)確定了不少介導脅迫應答基因表達的應答組件，如： 楊酸應答組件）， 莉酸、激發(fā)子應答組件）， 守序列為： 等，其中， 曾稱之為 先被確定為大量煙草堿性 因（ 程相關基因）啟動子中的乙烯應答元件（ et 1995）。表 1 中歸納總結了與冷和滲透脅迫應答基因的順式作用元件，例如， 旱應答組件 /胞嘧啶重復序列）普遍存在于非生物脅迫相關基因的啟動子中； 落酸應答組件）多參與干旱和 應答反應 ( et 2005)； 在低溫誘導的甘藍型油菜的 因啟動子中發(fā)現(xiàn)了一種低溫誘導元件 件（ et 1996）。雖然這些順式作用元件的 組成各不相同，但它們具有一些共同特征：（ 1）在位于轉錄起始點上游 300，對基因表達起重要作用。（ 2）多個順式作用元件以組合形式協(xié)同性地激活或抑制轉錄。（ 3）與鄰近不同的順式作用元件協(xié)調作用，產(chǎn)生不同的效應。（ 4）不同的順式作用元件之間的偶聯(lián)，產(chǎn)生不同的效應，最終導致基因表達的多樣性（劉強 等， 2000）。 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒 論 6 表 1 滲透和冷脅迫應答基因的順式作用元件 in 順式作用元件 序列 結合順式作用元件的轉錄因子 基因 脅迫 旱 ,明 旱 ,旱 ,旱 ,旱 ,冷 旱 報道 旱 明 明 不同的 轉錄因子與基因啟動子序列的順式作用元件結合，在轉錄起始位點上游的 形成轉錄起始復合物，轉錄起始復合物進一步激活 合酶從而啟動脅迫應答基因的轉錄，在這一過程中，不同的轉錄因子與順式作用元件的相互作用在決定轉錄起始事件中起著關鍵性作用，同時也對植