福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 分類號(hào)： 單位代碼： 10389 密 級(jí)： 學(xué) 號(hào)： 1101737 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及影響因素的研究 學(xué) 科 門 類：理學(xué) 一級(jí)學(xué)科名稱：生物學(xué) 二級(jí)學(xué)科名稱：微生物學(xué) 研 究 方 向 ： 微生物應(yīng)用與基因工程 研 究 生： 指 導(dǎo) 教 師： 研究員 完 成 時(shí) 間：二 O 一二年一月 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 he of 2013 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 3 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學(xué)位（畢業(yè)）論文，是本 人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標(biāo)注和致謝中已作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同對(duì)本研究做出貢獻(xiàn)的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解福建農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位（畢業(yè)）論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱 ; 學(xué)校可以公布論文的全部或部分內(nèi) 容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權(quán)書。 不保密，本論文屬于不保密。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 指導(dǎo)教師親筆簽名： 日期 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 4 目錄 中文摘要 錄 第一章 緒論 1研究背景 2研究現(xiàn)狀 蟲 內(nèi)共生菌及其與寄主相互關(guān)系 研究 3研究方法與技術(shù) 6 S 因序列分析的應(yīng)用 時(shí)熒光定量 4本研究的目的和意義 5本研究的技術(shù)路線 第二章 柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)基的優(yōu)化和鑒定 1 引言 2材料與方法 篩選 6s 3結(jié)果與分析 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 5 6s 橘木虱內(nèi)生細(xì)菌生理生化鑒定 4討論 第三章 寄主不同器官和木虱內(nèi)生菌的研究 1 引言 2 材料和方法 、莖、葉）內(nèi)生細(xì)菌的分離 6S 定 同器官和木虱內(nèi)生細(xì)菌的相關(guān)性分析 3結(jié)果與分析 同器官和木虱內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定 同器官和木虱內(nèi)生細(xì)菌相關(guān)性關(guān)系 第四章 柑橘木虱內(nèi)生菌 1引言 2材料和方法 3結(jié)果與分析 木虱內(nèi)生菌 4討 論 第五章 木虱內(nèi)生細(xì)菌多樣性及實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè) 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 6 1 引言 2材料與方法 3結(jié)果與分析 橘木虱內(nèi)生 細(xì)菌多樣性 6S 6統(tǒng)發(fā)育樹分析 株標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 4 討論 第六章 展望 附錄 參考文獻(xiàn) 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 7 中文摘要 本文主要通過微生物傳統(tǒng)分離鑒定和分子生物學(xué)方法相結(jié)合研究柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及不同品種柑橘內(nèi)生細(xì)菌與木虱內(nèi)生細(xì)菌的相關(guān)性，并對(duì)不同溫度處理過的木虱內(nèi)生細(xì)菌 行實(shí)時(shí)熒光定量分析，期望為柑橘木虱的防治奠定基礎(chǔ)。主要有以下研究結(jié)果： 在各種試驗(yàn)操作條件、培養(yǎng)條件一致的情況下，通過 正交試驗(yàn) 34）篩選優(yōu)化木虱內(nèi)生細(xì)菌分離培養(yǎng)基，結(jié)果表明，在所設(shè)計(jì)的各種影響因素、水平中，分離柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌最佳的培養(yǎng)基配方為培養(yǎng)基為 淋巴為柞蠶血淋巴、生理鹽水濃度為 0。利用這種培養(yǎng)基可以分離出盡大可能多的柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌。 根據(jù)菌 落形態(tài)的差異，將正交試驗(yàn)中分離到進(jìn)行初步分類的柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌通過純化培養(yǎng)，提取細(xì)菌 行 16s 定。內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)鑒定分別為 木糖葡萄球菌 （ 葡萄球菌屬 （ 、 芽孢桿菌屬 （ 、不可培養(yǎng)腸桿菌屬（ 、 短小桿菌屬 （ 、 微桿菌屬 （ 、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（ 檸檬色短小桿菌（ 利用優(yōu)化后 2個(gè)隨機(jī)選取的柑橘品種的不同部位的內(nèi)生細(xì)菌以及其上面的五齡木虱內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，分析其相關(guān)性，結(jié)果表明 參考 3種昆蟲 取方法和試劑盒法提取木虱內(nèi) 生菌 通過利用原核生物細(xì)菌 16s 用引物特異性地將內(nèi)生細(xì)菌 增出來，結(jié)果顯示，改進(jìn)的 3種方法提取的總 整性較低， 增需要進(jìn)一步摸索。 劑盒法提取 的總 度相對(duì)較低，但是濃度為 12 15 L， 1增產(chǎn)物可以很好的進(jìn)行克隆測(cè)序。由于 劑盒法提取柑橘木虱內(nèi)生菌 作簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定，純度高，重復(fù)性好，節(jié)省時(shí)間，所以針對(duì)木虱內(nèi)生菌總 劑盒提取法應(yīng)為首選方法。 利用效果較好的試劑盒法提取木虱內(nèi)生細(xì)菌 過分子生物學(xué)技術(shù)以 16果顯示隨機(jī)挑取的 100 個(gè)克隆子進(jìn)行測(cè)序比對(duì)分析后， 11 個(gè)克隆子經(jīng) 16S 定為 15 個(gè)為 16 個(gè)為 63 個(gè)為 別為 1 個(gè)，最高相似度分別為 99%、 100%。系統(tǒng)發(fā)育樹分福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 8 析結(jié)果為 建的標(biāo)準(zhǔn)曲線判定系數(shù)分別達(dá)到 在 上， 說明模板濃度與 之間呈非常良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為為 一 + 一 + 木虱體內(nèi) 均含量成蟲與若蟲及溫度處理后的成蟲木虱平均含量差異顯著，若蟲和處理后成蟲體內(nèi)平均含量差異顯著，同一齡期成蟲 250C 處理結(jié)果與 350C 處理 1d、 3d 后結(jié)果差異不顯著，但與處理 5d 后差異顯著。 成蟲與若蟲體內(nèi)含量差異不顯著，但與同一齡期成蟲處理后差異顯著。同一齡期溫度處理后差異不顯著。本研究將傳統(tǒng)的微生物分析技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，多方面探索柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及相關(guān)性因素，為柑橘木虱和柑橘黃龍病的生物防治提供新思路和理論依據(jù)。 關(guān)鍵詞：柑橘木虱；內(nèi)生細(xì)菌；群落結(jié)構(gòu)； 16因；實(shí)時(shí)熒光定量 建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 9 by of of by we to a 9 (34) to of in of SB is to of on of 6s NA SB to 2 of of on to - - - - - - - to 6s of to NA CR a NA is 2 15 L, it be L. be to NA so in of of NA be NA by 6NA to 00 11 6 s 15 16 63 建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 10 9% 00%, - - - - - - - of it t t = t = x + in of of by a is 50C no d, 3 d 50C, d. no of by to in of a of 16NA 建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 11 第一章 緒論 1 研究背景 橘黃龍病的發(fā)生及危害 柑橘黃龍病 (導(dǎo)致柑橘減產(chǎn)最后死亡的一種世界性的嚴(yán)重的病害，具有毀滅性 (鄧超， 2010；孫大光， 2012)。在不同國(guó)家 (地區(qū) )，該病曾有不同的名稱，中國(guó)大陸稱為黃龍病，臺(tái)灣稱為立枯病 (1，印度稱為梢枯病 (菲律賓稱為葉斑駁病 (，印度尼西亞稱為葉脈韌皮部退化病 ( ，南非稱為青果病 ( 等。 1995 年，在中國(guó)福建省福州市召開的國(guó)際柑桔病害會(huì)議中，決定不用 青果病 這一名稱，統(tǒng)一稱該病害為 黃龍病 (胡文召，周常勇 2010 )。 我國(guó)最早在 1919 年廣東省潮汕地區(qū)發(fā)現(xiàn)了柑橘黃龍?。ㄙ噦髦?，忠文，黎起秦， 2003）。 1950 年后，柑橘黃龍病在廣東等地柑橘主產(chǎn)區(qū)蔓延開來； 1970 1980 年間，在國(guó)內(nèi)其他個(gè)別產(chǎn)區(qū)也被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)柑橘產(chǎn)量為害程度不斷加重（白華菊，龍夢(mèng)玲 2009）。柑橘黃龍病不但在我國(guó)發(fā)生，已知的有近 40 個(gè)不同的亞洲、非洲、歐洲、南北美國(guó)家都發(fā)生了柑橘黃龍?。?2006）；該 病在多個(gè)國(guó)家的發(fā)生造成了柑橘世界性的減產(chǎn)。 柑橘黃龍病是對(duì)于世界柑橘產(chǎn)量造成最具毀滅性的病害。柑橘一旦感染黃龍病，會(huì)形成均勻黃化型或著斑駁型黃梢，后期就會(huì)表現(xiàn)為一系列癥狀 缺鋅狀花葉等，直接表現(xiàn)經(jīng)濟(jì)壽命短、果品質(zhì)低劣、產(chǎn)量低 , 造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失（范國(guó)成 , 劉波 , 吳如健 , 李韜 , 蔡子堅(jiān) , 柯沖 , 2009）。至今，柑橘黃龍病菌還不能人工培養(yǎng)，主要通過控制傳播媒介木虱和生物控制來防治，由于木虱品種的不同和生物防治的局限性，許多國(guó)家不能通過防治木虱和生物防治進(jìn)行有效的消除柑橘黃龍病的危害 ( 1993)。具有柑橘癌癥之稱的柑橘黃龍病，目前，主要通過挖除病株，加強(qiáng)檢疫防疫、嚴(yán)防木虱來阻止黃龍病給柑橘產(chǎn)業(yè)造成的損失（ 鄧鐵軍， 2005）。 橘黃龍病病原 研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)柑橘黃龍病的是一種生活在韌皮部難培養(yǎng)的桿菌微生物，目前主要有三個(gè)種：亞洲種 (非洲種 ( 和美洲種（ 目前還沒有發(fā)現(xiàn)一種基于植物的以一個(gè)宿主特定于黃龍病的反應(yīng)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的診斷方法（ 2008）。 早期，關(guān)于黃龍病的病原問題，有過很多爭(zhēng)論。 20 世紀(jì) 60 年代前期，有人根據(jù)黃龍病病樹中經(jīng)常檢測(cè)到有柑橘衰退病毒 ( 的存在，認(rèn)為中國(guó)臺(tái)灣的立枯病、印度的梢枯病和中國(guó)大陸的黃龍病的病原是柑橘衰退病毒（ 1963; 陳延熙，梅汝鴻 , 1965） 。 60 年代中期，有人試驗(yàn)證實(shí)印尼葉脈韌皮部和非洲青果病退化病通過嫁接能夠傳染，因此認(rèn)為病原是病毒?。?1965; 1965）， 70 年代末期，我國(guó)研究人員觀察到病原的存在，把它稱為類立克次氏體； 80 年代初中期，研究人員再把它歸屬于類細(xì)菌（ 薄壁型細(xì)菌（張景寧 , 劉仲健 , 1994）。亞洲黃龍病福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 12 病原 ( 和非洲黃龍病病原 ( 通過 16隆測(cè)序并在 據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)后，進(jìn)一步證實(shí)黃龍病的病原菌是細(xì)菌（ 1994）。研究還發(fā)現(xiàn)中國(guó)黃龍病與非洲青果病在傳播媒介、血清學(xué)方面和熱敏感性流行區(qū)域都存在一定的差異，分別稱為亞洲型和非洲型（孫大光 , 2012）。 橘黃龍病的傳播 黃龍病的傳播途徑主要是病株與健康植株間的嫁接傳播、病樹接穗繁殖、接穗和病苗的遠(yuǎn)距離傳播以及柑橘木虱通過刺吸病株攜帶黃龍病菌后再次刺吸健康植株進(jìn)行傳播。其中木虱是重要的傳播媒介，木虱 傳播是最重要的一條途徑。另外，黃龍病病原還能夠通過菟絲子寄生進(jìn)行傳播，但是不能夠通過與汁液的磨擦和與土壤接觸進(jìn)行傳播（ 莫元妹 , 2009）。 2 研究現(xiàn)狀 橘木虱研究現(xiàn)狀 柑橘木虱（ 昆蟲綱同翅目（ 虱科（ 成蟲個(gè)體小，長(zhǎng)約 3 體為青灰色、有灰褐色斑點(diǎn) ,體被有白粉。前翅半透明 ,散布褐色斑紋，翅緣顏色較深；腹背灰黑色，腹面淺綠色，在生殖期間腹部橙黃色，足灰黃色，跗節(jié) 2 節(jié)，末節(jié)黑色（李麗萍 , 2009）。柑橘木 虱主要包括非洲柑橘木虱（ 亞洲柑橘木虱（ 其中，非洲木虱主要在非洲地區(qū)分布，亞洲柑橘木虱在亞洲和美洲等地區(qū)分布廣泛。 20 世紀(jì)初，我國(guó)的木虱主要在廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等省分布。由于全球性氣候變暖，木虱逐漸北遷，目前已經(jīng)在四川、江西、 湖南、貴州等地蔓延（杜丹超 , 鹿連明 , 張利平 , 胡秀榮 , 黃振東 , 陳國(guó)慶 , 2011）。 柑橘木虱的主要寄主是柑橘和蕓香科植物，它不但是一種重要的蟲病害，還是傳播柑橘黃龍病的唯一自然 媒介。成蟲、若蟲在柑橘嫩梢、幼葉、新芽上吸食為害，造成嫩梢幼芽干枯萎縮 ,新葉畸形卷曲（李麗萍， 2009）。木虱一旦取食黃龍病病株，就會(huì)終生攜帶黃龍病病原，帶毒木虱取食 24h 后就可以傳毒。黃龍病的傳播速度取決于柑橘木虱的數(shù)量，兩者成正比關(guān)系（袁輝 , 李安國(guó) , 2007）。柑桔木虱是唯一一種非人為因素的傳病媒介，只要田間沒有木虱，既使有黃龍病病株存在，該病原也不會(huì)傳播（鄧明學(xué) , 2006）。 柑橘黃龍病是柑橘最嚴(yán)重的病害。由于黃龍病菌到目前為止還不能人工培養(yǎng)，植株如果感染發(fā)病，就會(huì)直接造成果實(shí)產(chǎn)量下 降，品質(zhì)變差，經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)價(jià)值大打折扣，至今還沒有徹底消除該病菌的方法（ 2004）。趙學(xué)源（ 2008）闡述了廣東楊村柑橘農(nóng)場(chǎng)防治黃龍病大發(fā)生的經(jīng)驗(yàn)，把嚴(yán)格防治柑橘木虱作為治理黃龍病的一項(xiàng)關(guān)鍵性措施。 目前，防治柑橘木虱的方法主要包括農(nóng)業(yè)防治、 化學(xué)防治和生物防治等。我國(guó)目前主要還是以應(yīng)用化學(xué)防治方法來防治木虱，新梢期是木虱發(fā)生高峰期，在此期間化學(xué)防治效果是最明顯有效的。但化學(xué)農(nóng)藥頻繁的使用，導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境污染 、農(nóng)藥殘留、次要害蟲猖 撅 ,柑桔木虱抗藥性增強(qiáng)。國(guó)外，生物防治是有效控制柑桔木虱的措施之一。福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 13 生物防治主要通過天敵昆蟲的控制和病原微生物對(duì)木虱的控制實(shí)現(xiàn)木虱危害的防治，該防治方法既能有效的控制木虱，又減少生態(tài)環(huán)境污染，最終達(dá)到生物安全的要求。雖然提倡利用天敵，但還是要慎重，避免它帶來的負(fù)面影響（章玉蘋 , 李敦松 , 黃少華 , 張寶鑫 , 2009）。病原微生物防治木虱具有良好的發(fā)展前景，已有研究發(fā)現(xiàn)木虱病原真菌如擬靑霉屬的宛氏擬青霉（ 白僵菌屬的球孢白僵（ 、筍頂孢霉屬蚜筍頂孢霉（ 、鐮孢屬黃色鐮孢（ 匐柄霉屬匐柄霉（ 、枝孢屬尖孢枝孢菌（ 等都有使柑橘木虱致病的作用（陳祝安 , 曹光照 , 許益?zhèn)?, 黃基榮 , 葛嵐屏 , 1985)。因此，大力探索柑橘木虱生物防治是未來防治木虱的一重大課題，是實(shí)現(xiàn)木虱可持續(xù)防治的一種趨勢(shì)。 蟲內(nèi)生菌研究現(xiàn)狀 蟲內(nèi)共生菌及其與寄主相互關(guān)系 昆蟲體內(nèi)存在大量的 微生物，二者共生早已是種普遍的現(xiàn)象。昆蟲食物往往缺乏一種甚至多種生存不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些營(yíng)養(yǎng)素可能被其體內(nèi)微生物補(bǔ)足，補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)素主要是通過其生物合成活動(dòng)（ 1985），這就使昆蟲在進(jìn)化過程與微生物趨向于形成一種內(nèi)共生的關(guān)系，特別是同翅目（主要有蚜蟲、木虱、粉虱、介殼蟲和蟬）和鞘翅昆蟲尤為明顯（ 1965）。內(nèi)共生菌（ 由一個(gè)自由體演變而來的。內(nèi)共生菌的結(jié)構(gòu)與功能和線粒體、葉綠體相似，在宿主胞外單獨(dú)復(fù)制，有單獨(dú)的 白質(zhì)合成系統(tǒng)，不受宿主 防衛(wèi)機(jī)制的干擾（ 1981）。 內(nèi)共生菌分為初生內(nèi)共生菌（ 次生內(nèi)共生菌（ 它在昆蟲體內(nèi)分布十分廣泛，幾乎所有的昆蟲體內(nèi)都有內(nèi)共生菌。 1887 年，蟑螂的內(nèi)共生菌首先被發(fā)現(xiàn)，為丘氏蟑螂桿菌（ 象鼻蟲體內(nèi)也存在這一類內(nèi)共生菌（ 991）。已有研究表明，在新熱帶區(qū)， 16以上的昆蟲體內(nèi)有 共生，它在共生細(xì)菌類群中分布可能是最廣的、豐度最大的內(nèi)共生菌 ( 龔鵬 , 沈佐銳 , 李志紅 , 2002)。 內(nèi)共生菌與宿主之間是相互影響、相互依賴、互惠共生、協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系。節(jié)肢動(dòng)物許多都是依賴其內(nèi)共生菌提供必需物質(zhì)來補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)（ 譚周進(jìn) , 肖啟明 , 謝丙炎 , 楊宇紅 , 馮蘭香 , 2004）。褐飛虱內(nèi)共生菌自身有高活性的尿酸酶，這種酶利用寄主的代謝物尿酸合成必需氨基酸促使昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育，褐飛虱腹部脂肪體細(xì)胞的內(nèi)共生菌則能夠合成所需蛋白質(zhì)以供胚胎和胚后發(fā)育，促進(jìn)胚胎腹節(jié)分化（ 1996）。布赫納氏菌（ 宿主蚜蟲提供多種必需氨基酸，內(nèi)共生菌也可能為蚜蟲提供植物細(xì)胞壁分解酶、必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或共生素蛋白促使若蟲發(fā)育。去除共生菌蚜蟲不能合成體內(nèi)蛋白（李獻(xiàn)輝 , 李保平 , 2006）。類酵母共生菌（ 在于稻飛虱脂肪體細(xì)胞，提供稻飛虱自身不能合成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（包括必需氨基酸、脂肪酸、固醇類等）；至今還沒有發(fā)現(xiàn)無菌個(gè)體稻飛虱，減少飛虱體內(nèi)酵母菌數(shù)量，其生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)出現(xiàn)延遲，存活率、羽化率、產(chǎn)卵量下降等現(xiàn)象（王國(guó)超 , 傅強(qiáng) , 張志濤 , 2005）。蟑螂的內(nèi)福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 14 共生菌能夠產(chǎn)生尿酸降解酶等來代謝蟑螂體內(nèi)的氮素廢棄物。初生內(nèi)共生菌對(duì)宿主昆蟲的生存和生育是必要的，次生內(nèi)共生菌對(duì)宿主并不重要，煙粉虱初生內(nèi)共生菌給宿主煙粉虱提供特定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)煙粉虱的適應(yīng)性、攜毒的可能性、生物型具有影響。內(nèi)共生菌產(chǎn)生的 白保護(hù)病毒體內(nèi)的運(yùn)輸，因此其對(duì)昆蟲傳播植物病毒也是必要的（譚周進(jìn) , 肖啟明 , 謝丙炎 , 楊宇紅 , 馮蘭香 , 2005）。 研究 線蟲及節(jié)肢動(dòng)物門體內(nèi)廣泛存在，是一種共生細(xì)菌，最早由 庫蚊 巢中發(fā)現(xiàn)， 1936 年正式定名為 龔鵬 , 沈佐銳 , 李志紅 , 2002）。 1971 年， 現(xiàn) W. 蚊子中引起雜交不親和，也就是體內(nèi)不含 雌蚊的卵接受含 雄蚊授精后，受精卵存活不了（ 1973）。此后隨著研究的展開， 漸被一些生物學(xué)家關(guān)注。 僅分布廣泛，對(duì)宿主還有非常不一般的影響。它能夠影響宿主的生殖行為，出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)不親和（ 誘導(dǎo)雌性化（ 誘導(dǎo)孤雌生殖（ 現(xiàn)象，且能夠把這些現(xiàn)象垂直傳遞下去（ 施婉君 , 程家安 , 2002）。由于上述 宿主的生殖調(diào)控作用，有學(xué)者提出通過對(duì) 人為控制來改變宿主的生殖力，從而減少甚至消除害蟲。 昆蟲內(nèi)共生菌的研究為植物病原的防治提供新的方法，內(nèi)共生菌的減少或消除會(huì)導(dǎo)致病害的死亡或降低傳毒的能力和效率（譚周進(jìn) , 肖啟明 , 謝丙炎 , 楊宇紅 , 馮蘭香 , 2005） 虱內(nèi)生菌研究現(xiàn)狀 同翅目類昆蟲主要包括蟬、飛虱、蚜蟲、介殼蟲、木虱等，是一個(gè)具有高度進(jìn)化的微生物內(nèi)共生菌系統(tǒng)的昆蟲群體，很多情況下，這些昆蟲擁有一個(gè)較大的器官，一個(gè)含菌 細(xì)胞（ 由內(nèi)共生菌的獨(dú)特的含菌細(xì)胞組成 , 在細(xì)胞中潛伏著微生物群體（ 1965）。因?yàn)橥崮坷ハx終生依靠吸取營(yíng)養(yǎng)不均衡的植物汁液為食，所以它們需要內(nèi)共生微生物的幫助來彌補(bǔ)其營(yíng)養(yǎng)不足的缺陷。事實(shí)上，已有研究證明同翅目?jī)?nèi)共生微生物參與宿主代謝過程，如必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成和廢棄物氮的循環(huán)利用（ 1995; 1989; 1996; 1998）。 在木虱腹部有一個(gè)大的、黃色的含菌體，該含菌體是由一個(gè)復(fù)雜的三種細(xì)胞組成的，包裹著許多單核的含菌細(xì)胞、合成組織和一個(gè)由許多扁平細(xì)胞組成包 圍。這個(gè)含菌體胞質(zhì)內(nèi)富含一種獨(dú)特的微生物，稱為 初級(jí)內(nèi)共生菌，合胞體的胞漿充滿了另一種類型的細(xì)菌稱為 級(jí)內(nèi)共生菌（ 1937; 1965; 1969; 1987; 1998; 1998）。另外，已報(bào)道木虱的含菌胞共生體和合胞體共生體屬于 變形菌綱（ （ 1998; 1998）。 除了含菌共生體，很多同翅類還含多種類型的兼性共生微生物，如蚜蟲體內(nèi)的立克福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 15 次氏體（ 1997），灰飛虱體內(nèi)的沃爾巴克氏體屬（ 1995），介殼蟲體內(nèi)螺原體（ 2000）等 , 使其共生微生物更加的復(fù)雜。目前的研究只發(fā)現(xiàn)了柑桔木虱體內(nèi)存在合胞共生體（ 含菌體（ 桔黃龍病菌（ 沃爾巴克氏體（ 5 種內(nèi)共生菌微生物（ ; 2008） 。 共生體，尤其 于控制柑橘木虱是一個(gè)可行的辦法，因?yàn)橐延醒芯孔C明夠感染木虱（ 2000）。 它可以用來通過傳播來影響宿主定向能力或通過干擾宿主健康、影響植物病原體調(diào)節(jié)寄主免疫系統(tǒng)和抗菌產(chǎn)品。 已經(jīng)報(bào)道的 沃爾巴克氏體（ 自然種群蚊子中降低寄主昆蟲健康和減少病原體的傳播的成功證明了使用這一方法具有可行性（ C 2013）。 橘內(nèi)生細(xì)菌研究現(xiàn)狀 早期對(duì)于植物內(nèi)生細(xì)菌的研究主要是對(duì)健康植物體內(nèi)微生物存在與否進(jìn)行論證。自1876 年 取無菌葡萄果汁后才開始了植物內(nèi)生細(xì)菌的研究（劉云霞）。 1992 年，首次提出了植物理內(nèi)生細(xì)菌的概念，認(rèn)為植物內(nèi)生菌是指能夠定殖在植物細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)，并與寄主植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物（胡桂萍）。研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌廣泛存在，地球 300000 種植物中都有內(nèi)生菌的存在（ 2004）。隨著不同植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等器官中 大量的內(nèi)生細(xì)菌被更多的研究者分離出來 ,人們才對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的研究逐漸地重視起來（冉國(guó)華 , 張志元 , 2004）。 研究發(fā)現(xiàn)有些植物內(nèi)生細(xì)菌使植物獲益，如固氮（ 1998），促進(jìn)植物生長(zhǎng)（ 1997）或誘導(dǎo)植物抗病性（ 1996）等。 目前對(duì)柑橘內(nèi)生細(xì)菌也已開展了很多的研究。羅永蘭等從 3 種柑橘的不同器官中分離到 75 份內(nèi)生細(xì)菌，分別為氣芽孢桿菌屬（ 、氣單胞菌屬（ 、芽孢桿菌屬（ 、黃單胞桿菌屬（ 、假單胞桿菌屬（ 、土壤桿菌屬（ 、乳桿菌屬（ 。且出現(xiàn)的頻次不同（ 羅永蘭 , 張志元 , 喻珺 , 2006）。 分離柑橘內(nèi)生細(xì)菌，其中一株 2004）。袁紅旭等篩選出 4 株對(duì)柑橘炭疽病具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，其中1 株菌能夠促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)（ 袁紅旭 , 陳勇明 , 何財(cái)能 , 羅冬萍 , 許丹陽 , 2005） 。張翼等從柑橘枝條中分離到 26 株對(duì)油菜菌核病菌（ 有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，其中 株的拮抗活性最強(qiáng)。經(jīng)鑒定 株為枯草芽孢桿菌（ 張翼 , 白晨 , 冉國(guó)華 , 張志元 , 陳耀輝 , 吳剛 , 2009）。內(nèi)生細(xì)菌對(duì)于寄主的重要性 已被認(rèn)識(shí)到 , 保護(hù)植物防治害蟲，包括昆蟲、線蟲、植物病原菌、細(xì)菌等；還可在寄主內(nèi)引起生理上的修飾，比如使它們更耐氫氣壓力；一些內(nèi)生細(xì)菌還能產(chǎn)生多種生物技術(shù)價(jià)值如抗生素和抗癌抗生素（ 2000）。研究柑橘內(nèi)生細(xì)菌及其與寄主的相互關(guān)系為柑橘生產(chǎn)、生物防治等的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 3 研究方法與技術(shù) 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 16 交試驗(yàn)優(yōu)化木虱內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)基 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法于 20世紀(jì) 60年代初由日本傳到我國(guó)。 8 0年代初，田口玄一 3次優(yōu)化設(shè)計(jì)該法后在中國(guó)得到廣 泛的運(yùn)用。 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法是一種用正交表安排多因素多水平試驗(yàn)的方法， 統(tǒng)計(jì)學(xué)家通過一系列的表格實(shí)現(xiàn)正交設(shè)計(jì)，這些表叫正交表。具有完成試驗(yàn)要求 所需的實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、數(shù)據(jù)點(diǎn)的分布很均勻、可用相應(yīng)的極差分析方法、方差分析方法、回歸分析方法等對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出有價(jià)值的結(jié)論的特點(diǎn)?？茖W(xué)合理地進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，既可獲得質(zhì)量高、可靠性高的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和試驗(yàn)產(chǎn)品，在試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析中，還更有利于我們掌握試驗(yàn)對(duì)象相互間內(nèi)在的聯(lián)系、最佳摻量以及最佳工藝。正交試驗(yàn)試驗(yàn)次數(shù)少，能夠獲得滿意的結(jié)果，多快好省、事半功倍，既節(jié)省了人力、 物力、財(cái) 力，又可獲得比較良好的技術(shù)經(jīng)濟(jì)效益。正交最優(yōu)化設(shè)計(jì)是處理多因素、多水平問題的好方法，對(duì)于該類問題，它無疑是最佳選擇。 6 S 因序列分析的應(yīng)用 16S 原核生物的一種核糖體 細(xì)菌分類學(xué)研究最有用、最常用的分子鐘，且種類少，含量大，在所有生物中都存在，進(jìn)化