密級 ： 論文編號 ： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 產(chǎn) 激活蛋白 極 細(xì)鏈格孢菌發(fā)酵工藝 優(yōu)化 和 中試 生產(chǎn) 技術(shù) I 摘 要 極細(xì) 鏈格孢 (株能產(chǎn)生誘導(dǎo)多種植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的 植物激活蛋白 ， 該 蛋白 粗提液對黃瓜、番茄、水稻、煙草和白菜均有理想的促進(jìn)生長和誘抗效果 , 并且 對環(huán)境安全、不會引起植物的抗性，是一種具有廣泛開發(fā)前景的新型生物農(nóng)藥。為了進(jìn)一步提高 極細(xì) 鏈格孢菌 植物激活蛋白 產(chǎn)量，本文根據(jù) 極細(xì) 鏈格孢 營養(yǎng)需求，通過不同營養(yǎng)組合和多因子試驗分析，對該菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，并進(jìn)行了 100 L 和 6 噸發(fā)酵罐的逐級放大試驗，獲得了理想的激活蛋白產(chǎn)量，該研究為今后激發(fā)子農(nóng)藥的規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下： 1、通過 極細(xì) 鏈格孢菌發(fā)酵生長曲線試驗，孢子形態(tài)、萌發(fā)以及菌絲體生長形態(tài)的觀察，了解了供試菌的生長周期和形態(tài)特征，為以后發(fā)酵試驗奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。 2、研究了不同培養(yǎng)基和發(fā)酵時間激活蛋白和菌絲干重的相互關(guān)系，確定了以菌絲干重作為發(fā)酵評價標(biāo)準(zhǔn)。 3、通過搖瓶試驗，應(yīng)用正交試驗對培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為： 15 g/L 蔗糖， 5 g/L 葡萄糖， 5 g/L 玉米淀粉， 20 g/L 土豆淀粉， 10 g/L 谷氨酸， 5 g/10 g/L 黃豆粉， 5 g/L 硫酸銨；在優(yōu)化過程中分別考察了接種齡、接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基初始 、搖瓶裝液量和溫度等對發(fā)酵的影響，確定了 極細(xì) 鏈格孢菌最適培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基起始 500 瓶裝液量 75 齡 18 h，接種量 10%，培養(yǎng) 28 1，搖床轉(zhuǎn)速為 180 r/化后菌絲產(chǎn)量從 養(yǎng)產(chǎn)量的 9 g/L 增加到 39 g/L，提高近 4 倍。 4、以搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行了 15 L,100 L 發(fā)酵罐的放大試驗，考察了攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、溶氧值，溫度、發(fā)酵過程中的 參數(shù)，對發(fā)酵過程中的代謝曲線進(jìn)行了分析，并在100L 罐嘗試補(bǔ)料發(fā)酵方式，使菌絲產(chǎn)量達(dá)到 50.6 g/L，比搖瓶培養(yǎng)的菌絲最高產(chǎn)量 39 g/L 提高32%，比 15 L 罐發(fā)酵最高產(chǎn)量 41.4 g/L 提高 22%，說明補(bǔ) 料發(fā)酵有利于菌絲產(chǎn)量的提高。 5、根據(jù) 15 L、 100 L 的逐級放大發(fā)酵參數(shù)，進(jìn)行了 6 噸工業(yè)罐的三級發(fā)酵試驗，菌絲產(chǎn)量與小 試菌絲產(chǎn)量相當(dāng)，為今后大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ) 。 關(guān)鍵詞 ： 極細(xì) 鏈格孢菌， 發(fā)酵 條件 in is to It a in of in of 000L of in as 1. of of in It of in 2. of in It of be as of 3. in is up 5 g/L 5 g/L 5 g/L 20 g/L 10 g/L 5 g/L 10 g/L g/L pH .5,of 5 mL 00mL 8h, 0%, 81C, 80 r/of .9 g/100 mL of 4. on in 5 L 00 L as in of 00 L 0.6 g/L 2% 2%, of 5 L 5. on 5 L, 100 L 000 L 00 L in 錄 第一章 緒論 . 1 白激發(fā)子研究概要 . 1 白激發(fā)子種類及其在國內(nèi)外研究進(jìn)展 . 2 敏蛋白 . 2 發(fā)素 . 2 毒蛋白 . 3 毒激發(fā)子 . 4 活蛋白 . 4 菌源生物農(nóng)藥的發(fā)酵 . 4 體真菌生物農(nóng)藥的發(fā)酵研究進(jìn)展 . 4 菌代謝產(chǎn)物的發(fā)酵工藝 . 5 料發(fā)酵工藝 . 5 究目的和意義 . 7 第二章 極細(xì) 鏈格孢培養(yǎng)特性及發(fā)酵評價參數(shù)的建立 . 8 料和方法 . 8 驗材料 . 8 驗方法 . 9 果與分析 . 11 細(xì) 鏈格孢菌生長曲線的測定 . 11 細(xì) 鏈格孢孢子萌發(fā)和菌絲生長狀態(tài)觀察 . 11 孢培養(yǎng)基和條件的比較 . 14 活蛋白與菌絲產(chǎn)量的關(guān)系 . 15 章小結(jié) . 16 第三章 極細(xì) 鏈格孢產(chǎn)激活蛋白的搖瓶發(fā)酵 . 17 料和方法 . 17 驗材料 . 17 驗方法 . 19 果與分析 . 19 養(yǎng)基碳、氮源和無機(jī)鹽的篩選和優(yōu)化 . 19 種量對菌絲產(chǎn)量的影響 . 21 齡對菌絲產(chǎn)量的影響 . 21 瓶通氣量對菌絲產(chǎn)量的影響 . 21 液量對菌絲產(chǎn)量的影響 . 22 養(yǎng)溫度對菌絲產(chǎn)量的影響 . 22 養(yǎng)基起始 菌絲產(chǎn)量的影響 . 23 發(fā)酵代謝參數(shù)動態(tài) 分析 . 24 章結(jié)論與討論 . 24 第四章 極細(xì) 鏈格孢產(chǎn)激活蛋白中試發(fā)酵技術(shù)研究 . 26 料和方法 . 26 驗材料 . 26 驗方法 . 28 果與分析 . 29 5 L 罐發(fā)酵條件的確定及發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化 . 29 00 L 罐中試發(fā)酵 . 30 章小結(jié) . 31 第五章 極細(xì) 鏈格孢產(chǎn)激活蛋白工業(yè)化三級發(fā)酵技術(shù)研究 . 32 料和方法 . 32 驗材料 . 32 驗方法 . 32 果與分析 . 32 級發(fā)酵條件的確定 . 32 業(yè)化發(fā)酵后處理技術(shù)流程的建立 . 33 章小結(jié) . 34 第六章 全文結(jié)論 . 35 參考文 獻(xiàn) . 36 附錄 . 40 附錄一 培養(yǎng)基中葡萄糖含量的測定 . 40 附錄二 甲醛滴定氨基氮法 . 42 附錄三 還原糖的測定 . 43 附錄四 雙縮脲蛋白質(zhì)測定方法 . 44 致謝 . 45 作者簡歷 . 46 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 白激發(fā)子研究 概要 植物與病原菌的相互作用包括兩種類型：一種是親和性互作（ ；另一種為非親和性互作（ 植物與病原菌之間的非親和性互作常會引發(fā)植物體一系列的生理生化反應(yīng)，這些反應(yīng)會進(jìn)一步誘發(fā)植物的抗性。非親和性互作的分子機(jī)制假設(shè)是 1）植物體識別病原菌分子 2） 細(xì)胞傳導(dǎo)途徑的激活 3）植物體發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)以誘導(dǎo)抗性 ( A& J 1990,& 1990, J 989)。 在植物與病原菌非親和性互作過程中，能夠誘導(dǎo)引發(fā)防御反應(yīng)的某種特 定的微生物或植物分子即稱為激發(fā)子 ( J 1989, G& 1984, D& J 1988)。 激發(fā)子有多種類型，非特異性激發(fā)子，如 1,3蛋 白，殼聚糖 和花生四烯酸等這類激發(fā)子對易感病植物及抗性植物均能引發(fā)防御反應(yīng) ( . 1988)。另一類非特異性激發(fā)子是源于植物體本身的，如多聚半乳糖苷，它由植物細(xì)胞壁分泌，是一種可降解微生物的酶 ( . 1988)。盡管非特異性激發(fā)子可能參與了植物與微生物互作的信號傳導(dǎo)過程，但這類激發(fā)子是否引發(fā)植物體抗性還有待研究。相對于非特異性激發(fā)子，特異性激發(fā)子只引發(fā)對病原菌激發(fā)子有抗性的植物體的防御反應(yīng)。特異性激發(fā)子被認(rèn)為可引發(fā)無毒基因的表達(dá) ， 無毒基因是與寄主抗病基因互作，其產(chǎn)物是與寄主抗病基因 產(chǎn)物互補(bǔ)的基因 ( T 1986, T 1990)。從植物病原細(xì)菌 ，真菌和病毒中都發(fā)現(xiàn)存在 相應(yīng)的寄主植物抗病基因互作的無毒基因。 如 基因 表達(dá)出一種低分子量的蛋白激發(fā)了抗性大豆的過敏性反應(yīng)，這就表明 因編碼了一種參與合成激發(fā)子的酶 ( T 病原真菌中也同樣存在無毒基因如產(chǎn)生一種富含甘露糖和半乳糖的胞外糖蛋白，這種糖蛋白可造成抗性大豆的植物抗毒素積 累，但易感大豆沒有此現(xiàn)象，這表明，該糖蛋白很可能就是無毒基因的產(chǎn)物 ( S& J 1986, S 1989)。 因編碼一種含有 28 個氨基酸的肽段 ， 它可以誘導(dǎo) 基因番茄的特異性過敏反應(yīng) M J& J G M 1988, A L 1991)。近期研究表明，對于不含有因同源序列的 植株， 其表現(xiàn)為毒性，而對于 基因植株則是無毒的，這就進(jìn)一步驗證了激發(fā)子對專一性寄主的作用 ( F J M 植物的抗性基因與病原物的無毒基因的產(chǎn)物相互識別后，植物才能產(chǎn)生非親和反應(yīng)。在非親和反應(yīng)中，植物會誘發(fā)一些特征性的防御反應(yīng)，感染處的細(xì)胞 會發(fā)生過敏反應(yīng)，這部分的細(xì)胞死亡可以延緩或抑制病菌的生長和擴(kuò)散 。同時來源于感染處的信號分子誘導(dǎo)植物的其余部分產(chǎn)生局部獲得抗性或系統(tǒng)獲得抗性，以防止病菌的擴(kuò)散和植株第二次受病菌感染。病原菌接 觸寄主或非寄主植物時產(chǎn)生過敏反應(yīng)，在這兩種互作反應(yīng)中均涉及到寄主與病原菌之間的信號交換，其結(jié)果導(dǎo)致植物感病或抗病。 蛋白激發(fā)子（ 病原菌 激發(fā)子誘導(dǎo)后，相關(guān)的植中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 物基因可迅速地得到表達(dá)，蛋白激發(fā)子與寄主的受體蛋白結(jié)合，經(jīng)過一系列反應(yīng)過程誘導(dǎo)抗性。由于蛋白激發(fā)子能在植株體內(nèi)誘導(dǎo)多種防御反應(yīng)，因此在過去的 10 多年中，許多的研究工作都致力于它的作用機(jī)制上。但是蛋白激發(fā)子在體外不表現(xiàn)殺菌作用，僅通過啟動植物體內(nèi)的防御機(jī)制而在抗病性中發(fā)揮作用，因此在當(dāng)前化學(xué)防治造成嚴(yán)重 生態(tài)惡化、抗病育種無法解決抗性不穩(wěn)定等難題的情況下，蛋白激發(fā)子可能將成為農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中病害控制的新思路。 白激發(fā)子種類及其在國內(nèi)外研究進(jìn)展 目前發(fā)現(xiàn)的植物蛋白激發(fā)子按照來源與特性，分為過敏蛋白 發(fā)素 毒蛋白，病毒蛋白及激活蛋白 。 敏蛋白 1992 年韋忠民 (992)等研究表明 白是由梨火疫病細(xì)菌 (基因編碼的蛋白， 大小為 44 992)。 突變分析表明 植物病原細(xì)菌誘導(dǎo)非寄主過敏性和在寄主上致病所必需的蛋白因子，可在煙草上單獨誘導(dǎo)產(chǎn)生過敏反應(yīng)。 因雖然是來自于病原菌，但是作為一種非特異性的激發(fā)子卻能夠引起非寄主抗病性的增加以及促進(jìn)植物的生長。 來自梨火疫病的病原菌 而在轉(zhuǎn) 梨上， 表現(xiàn)出了非常強(qiáng)的抗病。 有以下分子特征 (1)親 水性； (2)403 個氨基殘基長度，分子量 44(3)對熱穩(wěn)定：100 處理 10 會使其失活； (4)對蛋白酶 K 和紫外線敏感； (5)富含甘氨酸而缺少半胱氨酸；(6)水溶性酸性蛋白； (7)無四級結(jié)構(gòu)。 發(fā)素 疫霉屬 (很多病原菌能向培養(yǎng)基分泌誘導(dǎo)非寄主產(chǎn)生過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)，此類蛋白可誘導(dǎo)茄科的煙草、十字花科的油菜和蘿卜產(chǎn)生過敏性壞死和誘導(dǎo)抗性等防御反應(yīng)，稱為1989)。這種激發(fā)子被認(rèn)為是 煙草互作過程中無毒基因的產(chǎn)物。其在合成過程中首先是合成帶有信號肽的前體蛋 白，在翻譯的同時，信號肽被切割掉了，然后分泌到培養(yǎng)基中，不存在翻譯后修飾現(xiàn)象。 根據(jù)結(jié)構(gòu)特性及生物活性， 分為 種類型 ( 989), 由 泌的酸性蛋白，包括 ；而 泌的堿 性蛋白( 1992, 1985)，包括 。 十三個氨基酸殘基為纈氨酸，而 同部位為賴氨酸，因此 更高的親水性，更易溶解。 CD 示0以上是 螺旋，一共有三個。 誘導(dǎo)局部的過敏反應(yīng)， 能誘導(dǎo)系統(tǒng)的過敏反應(yīng)。 容易在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，在煙草中誘導(dǎo)相同程度的過敏反應(yīng)所需蛋白中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 量比 低得多。一般 性是 50。最近，從 時分離出 白 ( C 992)。 究證明， 地蛋白 (一種由隱地疫霉 (分泌的蛋白類激發(fā)子，等電點 98 個氨基酸組成，在培養(yǎng)液中很豐富 ( 996)。因 極低濃度 (100 就能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生 使植株獲得廣譜抗病性，同時產(chǎn)生與防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的物質(zhì)如乙稀、植物保衛(wèi)素、 白等，所以倍受植物病理學(xué)家和育種工作者的重視。為蛋白類激發(fā)子在國外得到了較為系統(tǒng)的研究，在氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)、寄主與非寄主抗病性、作用機(jī)理、作用靶標(biāo)、結(jié)構(gòu)與生物活性的相關(guān)性以及抗病基因工程等方面取得了較大的進(jìn)展。 從 離到的 10 右的蛋白，是 992)。該蛋白基本不被產(chǎn)生或很少產(chǎn)生，類似無毒基因的產(chǎn)物 。 從疫霉菌 培養(yǎng)濾液中分離出分子量為 張宏明 等 1999)。在對供試煙草 6 個品種均產(chǎn)生壞死效應(yīng)，但是對煙草屬以外的茄科植物馬鈴薯和矮牽牛以及十字花科的蘿卜、小油菜、甘藍(lán)和藜科的菠菜沒有作用?？赡苁蔷哂蟹N屬專一性的激發(fā)子，而從疫霉屬其它種提取的 發(fā)子還可誘導(dǎo)十字花科的油菜和蘿卜產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)，證明 其他 有更強(qiáng)的專一性。 外有種 90 白激發(fā)子從棉疫病菌（ 養(yǎng)濾液中提純得到的 （ 張正光 等 2001） 。該激發(fā)子可誘導(dǎo)不同煙草品種產(chǎn)生過敏反應(yīng)，但不能誘導(dǎo)辣椒和茄子等茄科作物及棉花發(fā)生過敏反應(yīng)，該激發(fā)子誘導(dǎo)植物發(fā)生過敏反應(yīng)具有一定的專化性。該激發(fā)子 可以誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗性反應(yīng)，其抗性以處理后立即接種煙草疫 霉 為最強(qiáng)，接種后 48 h 防效達(dá) 68%，以后隨時間的延長逐漸減弱。 該激發(fā)子 對酸、堿和溫度不敏感，但對蛋白酶 K 敏感。 通過水楊酸介導(dǎo)抗病信號途徑，激發(fā)植物獲得對真菌、細(xì)菌等病原物的系統(tǒng)抗性(同時產(chǎn)生活性氧自由基、脂過氧化物、植保素、 白等防御反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)。近年來從一些腐霉菌中也發(fā)現(xiàn)有 活性蛋白存在，并能高效激發(fā)番茄的系統(tǒng)獲得性抗性。 受到人們的廣泛關(guān)注。 毒蛋白 包括了木聚糖酶、一些 因產(chǎn)物如 ， 病原無毒基因編碼產(chǎn)物可以作為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 激發(fā)子誘導(dǎo)單個顯性抗病基因寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)。在番茄葉霉病菌（ 寄主的互作系統(tǒng)中已純化了兩種由病原菌無毒基因編碼的專化性激發(fā)子，分別為 28 個氨基酸的和 106 個氨基酸的 白。病菌只有與寄主互作時才分泌這兩種蛋白，在培養(yǎng)基中不產(chǎn)生。 毒激發(fā)子 病毒的外殼蛋白、復(fù)制酶以及移動蛋白等都可作為病毒激發(fā)子，但相關(guān)的研究報道不多。 活蛋白 類蛋白是本實驗室目前的研究對象， 存在于真菌中。試驗證明， 激活蛋白 對植物煙草花葉病毒病、黃瓜花葉病毒病等多種病毒病和蚜蟲的控制效果在 75 %以上 ,并能 促生增產(chǎn) （ 邱德文2004） 。前期的試驗也已經(jīng)顯示，較低濃度的真菌激活蛋白能促進(jìn)植物生長，并對其相關(guān)物質(zhì)生長素、纖維素酶、根系脫氫酶進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)處理植株根系脫氫酶、纖維素酶活性、生長素含量明顯高于對照；較低濃度的真菌激活蛋白也具有抗病防蟲作用，處理植株后，該植株的抗性明顯增強(qiáng)，過氧化物酶活性，脯氨酸含量也明顯高于對照。而高濃度的真菌激活蛋白具有較強(qiáng)的抑制作用。用真菌激活蛋白液浸黃瓜種子 （ 邱德 文 等 2005） ，觀察后結(jié)果發(fā)現(xiàn)較低濃度的真菌激活蛋白處理的種子芽長要高于對照、二次根數(shù)也多于對照；而高濃度的真菌激活蛋白處理的種子芽長明顯低于對照、二次根數(shù)也明顯少于對照。 菌源生物農(nóng)藥 的發(fā)酵 發(fā)酵的發(fā)展歷史悠久，其技術(shù)已相對成熟，但對于生物農(nóng)藥特別 是真菌源生物農(nóng)藥的發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵工藝和產(chǎn)業(yè)化規(guī)?；€相對落后 。 這主要因為生物農(nóng)藥的批量生產(chǎn)往往通過工業(yè)發(fā)酵 ,或者是從生物體直接分離提取 ,故不利于產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。 真菌發(fā)酵 過程中存在 發(fā)酵時間長：如中生菌素；易染菌：有些真菌本身不分泌抗生素，對外界細(xì)菌缺乏自 我保護(hù)的功能；罐發(fā)酵抗剪切力差；胞內(nèi) 產(chǎn)物后處理難 ，大規(guī)模發(fā)酵后殘余廢物 污染 生態(tài)環(huán)境 等問題， 因此優(yōu)化真菌發(fā)酵工程技術(shù) 對推進(jìn)生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化具有 重大 意義。 體真菌生物農(nóng)藥的發(fā)酵研究進(jìn)展 目前真菌源生物 農(nóng)藥多采用真菌產(chǎn)生的孢子作為有效成分，如綠僵菌、白僵菌等，近期研究報道， 一種淡紫擬青霉（ 89(產(chǎn)生的擬青霉殺線蟲劑經(jīng)發(fā)酵工程技術(shù)的優(yōu)化，采用固液雙相的發(fā)酵技術(shù)實現(xiàn)了真菌速生高產(chǎn)孢短周期發(fā)酵，采用開放式發(fā)酵，將發(fā)酵周期從 15d 減少到 10d，孢子 產(chǎn)量達(dá) 1 1012/g，突破了長期以來產(chǎn)孢量低、周期長的技術(shù)瓶頸。該發(fā)酵工藝是將真菌菌種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng) 8 9 d，待菌絲生長成熟后再接到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3 5 d 產(chǎn)生芽生 孢子，分離孢子即得到發(fā)酵產(chǎn)物。經(jīng)過 酵通氣量、培養(yǎng)基中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 的改良，對這種真菌采用了開放式培養(yǎng)，開發(fā)出一種新型可固液共用的培養(yǎng)基，在通氣條件下培養(yǎng)淡紫擬青霉產(chǎn)孢只需 10 d（ 000） 。 菌代謝產(chǎn)物的 發(fā)酵工藝 生物農(nóng)藥中以真菌代謝產(chǎn)物作為有效成份的有許多種，其中農(nóng)用殺菌抗生素就是一種 傳統(tǒng)的生物農(nóng)藥，我國已經(jīng)研制的農(nóng)用抗生素有春雷霉素，井岡霉素，慶豐霉素，多抗霉素，公主嶺霉素，農(nóng)抗 120，中生菌素等農(nóng)用抗生素品種，我國現(xiàn)已大規(guī)模生產(chǎn)的農(nóng)用殺菌抗生素品種有井岡霉素，年產(chǎn)量達(dá) 4 千噸 （朱昌雄等 2003） ，其主要的發(fā)酵方式為 發(fā)酵罐內(nèi)液體攪拌培養(yǎng)。 植物激活蛋白的作用機(jī)理與上述真菌源生物農(nóng)藥不同， 農(nóng)用抗生素多為真菌胞外分泌物，而植物激活蛋白 的作用成分是 極細(xì) 鏈格 孢菌 (生的一種胞內(nèi)蛋白， 這種胞內(nèi)蛋白是真菌生長的初級代謝產(chǎn)物，故而其發(fā)酵周期會比多為次級代 謝產(chǎn)物的農(nóng)用抗生素 的發(fā)酵生產(chǎn)節(jié)省大量時間和成本，但其發(fā)酵產(chǎn)物的提取和制劑工藝又相對繁瑣，針對這些特點 研究適合的發(fā)酵工藝和提取工藝是規(guī)模化生產(chǎn)的必要前提 。 隨著發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，人們認(rèn)識到菌體的增殖和蛋白產(chǎn)物的表達(dá)都集中在對數(shù)生長期內(nèi)完成，因此發(fā)酵工藝的改進(jìn)就集中在如何增加菌株對數(shù)生長期的生長時間、相對縮短衰亡時間上，從而形成了高密度發(fā)酵工藝。 高密度發(fā)酵多見于工程菌株的發(fā)酵，一般工程菌株生長迅速，在特定的時間點補(bǔ)加養(yǎng)料會使其發(fā)酵產(chǎn)物密度激增，對以菌體數(shù)量為目標(biāo)的發(fā)酵無疑是一種有效提高產(chǎn)量的好方法。據(jù)報道， 其發(fā)酵產(chǎn)物量可達(dá)到菌體干重 100 g/L。 雖然在真菌發(fā)酵中還未有如此高的產(chǎn)物量，但 高密度發(fā)酵 的一些工藝特點是適合植物激活蛋白發(fā)酵的 。并且目前高密度發(fā)酵工藝已成為生物技術(shù)中中試生產(chǎn)的主要發(fā)酵工藝，該方法工藝穩(wěn)定，發(fā)酵周期可縮短一半以上，而菌體產(chǎn)量和產(chǎn)物表達(dá)量是非高密度發(fā)酵的 10 50 倍， 有些發(fā)酵中目的產(chǎn)物的 活性 也有所提高 ，可見高密度發(fā)酵工藝比較適合真菌初級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，時間短，見效快，有著無可比擬的優(yōu)點。 料發(fā)酵工藝 進(jìn)行高密度發(fā)酵的重要手段之一 就是補(bǔ)料發(fā)酵工藝 ， 補(bǔ)料發(fā)酵 (指在分批發(fā)酵過程中 ， 間歇或連續(xù)地補(bǔ)加含有限制性營養(yǎng)成分的新鮮培養(yǎng)基。早期的補(bǔ)料方式完全是憑經(jīng)驗進(jìn)行的 ， 即發(fā)酵到一定時間 ， 經(jīng)驗性地添加一定量營養(yǎng)物。補(bǔ)料成分簡單、補(bǔ)加的數(shù)量少 ，這種補(bǔ)料方式簡單易行 ， 但往往無法有效控制發(fā)酵。在現(xiàn)代大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)中 ， 補(bǔ)料方式已從簡單一級補(bǔ)料發(fā)展到多級重復(fù)補(bǔ)料 ， 從簡單地補(bǔ)加一種營養(yǎng)物發(fā)展到補(bǔ) 加幾種營養(yǎng)物，