密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 解菌的 篩選 、降解 基因克隆 及 作用效果 I 摘 要 多環(huán)芳烴降解菌的篩選 一直是國內(nèi)外生物 降解 一個重要方面 ， 獲取 高效降解 菌株是生物修復的前提。 本論文從 長期 污染 的 土壤中篩選到兩株 降解 多環(huán)芳烴 的分枝桿菌 ， 對其進行了固體平板，搖床培養(yǎng)和污染土壤中的降解效果研究， 結果 表明這兩株菌均 有很強的 降解 能力。 根據(jù)已報道的多環(huán)芳烴降解菌的雙加氧酶同源序列設計引物， 增出編碼 雙加氧酶大亞基和小亞基的基因片段，為了進一步研究 多環(huán)芳烴 降解基因，構建了降解菌的粘?；蚪M文庫，并 篩選到攜帶降解基因的 克隆 子 。 利用平板 升華 法 從 103 個多環(huán)芳烴污染的土壤樣品中初篩到 51 株多環(huán)芳烴降解菌。比較降解菌降解圈的大小，得到 2 株降解能力較強的菌，命名為 株菌均能以苊、芴、菲、蒽、熒蒽和芘為唯一碳源和能源良好生長。通過形態(tài)觀察、生理生化特征測定、全細胞脂肪酸分析、 16S 列分 析和 列分析鑒定這兩株菌 都 屬于分枝桿菌屬（ ，但為 不同的種 。 菌株 固體平板上和液體培養(yǎng)基中都有很好的降解效果。在固體平板上，菌株 0d） 和熒蒽 （ 0d） 的速率大于 分別為 00d） ，而降解芘的速率 （ 0d） 卻小于菌株 0d） 。 在液體培養(yǎng)基中， 菌株 5d 時對 200 菲的降解率達到 98%， 16d 對難降解的芘的降解率達到 80，對熒蒽的降解率為 50左右 。 降解菌 含芘 50、 100 和 200的無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 16d 降解率分別達到 在芘濃度 100， 5 9 的液體條件下，均可生長 和降解 ， 添加高濃度的葡萄糖會抑制降解能力。 添加氮源和磷源對菌株 在污染土壤中的降解效果有一定的促進作用，添加無機鉀對降解效果有一定的抑制作用 。 盆栽條件下，降解菌株與植物聯(lián)合的作用效果較好，降解效率較高。從開始接種到第 4 周這段時間的降解速度較快 ，之后變慢。接種菌劑比不接種菌劑的降解效果好，土壤不滅菌比滅菌的降解效果佳。植物的根和莖葉對芘有一定的吸收作用， 不接種菌劑的處理比 接種的吸收的較多，土壤中接入菌劑后，植株芘的含量明顯降低，不滅菌土壤植株芘的含量相對高于滅菌土壤 。 根據(jù)已報道降解菌的雙加氧酶同源序列設計引物， 增出編碼 雙加氧酶大亞基和小亞基的基因片段，序列分析表明與已知降解芘的分枝桿菌的雙加氧酶基因 有 99的同源性 。 利用粘粒 為載體，制備基因組 分酶切片斷，經(jīng)體外包裝、轉染 大腸桿菌 選擇培 養(yǎng)基平板上獲得 1 萬多個重組克隆子，構建了菌株 基因組粘粒文庫。從含菲的固體培養(yǎng)基上篩選到了攜帶降解基因的克隆子， 經(jīng) 增，所有克隆子均帶有 關鍵詞 ： 多環(huán)芳烴 ， 分枝桿菌 ， 微生物降解 ， 芘 is an at is of of on in of of on of of 11 to 03 1 11 16. on as a to of 6S TS on in of 0d )0d) 16 11, of 0d)11 16. In 8 d, 0% 0% at 11 in at 0,100 00 In 00 in 9. 11 by of a to in a a In of an of in in 11 16 no of in in in of 11 in . as 0,000 CR of 錄 第一章 多環(huán)芳烴微生物降解的研究進展 . 1 環(huán)芳烴（ . 1 產(chǎn)生和來源 . 1 理化特征 . 2 危害 . 3 內(nèi)外的污染現(xiàn)狀 . 5 環(huán)芳烴的微生物降解 . 5 分子量多環(huán)芳烴的降解 . 6 分子量多環(huán)芳烴的降解 . 7 環(huán)芳烴的無氧降解 . 12 枝桿菌降解多環(huán)芳烴的研究現(xiàn)狀 . 13 環(huán)芳烴降解菌的分子生物學研究 . 14 環(huán)芳烴污染土壤的生物修復 . 16 環(huán)芳烴污染土壤的微生物修復 . 16 環(huán)芳烴污染土壤的微生物植物聯(lián)合修復 . 18 環(huán)芳烴污染土壤生物修復的影響因素 . 19 究的目的和意義 . 19 究內(nèi)容和技術路線 . 20 第二章 多環(huán)芳烴降解菌的篩選 . 21 驗材料 . 21 品來源 . 21 養(yǎng)基 . 21 要試劑 . 21 要儀器 . 21 驗方法 . 22 選方法 . 22 型特征鑒定 . 22 離菌株全細胞脂肪酸甲脂分析 . 23 6S 定 . 24 6S 列的鑒定 . 24 統(tǒng)發(fā)育樹的構建 . 24 果與分析 . 25 解菌的篩選 . 25 離菌株的形態(tài)觀察和生理生化特征 . 26 離菌株的全細胞脂肪酸分析 . 27 V 離菌株的 16S 列分析 . 27 于 16S 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 . 28 列的分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構建 . 29 論 . 29 第三章 降解菌株的室內(nèi)作用效果研究 . 31 驗材料 . 31 驗菌株和培養(yǎng)基 . 31 驗 方法 . 31 環(huán)芳烴的測定方法 . 31 株生長量的測定 . 31 株 固體多環(huán)芳 烴平板上的生長和降解效果 . 31 株 液體培養(yǎng)基中的生長特性和降解效果 . 32 體培養(yǎng)基中影響降解菌 用效果的因素 . 32 果分析 . 32 解菌株在固體平板上的生長特性和降解特性 . 32 解菌株在液體培養(yǎng)基中的生長特性和降解特性 . 34 同濃度芘對 生長和降解能力影響 . 37 同 對 生長和降解芘能力的影響 . 38 同葡萄糖濃度對 長和降解芘能力的影響 . 38 論 . 39 第四章 芘污染土壤中降解菌的作用效果 . 41 驗材料 . 41 驗方法 . 41 壤、草炭、盆缽和種子表面滅菌處理 . 41 解菌株菌劑的制備 . 41 工污染土壤樣品的制備 . 42 品處理 . 42 驗設計 . 42 、 P、 K 養(yǎng)分對降解菌在土壤中作用效果的影響 . 42 解菌與植物聯(lián)合的作用效果研究 . 42 果與分析 . 43 、 P、 K 養(yǎng)分對降解菌在土壤中作用效果的影響 . 43 解菌與植物聯(lián)合的作用效果 . 44 論 . 46 第五章 降解菌 因組文庫的構建和 解基因的篩選 . 48 驗材料 . 48 株與質(zhì)粒 . 48 養(yǎng)基和抗生素 . 48 溶液、緩沖液和試劑 . 49 驗方法 . 49 粒 提取 . 49 因組 提取 . 50 解菌 香環(huán)羥基化雙加氧酶序列擴增 . 51 ?；蚪M文庫的構建 . 51 果與分析 . 53 加氧酶 大亞基和 小亞基的序列分析 . 53 枝桿菌基因組提取和基因組 分酶切片段的制備 . 54 枝桿菌 因組文庫的構建 . 55 帶 解基因的克隆子的篩選 . 56 論 . 57 第六章 全文結論 . 58 參考文獻 . 60 致謝 . 66 作者簡歷 . 67 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 環(huán)芳烴 a)并 a芘 bp 基對 合酶鏈 式反應 核糖核酸酶 十六烷基三甲基溴化銨 十二烷基硫酸鈉 脫氧核苷三磷酸 三（羥甲基）氨基甲烷 落形成單位 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 多環(huán)芳烴微生物降解的研究進展 1 第一章 多環(huán)芳烴微生物降解的研究進展 多環(huán)芳烴（ 指一類由兩個或兩個以上苯環(huán)以線狀、角狀或成簇形式構成的獨特的持久性有機污染物，其中一些 在生物活體內(nèi)產(chǎn)生種種有害效應，包括細胞毒性、遺傳毒性、免疫毒性、致癌、致突和致畸變等 (002)。多環(huán)芳烴主要通過吸煙和污染食物進入人體 ， 其中飲食攝入是主要方面 (004)。 隨著煤、石油 在工業(yè)生產(chǎn)、交通運輸以及生活中被廣泛應用 ， 多環(huán)芳烴的污染已成為世界各國共同關注的問題。多環(huán)芳烴在環(huán)境中的歸宿包括揮發(fā)光氧化化學氧化生物積累土壤吸附及微生物降解，研究表明，微生物降解在該污染物的遷移轉化乃至最終從環(huán)境中消失的過程中占有重要的地位，是環(huán)境中 去除 多環(huán)芳烴最主要的途徑，也 是最有效 、 最廉價的方式 (992)。 因此 ， 微生物 降解 已成為 國內(nèi)外 污染環(huán)境修復的重要手段。 環(huán)芳烴（ 產(chǎn)生和來源 多環(huán)芳烴化合物是在燃燒或熱解 過程中產(chǎn)生 的 ，但因其種類復雜繁多，其形成機制至今尚未完全了解，根據(jù)目前研究結果可分成下列兩種機制： 1 熱解或不完全燃燒 形成是自由基在火焰中發(fā)生化學反應。自由基起源于碳氫化合物的不完全燃燒，經(jīng)過活性大、反應快的自由基催化和環(huán)化等化學反應機制后生成 大利亞學者 1960)曾推論碳氫化合物在熱解過程中逐漸由 乙炔 合成 機物在高溫缺氧下裂解產(chǎn)生碳氫自由基結合成乙炔，由乙 炔 形成乙烯基乙炔或 1,3后生成乙基苯，再進一步結合成丁基苯和四氫化萘，最后通過 中間體形成苯并 a芘 (英文縮寫為 其報道顯示甲苯、乙苯、丙苯及丁苯經(jīng)熱解反應后，會產(chǎn)生大量的苯并 a芘及中間產(chǎn)物丁苯，但結構復雜的碳氫化合物并不須經(jīng)由裂解反應形成小分子，只需打斷幾個鍵來進行熱合成和氫反應，即可生成 他的同事提出的苯并 a芘合成步驟如圖 1示。 圖 1并 a芘合成步驟 國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 多環(huán)芳烴微生物降解的研究進展 2 任何含碳有機物的燃燒反應都有可能促使 生，例如：含脂肪的肉類在燒烤時與火焰接觸后即有可能生成 著 于肉類上。 人（ 1985）也指出，在熱解過程中，若有機分子具有苯環(huán)結構時，苯環(huán)和苯基分子均將大量生成，苯與苯基經(jīng)聚合反應后則會生成 發(fā) 生熱解反應的溫度很廣，但是在高溫和低溫時 的 作用 又不甚相 同。在高溫下的主要反應為高分子量 的反應物經(jīng)由斷鍵和脫氫，而形成活性大且不穩(wěn)定的低分子量分子，而在低溫時則是進行分子聚合反應。 2 碳化過程 不是只能由高溫才能生成 ， 在低溫（ 200 以下）和高壓下經(jīng)過幾百年的時間， 同碳化過程產(chǎn)生。這種轉化過程與熱解相似，但因溫度的關 系，反應極慢，例如像石油及煤中都具有 其前驅(qū)物。 環(huán)境中 來源 很多，其主要來源可分為自然產(chǎn)生和人為產(chǎn)生兩種，以人為活動貢獻最多。 1 自然產(chǎn)生 自然界有很多自然現(xiàn)象會產(chǎn)生 火山爆發(fā)、森林火災、微生物的生 化作用和光化學作用。同時自然界本身存在的一些物質(zhì)如石油、煤、 瀝青、木榴油和 柏 油等自身也含有多環(huán)芳烴類物質(zhì)，這些 會通過各種方式排到環(huán)境中。這些自然現(xiàn)象所產(chǎn)生的 于其具有偶然性，而且其對環(huán)境的影響會受到人類活動的干擾，很少有人研究這些自然現(xiàn)象所產(chǎn)生的 環(huán)境的影 響 (夏北成 ,2002)。 2人為產(chǎn)生 雖然自然現(xiàn)象會產(chǎn)生一定量 是人類活動是現(xiàn)在環(huán)境中 前 (1) 在焦化煤氣、有機化工、石油工業(yè)、煉鋼煉鐵等工業(yè)所排放的廢棄物中有相當多的多環(huán)芳烴 ， 其中焦化廠是排放多環(huán)芳烴最嚴重的一類工廠。監(jiān)測數(shù)據(jù)表明 ， 作為多環(huán)芳烴污染指數(shù)的苯并 a ， 大大高于 的國家排放標準 (岳敏 ,2003)； (2)城市廢棄物 （ 其中含有大量紙張、塑料等 有機原料 )的焚燒過程 (003)；（ 3）交 通業(yè)如機動車中柴油機、汽油機的使用 (002)； （ 4）食物烹飪和家用燃料的燃燒，這是造成室內(nèi) 川張林 ,1997)。 雖然環(huán)境中 是化石燃料燃燒及城市生活 垃圾焚燒等過程是其主要來源 。 理化特征 分異構體很多，僅差兩個氫原子的同環(huán)化 合 物也很多，目前探明的 00多種。 其極性通常很低，當連接的苯環(huán)數(shù)目越多時，在水中的溶解度也越 低。 當水中的溶解度越低，則正辛醇水的分配系數(shù)（ 越大，且隨著環(huán)數(shù)越多，則 因此 環(huán)境中存在 ， 時間越長 ， 遺傳毒性越高 ， 致癌性增強 ， 并能通過食物鏈在動、植物體內(nèi)逐級富集 ， 對人體健康具有非常大的危害。 美國環(huán)保局在上個世紀 80年代已將 16種不帶分支的多環(huán)芳烴列入優(yōu)先污染物名單中。我國也把 多種 多環(huán)芳烴列入環(huán)境污染物的黑名單中 。 表 16 種美國環(huán)?？偩?( 優(yōu)先監(jiān)測污染物 結構和性質(zhì) 。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 多環(huán)芳烴微生物降解的研究進展 3 表 16 種 結構和性質(zhì) 6 合物名稱 結 構 式 分 子 量 熔點 沸點 溶 解 度 氣壓 萘 128 81 218 32 2300 0 152 93 270 2000 0 氫 苊 154 96 279 5 ) 21000 0 166 117 294 5000 0 178 101 340 9000 0 178 216 340 25 ) 28000 610蒽 202 111 383 25 ) 0 5 0 202 156 404 25 ) 210 5 0 228 256 448 25 ) 410 5 0并 a蒽 228 162 435 25 ) 410 5 0并 k熒蒽 252 217 481 10 6 0并 b熒蒽 252 168 481 10 6 0并 a芘 252 177 496 25 ) 106 0 1,2,3 并芘 276 163 534 10 7 0苯并a,h蒽 278 270 535 25 ) 106 0并g,h,i苝 276 278 542 07 0 危害 早在公元 1775 年，英國 人 觀察 到 煙囪清潔工因長期 曝露在煤 塵 中而 導 致 陰 囊病 變 的例子 ， 提出煤油燃 燒后 的 產(chǎn) 物具有致癌性的看法 。 但 直 到 1933 年才由 出致癌物 1976 年 國際 上已 確認 具致癌性的 少有三十 種 以上 ， 成為 目前世界已知的 致癌化 學 物最 龐 大的一群。 萘是 族中的 第 一個成員，是最普通的微量污染物。 萘對于實驗動物的毒性特征已經(jīng)被深入研究和報道 (001; 997)。萘能共價結合于肝臟、腎和肺部組織，導致其毒性增加 ； 人體急性 萘 中毒會導致溶血性貧血 ；還會 抑制線粒體的呼吸 (2001)。長期與萘接觸的職業(yè)工人，皮膚和眼睛會產(chǎn)生變化。菲是已知的人類皮膚的光敏劑 和溫和的過敏原，在特殊情況下會引起細胞 突變 ，也 是姐妹染色體交換的微弱誘導