.,基因工程,.,設(shè)想一,能否讓水稻植株也能夠固定空氣中的氮？,能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？,設(shè)想二,能否讓微生物產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？,設(shè)想三,.,“基因工程”技術(shù),即根據(jù)人類的意愿定向改變生物-令人神往!,.,基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：,普通棉花(無抗蟲特性),蘇云金芽孢桿菌,獲取,抗蟲基因（目的基因）,與運載體DNA拼接導(dǎo)入,棉花細(xì)胞(含抗蟲基因),棉花植株(有抗蟲特性),基因工程實例:,.,什么叫基因工程？,基因工程是指按照人們的愿望,進行嚴(yán)格的設(shè)計,并通過在生物體外進行DNA重組等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的,因此又叫做DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù).,（一）基因工程的概念,.,基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù),生物體外,基因,DNA分子水平,人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品,切割,拼接,導(dǎo)入,表達,基因重組,基因工程的若干問題:,.,DNA重組技術(shù)(基因工程)的基本工具,做工程是需要工具的.,.,前面介紹的利用基因工程培育抗蟲棉的主要步驟有哪幾個?,步驟一：,從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來抗蟲基因(目的基因).,步驟二：,抗蟲基因與運載體DNA連接,步驟三：,抗蟲基因?qū)胧荏w(普通棉花)細(xì)胞,思考:,提示:共四步;步驟四是“檢測和鑒定”.,.,上述的三個步驟中各需要什么工具？,步驟一的工具：步驟二的工具：步驟三的工具：,“分子手術(shù)刀”限制性內(nèi)切酶“分子縫合針”DNA連接酶“分子運載車”載體,這里的“分子”是指_分子.,DNA(目的基因、載體),.,這三種工具的作用各是什么?,.,1.限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”,限制酶主要是從原核微生物中分離純化出來的。能識別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間(此處叫“切點”)的磷酸二酯鍵斷開(注意:不是氫鍵).,（二）DNA重組技術(shù)的基本工具及其作用,注意:一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列,并且能在一個特定的切點上切割DNA分子。,即：特異性.(注意:特異性表現(xiàn)在兩個方面.),.,A,A,T,T,G,C,C,T,T,A,A,G,DNA雙鏈及“磷酸二酯鍵”,磷酸二酯鍵,.,1.大腸桿菌(EcoR)的一種限制酶能識別的脫氧核苷酸序列是(用堿基表示)_;切點在_之間。,限制酶,看圖回答:,GAATTC,G和A,2.若從切點處切開,形成的兩個DNA片斷是怎樣的?,.,限制性內(nèi)切酶的特異性表現(xiàn)在:特定的核苷酸序列-是“回文序列”(?).特定的切點.,.,被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端.,注意:切口處的兩條單鏈一長一短.伸出來的那一條長鏈叫黏性末端,.,限制酶,在G和A之間被限制酶切斷的是化學(xué)鍵是_.,.,“黏性末端”和“平末端”,當(dāng)限制酶在它識別序列的中心軸線的兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是黏性末端.而當(dāng)限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，產(chǎn)生的則是平末端。,.,.,1.要想獲得某一個特定性狀的基因(即”目的基因”)必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？,要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性末端.,2.如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，產(chǎn)生黏性末端相同嗎？,會產(chǎn)生相同的黏性末端.,思考:,.,.,你是否想過?限制酶是否會切割自己細(xì)胞里的DNA呢?為什么?這對于其自身有意義嗎?,.,DNA連接酶的種類(根據(jù)來源分)及其在功能上的異同.-見課文P5.,來源,功能,同,異,名稱,E.ColiDNA連接酶,T4DNA連接酶,大腸桿菌,T4噬菌體,形成磷酸二酯鍵,只能:互補的黏性末端,黏性末端和平末端均可,.,顯然,若將上述兩者的黏性末端黏合(連接)起來，就似乎可以合成新的DNA分子(重組DNA分子)了,用什么工具連接呢?這個工具是怎樣將兩者連接起來的?,.,2.DNA連接酶“分子縫合針”,.,DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口(注意位置)連接起來，這樣一個重組的DNA分子就形成了.,思考:DNA連接酶的作用是使斷口處的相鄰的兩個脫氧核苷酸之間形成_鍵.,.,.,異:DNA連接酶:是將幾個DNA片段連接起來;不需DNA模板.DNA聚合酶:則是將脫氧核苷酸連接(聚合)成DNA;需以DNA的一條鏈為模板.,提示:注意比較基因工程中的DNA連接酶和DNA復(fù)制中的DNA聚合酶的作用有何異同?,同:兩種酶都是形成磷酸二酯鍵.,.,-導(dǎo)入過程需要運輸“目的基因”的工具載體。,如何將目的基因(如上例中的“抗蟲基因”)導(dǎo)入受體細(xì)胞(即接受目的基因的生物的細(xì)胞,如上例中的棉花細(xì)胞)？,注意:一般地,不能將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞.,.,載體是什么(生物化學(xué)成分)?它從哪里獲得?它是如何承載目的基因的?,.,3.基因進入受體細(xì)胞的載體-“分子運輸車”.,常用的運載體主要有兩類：1）質(zhì)粒:一些細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)里的質(zhì)粒.2）病毒:噬菌體(即細(xì)菌病毒)或某些動、植物病毒.,.,什么是質(zhì)粒?,是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于細(xì)菌染色體(即原核的DNA)之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子.質(zhì)粒是基因工程最常用的載體.絕大多數(shù)細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子。有的一個細(xì)菌中有一個，有的一個細(xì)菌中有多個.,小結(jié):質(zhì)粒是小型、環(huán)狀的DNA分子.,.,最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素的標(biāo)記基因。質(zhì)粒的存在與否對宿主細(xì)胞生存沒有決定性作用，但復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。,質(zhì)粒的一種:大腸桿菌的質(zhì)粒,注意:能充當(dāng)載體的是大腸桿菌的質(zhì)粒,而不是大腸桿菌.,.,載體的作用有哪些？,1.作為運輸工具，將目的基因(如抗蟲基因)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞(如棉花細(xì)胞)中去。2.利用載體在受體細(xì)胞(如棉花細(xì)胞)內(nèi)，對目的基因(如抗蟲基因)進行大量復(fù)制。,.,作為載體必須具備哪些條件？,1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）載體DNA必須有一個或多個限制酶切點，以便目的基因插入到載體上去。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進行篩選。如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。載體DNA必須是安全的,不會對受體細(xì)胞有害,或不能進入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去;5)載體DNA分子大小應(yīng)適合,以便提取和在體外進行操作,太大就不便操作.,.,雙基練習(xí)：,一、基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望,進行嚴(yán)格的設(shè)計,通過體外_和_等技術(shù),賦予生物以心得遺傳特性,創(chuàng)造出符合人們的需要的新的_和_.又叫做DNA的重組技術(shù).二、DNA重組技術(shù)的基本工具1.限制性核酸內(nèi)切酶-“分子手術(shù)刀”(1)主要來源:從_生物中分離出來的.(2)特點:能夠識別DNA特定的核苷酸序列,切開,.,兩個_之間的_.(3)DNA末端:限制酶切割DNA產(chǎn)生的DNA末端有兩種形式:_和_.2.DNA連接酶-“分子縫合針”(1)作用:恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_.(2)種類:E.coliDNA連接酶:只能縫合DNA的_T4DNA連接酶:既可縫合DNA的_,又可縫合雙鏈DNA的_.,.,3.基因進入受體細(xì)胞的載體-”分子運輸車”(1)載體的種類質(zhì)粒:是一種裸露的,結(jié)構(gòu)簡單,獨立于細(xì)菌染色體之外,并能夠自我_能力的雙鏈_DNA分子;_._.(2)載體的特點能夠在細(xì)胞內(nèi)_;有一個或多個_切割位點,便于供源DNA的插入.具有_基因,供重組DNA的鑒定和選擇.,.,基因工程的基本操作程序,.,基因工程的基本操作流程,.,基因工程的基本操作程序主要包括四個基本步驟：,1）目的基因的獲取2）“基因表達載體”的構(gòu)建3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(即“轉(zhuǎn)化”)4）目的基因的檢測與鑒定,.,.,步驟一：目的基因的獲取,什么叫目的基因?主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因.,.,獲取目的基因的途徑有哪些?,1.從“基因文庫”中獲取.2.利用“PCR技術(shù)”擴增.3.直接人工合成(適合于基因較小且已知其核苷酸順序),-見課文.,共三條.,.,從基因文庫中獲取“目的基因”：,什么叫“基因文庫”?,分為:1.基因組文庫:基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.2.部分基因文庫:基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.如cDNA文庫.,將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary),類似從圖書館里取書.,.,.,利用PCR技術(shù)擴增“目的基因”.,1.概念:PCR即“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”,是一種在生物體外復(fù)制特定DNA片斷的技術(shù).2.原理:DNA的半保留復(fù)制.3.過程:(見圖).4.優(yōu)點:大量獲取目的基因.(指數(shù)式擴增,近2n),.,提示與思考:1.圖中的“模板DNA”就是已知核苷酸序列的目的基因.2.引物是人工合成的,與模板DNA(即目的基因)互補,作用是使_.3.加熱的作用是使_.4.聚合酶(Tap酶)是指_(選:DNA聚合酶;RNA聚合酶),其特點是_.5.原料是_.6.每擴增一次,目的基因的數(shù)目增加_.7.“退火”,DNA解鏈,.,提示:PCR的基本操作(過程):PCR是一種反復(fù)循環(huán)的DNA合成反應(yīng)過程,其基本反應(yīng)有三個步驟：1.變性:通過加熱(高溫)使模板DNA完全變性成為單鏈,同時引物自身和引物之間存在的局部雙鏈也得以消除.2.退火:將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA退火結(jié)合；3.延伸:將溫度升高,熱穩(wěn)定DNA聚合酶(即耐高溫)以dNTP(即脫氧核苷酸)為底物(即原料)催化合成DNA鏈延伸.以上三步為一個循環(huán)，新合成的DNA分子又可以作為下一輪合成的模板，經(jīng)多次循環(huán)后即可達到擴增DNA片段的目的.,顯然,每循環(huán)(擴增)一次,就需要添加一次(共兩個)引物.,.,提示:兩個引物、一個模板.,.,人工合成目的基因,如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成。,1.通過反轉(zhuǎn)錄法合成:,又分為:,目的基因的mRNA(已知),單鏈DNA,雙鏈DNA(即目的基因),反轉(zhuǎn)錄,合成,.,2.直接合成.,根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,推測,推測,目的基因,化學(xué)合成,.,在獲取目的基因后,如何將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞呢?能直接導(dǎo)入嗎?,必須借助載體!,.,怎樣借助載體將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞呢?,必須把目的基因“裝到”載體上!,如何裝?,.,步驟二：基因表達載體的構(gòu)建.,什么是“基因表達載體”?,就是已經(jīng)裝上了(含有)目的基因的載體.,.,1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。2）用同一種限制酶切取目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,目的基因與載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程,基因表達載體的構(gòu)建步驟.-見課文.,.,提示與思考:1.“基因表達載體”就是已插入目的基因的載體.,2.看左圖回答:基因表達載體由哪些部分組成?_.,.,3.啟動子:是有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片斷,位于目的基因的首端,是RNA聚合酶的識別和結(jié)合的部位.有它才能驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄出MRNA.最終獲得蛋白質(zhì).(不是復(fù)制!)4.終止子:位于目的基因的端尾端.作用是終止轉(zhuǎn)錄.5.標(biāo)記基因:是為了鑒別受體細(xì)胞里是否已經(jīng)含有目的基因,從而將含目的基因的細(xì)胞篩選出來.如“抗生素基因”、“熒光標(biāo)記基因”等.(醒目的,特別的標(biāo)記)6.復(fù)制原點是載體復(fù)制(不是轉(zhuǎn)錄)時的起點.,.,什么叫轉(zhuǎn)化?將目的基因進入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定(如復(fù)制)和表達(即轉(zhuǎn)錄、翻譯為特定蛋白質(zhì)及表現(xiàn)特定性狀等)的過程.,受體細(xì)胞是指什么?它包括哪些細(xì)胞?,提示:注意,目的基因是隨著基因表達載體被導(dǎo)入受體細(xì)胞的,而不是被單獨導(dǎo)入的.,步驟三：轉(zhuǎn)化-將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,.,1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞-農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法.,.,提示:(1)農(nóng)桿菌及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法:農(nóng)桿菌是土壤中的一種細(xì)菌.能感染雙子葉植物和裸子植物.其細(xì)胞里含Ti質(zhì)粒,該質(zhì)粒上含有一段DNA叫“T-DNA”(叫“可轉(zhuǎn)移的DNA”).將目的基因插入到該“T-DNA”中,通過使農(nóng)桿菌感染植物,而將目的基因轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞并將其插入到植物細(xì)胞中的染色體的DNA上.,(2)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法還有:基因槍法和花粉通道法.,.,將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的其他方法:花粉管通道法基因槍法.,.,2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞-顯微注射法.,.,用口徑為1m的DNA注射器，將大量目的基因片段(注意:是含目的基因的“基因表達載體”,而不是裸的目的基因)注入到受精卵的核內(nèi)，然后把經(jīng)過注射的受精卵移植到另一只雌性動物的子宮內(nèi)，使受精卵發(fā)育為轉(zhuǎn)基因動物。,什么叫顯微注射技術(shù)？,.,3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞感受態(tài)細(xì)胞法.,大腸桿菌細(xì)胞是最常用的微生物受體細(xì)胞.轉(zhuǎn)化方法是:首先用Ca2+(如CaCL溶液)處理細(xì)胞,以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性,使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞.第二步是將重組表達載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在一定的溫度下促進感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過程.,.,1）將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重組質(zhì)粒進入受體細(xì)胞。3）目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。,.,導(dǎo)入過程：運載體為質(zhì)粒，受體細(xì)胞為細(xì)菌,受體細(xì)胞：細(xì)菌,細(xì)胞壁的通透性增大,重組質(zhì)粒進入受體細(xì)胞,目的基因隨受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制,氯化鈣,大量的目的基因,.,通過轉(zhuǎn)化以后,目的基因是否真正插入到了受體細(xì)胞的DNA中，是否能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達呢?,這只有通過檢測、鑒定才能得知.,.,步驟四：目的基因的檢測與鑒定,怎樣檢測和鑒定?,-見課文.,思考:有哪幾種檢測方法?每一種方法的原理是什么?步驟如何?,.,提示:目的基因的檢測與鑒定,檢測,鑒定,檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,檢測目的基