密級 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 馬傳染性貧血病驢白細(xì)胞弱毒感染性 分子克隆及其衍生毒的生物學(xué)和 分子生物學(xué)特性分析 In n of 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士論文 摘要 I 摘 要 為了闡明馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗（ 弱及免疫保護的分子機制，給其它慢病毒的免疫預(yù)防提供借鑒，本實驗室構(gòu)建了 染性分子克?。麨?獲得其衍生病毒（命名為 同 時對我國馬傳染性貧血病毒強弱毒株進行了序列分析。在此基礎(chǔ)上，以 骨架，構(gòu)建了馬傳染性貧血病毒強 /弱 合毒感染性分子克?。麨?并獲得了其衍生病毒（命名為 本研究對 過對臨床和病理組織學(xué)變化、各結(jié)構(gòu)蛋白抗體、感染馬體內(nèi)病毒載量的監(jiān)測以及 因在感染馬體內(nèi)的變異規(guī)律進行了研究。 將 7 匹 性健康馬分為 4 組，第 1 組（ 4#和 5#馬）接 50合毒（ 第 2 組（ 6#和 7#馬）接種 505隆毒（ 第 3 組（ 8#）接種 505同時設(shè)第 4 組（ 1#和 2#馬）作為非接種對照組。接種后第 220 天，除了2#馬攻毒劑量為 30清稀釋度外 ， 其它 所有馬均用 30清稀釋度 毒遼寧株（ 行攻擊。 攻毒前后對每匹馬進行體溫監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在接種后，所有試驗馬未見體溫升高現(xiàn)象，說明我們所用的毒株接種后對馬是很安全的，用 換 到的嵌合病毒對馬也沒有表現(xiàn)出臨床致病性； 攻毒后， 非接種對照組 1#和 2#馬體溫均出現(xiàn)典型的稽留熱，并分別于攻毒后第 134 天和 19 天死亡， 病理剖檢發(fā)現(xiàn)死亡馬呈現(xiàn)典型的馬傳貧的病理組織學(xué)變化。第 1 組和第 3 組（嵌合毒接種組和疫苗毒接種組）在攻毒后未見任何臨床變化，證明嵌合毒和疫苗毒接種馬得到了免疫保護。第 2 組（克隆毒接種組）中的 6#馬在攻毒后沒有異常變化，而 7#馬卻經(jīng)歷 6 次發(fā)熱期，最終于攻毒后第 185 天死亡，但開始發(fā)熱和死亡的時間均比對照組明顯滯后，病理剖檢發(fā)現(xiàn)發(fā)病死亡馬具有典型的馬傳貧的病理組織學(xué)變化。 在攻毒后第 450天剖殺所有存活馬，并進行病理組織學(xué)檢查，結(jié)果表明所有免疫保護馬均未見任何異常變化。 在試驗過程中，我們利用 法對不同試驗馬攻毒前后血清中針對 構(gòu)蛋白 及 抗體進行了檢測。 攻毒前各接種馬抗 體水平極低或檢測不到， 體上升后又逐漸下降， 體緩慢上升后并持續(xù)在較高水平。攻毒后發(fā)病馬（ 1， 2， 7）體內(nèi)抗 體均顯著升高，并持續(xù)至死亡， 6和 8馬體內(nèi)抗 體也有升高外。攻毒后，嵌合病毒免疫馬（ 4和 5）體內(nèi)抗這五種結(jié)構(gòu)蛋白抗體和攻毒前沒有明顯變化，表明攻毒后沒有回憶反應(yīng)，表明其 免疫效果可能優(yōu)于其它各接種組 。 抗 體變化在發(fā)病馬和未發(fā)病馬間無明顯差異，提示 體變化與疾病進程沒有直接的關(guān)系。 利用實時定量 術(shù)對攻毒前后馬外周血白細(xì)胞中 病毒 馬血漿中病毒載量進行了監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)感染馬體內(nèi)前病毒 量與 體水平有一定的相關(guān)性，血漿中病毒 載量與 體水平成正相關(guān)。發(fā)病馬血漿病毒 過 106 拷貝 /漿，而免疫保護馬血漿中病毒 量較低（ 100貝 /漿）。免疫保護馬在攻毒后3 個月血漿病毒 到很低水平，用實時定量 法檢測不到。但在整個試驗過程中，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士論文 摘要 試驗馬外周血白細(xì)胞中均能檢測到 病毒 明馬傳染性貧血病毒以前病毒形式長期潛伏存在。 由于 因組具有高度變異性，特別是 因 的變異可能與病毒的致病性及免疫保護性有著密切的關(guān)系。因此，本實驗對攻毒前后馬外周血白細(xì)胞中 病毒的 括 R 區(qū)）和 括 3,4,5 在內(nèi)的 580 個核苷酸）基因進行了序列測定和分析，發(fā)現(xiàn) 馬體內(nèi)存在 3 種序列類型，即強毒型（序列與 致）、弱毒型（序列與 致）和中間型（ 混合序列）。 對 毒感染性分子克隆及其衍生毒免疫后攻毒馬長時間跟蹤，并采血樣進行 因序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬體內(nèi)同時存在強毒型和弱毒型的序列以及少量的強弱毒衍化的中間型序列。當(dāng)強毒型 因序列占絕對優(yōu)勢時，馬表現(xiàn)臨床發(fā)病。 對 基序分析表明，強毒型 增強子高變區(qū)沒有 序，而在 合處有 1 個 序 ，而弱毒 增強子高變區(qū)有2 個 序， 在 合處 沒有該 基序 。推測該基序的變化對病毒的致病性可能有一定的關(guān)系。對 列分析發(fā)現(xiàn)， 在攻毒后獲得免疫保護的馬體內(nèi)存在著大量的帶有強毒特征，但在其中發(fā)生移碼突變和 /或出現(xiàn)終止密碼的 因序列，這些缺陷型前病毒的大量存在可能 與免疫保護存在一定的關(guān)系。在我們所測的 175 個氨基酸中，強毒型 列比弱毒型 列多 4 個糖基化位點，而中間型位于二者之間，由于糖基化位點可以屏 蔽抗原位點，使病毒逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，因此糖基化的數(shù)目和位置對病毒致病性有著一定的影響。 關(guān)鍵詞：馬傳染性貧血病病毒，感染性分子克隆，嵌合病毒，實時定量 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士論文 摘要 n n to of of as on a by as In 4# #) 6# #) 1# #) of no of TR of TR t in (2#) (1#)of 9 34 no , # no # of 85 1#, 2# #) IA at 4#, 5#, 6# #) 50 no p9 on by p9 or to at of in ， 2 to in . in # # or no no so to no NA NA in of 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士論文 摘要 IV by CR We NA of NA to 06ml in in to NA be as TR By ed TR we TR In TR be in TR of in is 3 So it is be By of we in of or of an in of By 175aa in of of in 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士論文 目錄 1 目 錄 摘 要 . I . 言 . 1 文獻綜述 . 2 一、 分子生物學(xué)研究進展 . 4 1 囊膜糖蛋白 變異與機體體液免疫的成熟 . 4 因是高度變異的 . 4 白的糖基化 . 5 體體液免疫的成熟 . 6 2 基質(zhì)蛋白 位與 機體的細(xì)胞免疫 . 7 因及其編碼的蛋白 . 7 質(zhì)蛋白 位 . 8 激機體所產(chǎn)生的細(xì)胞免疫 . 8 3 編碼區(qū) 高度變異性與細(xì)胞因子的關(guān)系 . 8 變異性 . 8 細(xì)胞因子的相互作用 . 9 相互作用 . 10 二、慢病毒疫苗研究進展與展望 . 11 三、小結(jié) . 12 研究報告 . 13 實驗一 隆毒和嵌合病毒免疫馬攻毒前后體內(nèi)各結(jié)構(gòu)蛋白抗體水平及病理組織學(xué)的研究 . 13 1 材料 . 13 株 . 13 驗動物 . 14 劑 . 14 器 . 14 2 方法 . 15 驗分組及病料采集 . 15 清抗體的檢測 . 15 試驗馬解剖學(xué)變化 . 15 試驗馬各臟器病理組織學(xué)檢測 . 16 鐵試驗 . 16 3 結(jié)果 . 16 種及攻毒后各匹馬的臨床反應(yīng) . 16 毒前后各結(jié)構(gòu)蛋白抗體的變異 . 18 實驗二 利 用 外周血白細(xì)胞 病毒及血漿中病毒 量的測定 . 31 1 材料 . 31 株 . 31 驗動物 . 32 粒 . 32 劑 . 32 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士論文 目錄 1 胞培養(yǎng)用試劑 . 32 器設(shè)備 . 32 2 方法 . 33 驗分組及病料的采集 . 33 外周血白細(xì)胞的制備 . 33 血漿的處理 . 33 病毒 提取 . 33 毒 提取 . 33 物的設(shè)計 . 34 準(zhǔn)曲線的建立 . 34 準(zhǔn)曲線的建立 . 34 3 結(jié)果 . 36 準(zhǔn)曲線的建立 . 36 準(zhǔn)曲線的建立 . 36 毒 測結(jié)果 . 37 毒 測結(jié)果 . 39 實驗三 合病 毒接種馬攻毒前后馬外周血白細(xì)胞中 . 42 病毒 列的測定及分析 . 42 1 材料 . 42 株 . 42 驗動物 . 43 劑 . 43 器 . 43 2 方法 . 43 驗分組及病料的采集 . 43 種和攻毒后各試驗馬不同時期外周血白細(xì)胞前病毒 提取 . 43 套式 增各試驗馬不同時期外周血白細(xì)胞前病毒 . 43 式 增各試驗馬不同時期外周血白細(xì)胞前病毒 因 . 44 物的克隆測序 . 44 列的分析 . 44 3 結(jié)果 . 44 疫及攻毒后各試驗馬不同時期外周血白細(xì)胞前病毒 擴增及克隆 . 44 疫及攻毒后各試驗馬不同時期外周血白細(xì)胞前病毒 因的擴增及克隆 . 45 疫及攻毒后各試驗馬不同時期外周血白細(xì)胞前病毒 序列比較分析 . 45 疫及攻毒后各試驗馬不同時期外周血白細(xì)胞 前病毒 列變化規(guī)律 . 55 疫及攻毒后各試驗馬不