密級(jí) 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 耐熱大豆 大腸桿菌中的表達(dá) of . I 摘 要 泛存在于各種高等植物和微生物中，它能夠作用于多糖的非還原性末端，順次切割相隔的 4 糖苷鍵，生成 糖。耐熱淀粉酶在食品及飲料工業(yè)中具有很重要的應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)樘岣叻磻?yīng)溫度不僅可以增加淀粉的可溶性，而且可以防止雜菌的生長，這對(duì)于降低生產(chǎn)成本是十分有利的。 大豆 圍廣，熱穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì) 184 份 核心種質(zhì)大豆的酶活力和熱穩(wěn)定性進(jìn)行了測定。篩選得到的 熱穩(wěn)定性最佳的 6 種酶均具有較寬的作用溫度和作用 中 5 種 酶的 半衰期（ 63、 過 5h，表明這些大豆 具工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。 以篩選得到的大豆總 通過 到大豆?jié)?990的 測序結(jié)果表明該序列編碼 496個(gè)氨基酸。 構(gòu)建表達(dá)載體 在大腸桿菌中將 濟(jì) 99 組酶的分子量大小為 5030誘導(dǎo)，胞內(nèi)酶活力可達(dá) 性染色證明：大豆的 僅能在大腸桿菌中表達(dá)出具有生物活性的蛋白質(zhì)，同時(shí)還能將其分泌到胞外；酶學(xué)性質(zhì)測定表明：重組酶的最適反應(yīng)溫度為 60，最適 為 原始酶一致；在 63保溫 5 小時(shí)仍然具有 45以上的初始酶活力，說明該重組 酶具有很好的耐熱性。 關(guān)鍵詞： 大豆， 耐熱 達(dá) It is in in as of of of 84 in We 0% of a 53、 to be to NA an 96 by 0 , be pH a 錄 第一章 引 言 . 1 . 1 機(jī)理 . 1 . 1 . 2 物來源的 . 3 生物來源的 . 4 . 5 物 . 5 生物細(xì)胞的破碎和微生物 . 6 . 6 物 . 6 生物 工程研究 . 6 究目的和意義 . 7 第二章 耐熱大豆 . 9 料與方法 . 9 料 . 9 法 . 9 果與分析 . 11 芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定與酶活力計(jì)算方法 . 11 心種質(zhì)大豆 . 11 心種質(zhì)大豆 . 16 豆 . 17 豆 . 17 大豆 . 18 個(gè)大豆品種所含 . 18 個(gè)大豆品種所含 . 18 長緯度與酶活 力關(guān)系分析 . 19 論 . 19 第三章 耐熱大豆 克隆及序列分析 . 21 料與方法 . 21 料 . 21 法 . 22 果與分析 . 26 物的設(shè)計(jì)方案 . 26 . 26 隆 . 27 豆 . 27 已 知 析 . 31 論 . 31 第四章 大豆 . 33 料與方法 . 33 料 . 33 法 . 33 果與分析 . 37 達(dá)載體的構(gòu)建 . 37 組 . 37 . 39 組酶活力及溫度對(duì)產(chǎn)酶活力的影響 . 40 組酶的酶學(xué)性質(zhì) . 40 論 . 41 結(jié) 論 . 43 參考文獻(xiàn) . 44 致 謝 . 49 作者簡介 . 50 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的統(tǒng)稱，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。它最早實(shí)現(xiàn)了工業(yè)生產(chǎn)，并且是迄今為止用途最廣，產(chǎn)量最大的一個(gè)酶制劑品種。按照水解淀粉方式的不同，淀粉酶主要可分為四大類： 萄糖淀粉酶和解枝酶（異淀粉酶）。 制麥過程中的主要糖化力之一，而且 生產(chǎn)麥芽糖漿和高麥芽糖漿，甜味劑和應(yīng)用于制藥業(yè)等。 構(gòu)特點(diǎn) 稱淀粉 1， 4要來源于植物和細(xì)菌中。根據(jù)氨基酸序列的同源性，分屬糖苷水解酶類的 14 族（ 1995）。 4 糖苷鍵，分解得到麥芽糖，當(dāng)遇到 6 糖苷鍵的分支點(diǎn)時(shí)，則停止不前。因此，當(dāng)以 鏈部分生成麥芽糖，而分解點(diǎn)附近及內(nèi)側(cè)因不能被分解而殘留下來，其分解產(chǎn)物為麥芽糖及大分子 過示蹤水 過程中，糖苷鍵 O O 鍵斷裂，這種情況與 酶作用于底物同時(shí)發(fā)生沃爾登轉(zhuǎn)位反應(yīng)（ 產(chǎn)物由 此稱為 因 能從非還原性末端順序切下麥芽糖，故又稱為“外切”型淀粉酶。 使其還原力直線上升，但不能使淀粉分子迅速的變小，因此，經(jīng) 精化很慢，與碘發(fā)生顯色反應(yīng)只能由深藍(lán)色變淺，而不會(huì)變?yōu)樽仙?、紅色，以至于 無色。 研究表明直鏈淀粉、支鏈淀粉和可溶性淀粉是 于其它底物的分解速率則都有不同程度的降低（ 996； 2003）。 隨著研究的深入和 來越多的 了能夠資源共享和便于交流，人們建立了有效的和非冗長的蛋白質(zhì)序列庫，比較著名的有：國家生物醫(yī)藥研究數(shù)據(jù)庫（ ; 據(jù)庫； 本東京大學(xué)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫；據(jù)庫。所有已知道的 前有許多研究表明大豆 96個(gè)氨基酸組成 (1993； 999)。 目前已知的植物 他都是以單體蛋白 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 2 形式存在（ 003）。利用 圖 1 圖 1大豆 通常認(rèn)為位于分子結(jié)構(gòu)表面的氨基酸由于可以和相鄰的分子發(fā)生作用，所以如果發(fā)生突變就可以部分或完全改變與相鄰分子之間的相互作用（ 000； 001）。 為大豆 催化中心的表面，它們最有可能形成分子間二硫鍵，從而影響分子構(gòu)型。 研究表明表面作用位點(diǎn)的突變的確可以對(duì) 大豆 白表面 點(diǎn)雖多，卻受分子構(gòu)型的影響不會(huì)形成分子間二硫鍵而發(fā)生共聚作用 （ 2003） 。 在大豆 的三維結(jié)構(gòu)中具有一個(gè)和磷酸甘油醛異構(gòu)酶相似的由 8 個(gè) （ / ） 結(jié)構(gòu)圍成的桶狀結(jié)構(gòu)催化活性中心和一個(gè)由 8 個(gè)氨基酸所組成的可移動(dòng)環(huán)。 以和底物結(jié)合并使底物向催化中心底部靠近， 8 個(gè)氨基酸組成的可移動(dòng)環(huán)的作用則是把底物的非還原性末端拉入催化中心，催化中心位點(diǎn)為 1993， 1996； N， 1999，2004）。 與 發(fā)生不可逆失活（ 1968）；而 酸性條件下都可以保持活性（ 1960）。 是它會(huì)受到諸如溫度、 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 3 、溶液中的金屬離子濃度等因素的影響。比如鹽離子、碘化物、氟化物、和重金屬離子可以使 酶不可逆失活；過氧化物和碘等氧化劑使 996） ,不同來源的 物來源的 植物來源的 大麥、小麥、黑麥、和大米等）的種子中，在大豆、玉米和甘薯塊莖中也有存在。另外有報(bào)道在新西蘭水果、紫花苜蓿的根部、芋頭的塊莖、蘿卜的根部以及芥菜的籽苗中都有發(fā)現(xiàn) 1994； 996)。 淀粉作用方式雖都一 樣，但在作用最適 適溫度和等電點(diǎn)上卻有所差異（表 1 表 1前己知的植物來源的 來 源 分子量 ( 10 最適 最適溫度 （ ） 穩(wěn)定的 等電點(diǎn) 薯 197 0 豆 5 麥 芽 菜 58 豌豆 56 麥 56 50 卜根 59 0 高粱 20 0 芋頭塊莖 66&67 0 玉米 65 米 58 5 同植物來源的 3 64等 ,最適溫度也從 30 60有很大差別。就目前所知，谷物來源的 種同工酶（ 1987），他們的活性都不受任何輔酶、金屬離子和輔基的影響，而且它們大都含有一個(gè)巰基基團(tuán)（高粱屬植物除外），這個(gè)巰基基團(tuán)雖然不是 很多的研究表明，它的存在對(duì)于 992； 1996）。 在高等植物中，存在兩種不同活力的 兩種活力的 種是在禾本科植物（如小麥、大麥和黑麥等）的胚乳中以高活力存在的 這類植物的種子在發(fā)芽的時(shí)候， 高；另一種是以一種相對(duì)活性較低的形式普遍存在于植物的各個(gè)組織器官中的 兩種形式的 在其它方面還是有較多的區(qū)別的，而且這兩種 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 4 也有所不同（ 1990），有研究者通過比較分析，推測前一種 994）。 “游離”態(tài)和“結(jié)合”態(tài)兩種形式存在。用水提法可以將高等植物中的“游離”態(tài) 另一部分以“結(jié)合”態(tài)形式存在的 需要還原劑或者蛋白水解酶的幫助，這種“結(jié)合”態(tài) 蛋白 Z 和麥谷蛋白等）結(jié)合而成為復(fù)雜的不溶物質(zhì)。這兩種形式的 %左右（ P. 1998）。 6 個(gè)品種的大麥中提取得到的 果表明不同品種之間的 56 個(gè)樣品的酶活力從 458 1024U/g 不等，均值為738U/g，這與以前的研究結(jié)果一致（ 995； 998） ,這些結(jié)果表明在同一植物的不同品種之間和不同生長地的同一品種之間的 生物來源的 在 1940 年就有研究發(fā)現(xiàn)許多屬于芽孢桿菌屬（ 細(xì)菌具有 發(fā)現(xiàn)多粘芽孢桿菌（ 產(chǎn)生類似于大麥麥芽抽提物的淀粉酶或淀粉酶系。自 1974 年 次確定 外淀粉酶是 繼發(fā)現(xiàn)了能夠產(chǎn)生 這些菌株主要屬于芽孢桿菌屬。近年來，發(fā)現(xiàn)一些放線菌和假單胞菌也能生產(chǎn) 秉旺，1992； 1998）。 細(xì)菌來源的 者只有 30的同源性，而且細(xì)菌來源的 988； 996）?，F(xiàn)將幾個(gè)有代表性的不同微生物來源的 1 表 1目前己知的微生物來源的 來 源 分子量 ( 10 最適 最適溫度 （ ） 穩(wěn)定的 等電點(diǎn) 7 518 67 7 4 5 35 0 V 2 58 0 5 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 5 酶的提純手段一般都是依據(jù)酶的分子大小、形狀、電荷性質(zhì)、溶解度、專一結(jié)合位點(diǎn)等性質(zhì)而建立的。要得到純酶，往往需要將各種方法聯(lián)合使用。下表（表 1出了最常用的純化方法。 表 1用純化方法 物 植物 常規(guī)提取方法有兩種：一種是直接水提法，一般按液料比 1： 10 效果較好，但這也因不同植物和不同粉碎程度而異；另一種方法是在水提液中加入還原劑，這可以提高提取率（蔣高松， 1994；邱宏端， 1995；古海先，1997）。也有研究者嘗試了用甘油法提取 宏端， 1996），這樣得到的 是費(fèi)用過高，無法應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。 由于水提得到的植物中的 淀粉酶，所以要得到純化的 淀粉酶除去，一般比較常用的除去 析法是最早使用的純化方法，目前也常被用作所有提純方法中第一步的粗提方法（ 974；982； 982）。 田亞平單獨(dú)用使用乙醇分級(jí)沉淀的方法提純 用 1： 雜，再用 1： 集沉淀（田亞平， 2003）。這種方法雖然簡單，但是分離效果并不理想， 產(chǎn)物分析結(jié)果也證明了，提純液中還有少量 實(shí)驗(yàn)證明用固定化 B 可以將 0 倍，但得到的酶中含有多種同工酶（ 993）。 實(shí)踐證明要得到高純度的 用疏水色譜離出具有活力的 濾濃縮洗脫液，再用凝膠過濾色譜 分子量大小將 巖， 1998）； 使用的純化方法包括：飽和（ 2淀，過 交聯(lián)葡聚糖柱用凝膠電泳和圓盤電泳分析結(jié)果都只得到一條電泳帶（ 1995）； 丙酮沉淀和免疫親和色譜的方法提純 2001）； 用（ 2淀法和凝膠柱色譜法使酶的總活力提高了 47 倍，回收率達(dá)到了 75，最終酶活達(dá) 2360U/1999）； 純化方法包括（ 2性 質(zhì) 方 法 溶解度 改變離子強(qiáng)度，改變 度，改變介電常數(shù) 電荷極性 離子交換層析，色譜聚焦，電泳，等電聚焦 大小或重量 離心分離，透析超濾，凝膠過濾 親和部位 親和層析，染料配體親和 層析，免疫吸附層析，共價(jià)層析 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 6 淀、濾膜透析、陰離子交換色譜和凝膠色譜法（ Y. 1999）； 山芋的的提取液經(jīng)過離子交換色譜柱和凝膠色譜柱，最后通過 效液相色譜）得到了大小分別為 6667兩種純酶（ 1990），但是這種方法的回收率只有 1，只適合實(shí)驗(yàn)室少量時(shí)制備使用。 生物細(xì)胞的破碎和微生物 微生物 是在純化之前使用的生物材料的破碎法有較大差異：一般植物細(xì)胞破碎多使用機(jī)械法；而生物細(xì)胞的破碎還可以使用超聲波法、凍融法、滲透壓法和酶消化法（袁勤生， 2001）。 在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)等學(xué)科發(fā)展的基礎(chǔ)上， 70 年代初形成了基因工程技術(shù)（又稱為重組 術(shù)）。這項(xiàng)技術(shù)為任何一種生物接受另一種生物的遺傳物質(zhì)并在其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)功能和穩(wěn)定遺傳提供了可能，也為我們?cè)谠嚬軆?nèi)直接操作遺傳物質(zhì)改變基因功能、調(diào)節(jié)基因表達(dá)方式創(chuàng)造了條件。經(jīng)過 30 多年的發(fā)展，基因工程技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)學(xué)科的基礎(chǔ)研究，成為微觀生物學(xué)，甚至宏觀生物學(xué)有力的研究手段。這項(xiàng)技術(shù)也在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化工和環(huán)保等領(lǐng)域結(jié)出了豐碩的應(yīng)用成果。在基因工程技術(shù)的基 礎(chǔ)上已出現(xiàn)了蛋白質(zhì)工程、基因治療、 物和新一代的代謝工程等多個(gè)生物技術(shù)生長點(diǎn)。基因工程技術(shù)展現(xiàn)了越來越廣闊的應(yīng)用前景。 基因工程技術(shù)的核心是基因表達(dá)技術(shù)。至今，人們已建立了許多基因表達(dá)系統(tǒng)，既有原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)，也有真核生物表達(dá)系統(tǒng)。不同的表達(dá)系統(tǒng)各有特點(diǎn)。利用基因工程技術(shù)進(jìn)行 物 利用基因工程方法，對(duì)于植物 性位點(diǎn)以及不同氨基酸位點(diǎn)對(duì)于維持 酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)的作用展開（ 2003）。到目前為止有許多植物的 基因組 核苷酸序列推導(dǎo)得到，它們之間以及和其它植物來源的 前已有研究者利用點(diǎn)突變的方法提高了在大腸桿菌中表達(dá)的大麥 995）。 生物 由于從生物界中直接篩選的原始菌種產(chǎn)酶活力較低，很多學(xué)者用物理和化學(xué)的方法誘變菌種以提高 國內(nèi)方面，在對(duì) 中科院微生物所做了較多的工作。王惠權(quán)和何秉旺以誘變的方法獲得變異株（ ,經(jīng)鑒定為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌。其活力比出發(fā)菌株提 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 7 高了近 300 倍 ,菌株最終產(chǎn)酶活力高達(dá) 20000U/45測定）。除了誘變育種外，他們還嘗試了改變菌種發(fā)酵條件來提高酶活力（何秉旺， 1990），并且以 載體，用鳥槍法從菌種中得到三個(gè)產(chǎn)淀粉酶的重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。其中重組質(zhì)粒 生的淀粉酶的淀粉水解主要產(chǎn)物經(jīng)高壓液相色譜分析為麥芽糖。在對(duì)重組質(zhì)粒 苷酸序列推導(dǎo)出氨基酸序列后同已報(bào)道的微生物來源的 2、 狀芽孢桿菌（ 熱硫羧狀芽孢桿菌（ 蠟狀芽孢桿菌（ 麥和大豆的同源性分別為 98%、 98%、 54%、 49%、 50%、 36%和 36%（陳煒， 1998）。 國外對(duì)于 且做的研究工作也要更深入一些。日本神戶大學(xué)新家龍教授對(duì)早期選育方面的研究工作做出了較大貢獻(xiàn)，他從蠟狀芽孢桿菌 出發(fā)菌株，通過誘變，其產(chǎn)酶活力提高 200 倍，酶活力可達(dá) 3600U/1979), 但是這樣的產(chǎn)酶活力離工業(yè)生產(chǎn)距離還較大；高崎義幸也篩選到了一株蠟狀芽孢桿菌的突變株（ B. ,這株菌不僅能產(chǎn)較高的 同時(shí)還能產(chǎn)茁酶多糖菌 (1983)。為了配合 多科學(xué)工作者對(duì)水解淀粉 6茁霉多糖酶（ 研究給予了很大的注意(1982)。使用復(fù)合酶水解淀粉可以產(chǎn)生麥芽糖 90%以上，這為淀粉酶工業(yè)增添了新的生命力。 利用基因工程技術(shù)提高菌種的產(chǎn)酶能力，不僅使菌種的產(chǎn)酶量有較大的提高，而且能夠改變酶的性質(zhì)。這促進(jìn)了研究工作將理論與實(shí)踐緊密結(jié)合，縮短了從探索研究到工業(yè)應(yīng)用的時(shí)間，克服了傳統(tǒng)育種方法的盲目性。 究目的和意義 如前所述， 雖然多年以來國內(nèi)外研究者一直注意從微生物中提取 期通過物理、化學(xué)方法誘變和改變菌種的發(fā)酵條件來提高酶活，近年來也利用基因工程手段使菌種的產(chǎn)酶量有了較大的提高，性質(zhì)也有一定改良，但目前仍未見工業(yè)化使用微生物 前用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的 產(chǎn)成本較高的缺點(diǎn)。 植物中提取 本低廉，而且相對(duì)而言從大豆中提取的 熱性好，作用 目前國內(nèi)外的大型酶制劑生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的工業(yè)用的 高等植物，主要是從大麥，小麥，麥芽，甘薯和大豆中提取。日本、美國、丹麥等國家對(duì)植物 其是日本以大豆為原料生產(chǎn) 0 年的歷史；美國用小麥提取的 泛應(yīng)用于生產(chǎn)高麥芽糖漿，麥芽糖醇以及啤酒等產(chǎn)品，取得理想的效果。耐熱淀粉酶在食品及飲料工業(yè)中有很大的應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)楦邷夭粌H可以增加淀粉的可溶性，而且可以防止雜菌的生長，這對(duì)于降低生產(chǎn)成本是十分有利的。 我國是大豆的故鄉(xiāng)，大豆栽培在我國迄今已有 5000 多年的歷史，我國的大豆品種達(dá)千余種。本研究 充分發(fā)揮農(nóng) 科院品種資源優(yōu)勢，對(duì)核心種質(zhì)庫中的 184 個(gè)大豆品種的酶活力和耐熱 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 8 性進(jìn)行測定，并利用分子生物技術(shù)將篩選得到的具有高酶活力和高耐熱性的品種的 因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。 這些研究工作為我國的大豆種植業(yè)和 大豆 為后續(xù)的研究工作奠定了基礎(chǔ)。 中國農(nóng)業(yè)科 學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 耐熱大豆 9 第二章 耐熱大豆 麥芽糖及用于食品加工業(yè)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可用來幫助消化以治療消化功能不全和退化，在飼 料領(lǐng)域可作為飼料添加劑。 物來源的 圍寬，而且在微酸性至中性條件下熱穩(wěn)定性良好，目前 豆是生產(chǎn) 是，有關(guān)我國大豆資源所含 此本文對(duì)我國核心種質(zhì)大豆資源庫中的大豆 料與方法 料 試樣品 大豆核心種質(zhì)于 2003 年種植于北京昌平試驗(yàn)基地，收獲后裝入牛皮紙袋于 4保存。 驗(yàn)儀器 00E, 紫外檢測器為 81 型，分子篩凝膠柱 200000瑞典 司產(chǎn)品，精密恒溫水浴鍋 美國 司產(chǎn)品，粉碎機(jī)、水浴搖床、離心機(jī)等均為國產(chǎn)。 劑 3， 5二硝基水楊酸、可溶性淀粉、麥芽糖及其它試劑均為國產(chǎn)分析純。 法 采用酸性水提法 (參照朱婉華等人的方法略作修改 )：大豆用高速粉碎機(jī)粉碎成粉末，稱取200粉放入 10蓋的離心管中，加入 4餾水，用旋渦混合儀混勻后邊震蕩邊緩慢加入 1 鹽酸溶液（最終 為 然后置于搖床震蕩提取 1h（ 150 轉(zhuǎn) /分鐘，16 20），之后再邊震蕩邊緩慢加入 1 回至中性，最后離心（ 3000 轉(zhuǎn) /分鐘， 10 分鐘）取上清液，此液即為 4冰箱保存，使用時(shí)適當(dāng)稀釋。 中國農(nóng)業(yè)科 學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 耐熱大豆 10 參照 人的方法略作修改。于試管中加入 %可溶性淀粉水溶液和 ， 50預(yù)熱 5加入 當(dāng)稀釋的酶液，50保溫 30即加 液終止反應(yīng)，沸水煮 5色，自來水冷卻至室溫，用蒸餾水補(bǔ)足至 分振蕩后測 550吸光值，以麥芽糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算麥芽糖含量。空白對(duì)照先加 液再加酶液。酶活力單位定義為在該條件下（ 50）每小時(shí)生成1個(gè)酶活力單位。 穩(wěn)定性測定 、 0 倍，于 63下保溫 5h，然后測定剩余酶活性。 豆 定 取 當(dāng)稀釋的酶液加入到 系列 沖液（ ， 50預(yù)熱 5加入 預(yù)熱的 2%淀粉溶液，于 50反應(yīng) 30 適反應(yīng)溫度測定 取 度 2%淀粉溶液（ 入到 當(dāng)稀釋酶液中（均預(yù)熱），于不同溫度下反應(yīng) 5h，以相對(duì)酶活性表示。 穩(wěn)定性的影響測定 沖液 ()適當(dāng)稀釋，于 63保溫 5h，取 %淀粉 (應(yīng) 30未保溫酶液的活性為 100%計(jì)。 定分子量 取 200豆粉末放入 10心管中，加 5、 酸緩沖液，搖床提取 1h（室溫， 26），然后 4離心（ 10000 轉(zhuǎn) /30取上清液在相同條件下再離心 15 50子篩凝膠柱，用 、 磷酸緩沖液洗脫，流速 1mL/測波長 280部收集洗脫液，每管 管取 200L 測定 子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白和溶菌酶蛋白，濃度為 5mg/樣體積 50L。 中國農(nóng)業(yè)科 學(xué)院