密級(jí)：內(nèi)部 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 大豆 錄因子基因的分離及其功能分析 I 摘 要 一類近年來發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在高等植物中構(gòu)成一個(gè)基因超家族，它不但 廣泛參與了植物對(duì)非生物脅迫和生物脅迫的反應(yīng)，還參與了生長發(fā)育及多種代謝途徑的調(diào)控，在植物的整個(gè)生命周期中起著重要的作用。 大豆（ 一種重要的高蛋白油料作物和 固氮植物，為人類提供了豐富的 蛋白質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)來源， 因其適應(yīng)性廣，營養(yǎng)豐富，用途廣泛而受到普遍的重視，是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物。 本研究利用酵母單雜交系統(tǒng)從大豆 庫中分離了四個(gè) 基因： 對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究，主要結(jié)果如下： 1、采用酵母單雜交系統(tǒng)對(duì)大豆 庫進(jìn)行了篩選，共得到 4 個(gè)不同的克隆，分別命名為 列分析表明 屬于 轉(zhuǎn)錄因子，具有典型的 構(gòu)域。 于 組， 于第組。 長編碼序列 1080碼 359 個(gè)氨基酸，與葡萄的 列相似性為 長 編 碼 序 列 849 編 碼 282 個(gè) 氨 基 酸 ， 與 序列相似性為 長編碼序列 900碼 299 個(gè)氨基酸，與煙草的 列相似性為 長編碼序列 921碼 306 個(gè)氨基酸， 列相似性為 48%。 2、 大豆的根、莖、葉中均有表達(dá)，但四個(gè)基因在大豆中表達(dá)豐度不一， 表達(dá)較強(qiáng)， 之， 較弱 。 3、 酵母體內(nèi)均能與 合，而不能與 合；在 E. 表達(dá)了 白， 驗(yàn)表明 體外具有 合特異性，而與 不能結(jié)合； 酵母細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄激活功能。 4、 合的表達(dá)，表明 定位在細(xì)胞核內(nèi)。 5、 因在擬南芥中的過表達(dá)沒有影響擬南芥植株的正常生長發(fā)育，且 ，鹽等非生物逆境的抗性，對(duì) P. 抗性也有提高。 6、 因在煙草中的過表達(dá)可以提高植株對(duì)高糖脅迫下的耐性，但在高鹽（ 高滲（ 件下則未觀察到 差異。 關(guān)鍵詞： 大豆；轉(zhuǎn)錄因子； 境 a in in as to in a of is an It is as an it is of of In 1. by as , . DS 08084990092159282299306 1%, 8%. 2. at in of 3. a as to in in in of to of in 4. on of FP in in 5. in in of to as as as to . 6. in of 錄 摘 要 . I . 錄 . 文縮略表 . 一章 緒 論 . 1 究目的和意義 . 1 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 . 1 物轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展 . 1 錄因子的研究進(jìn)展 . 9 究內(nèi)容和技術(shù)路線 . 18 第二章 因的分離及其體內(nèi)表達(dá)特異性分析 . 20 料與方法 . 20 料 . 20 法 . 20 果 . 22 豆 庫的篩選 . 22 序列分析 . 24 大豆體內(nèi)的表達(dá)特異性分析 . 31 論 . 31 結(jié) . 33 第三章 結(jié)合特異性及轉(zhuǎn)錄激活分析 . 34 料與方法 . 34 料 . 34 法 . 34 結(jié)果 . 36 件的酵母體內(nèi)結(jié)合特異性分析 . 36 件的體外結(jié)合特異性分析 . 38 酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活功能分析 . 41 論 . 42 結(jié) . 43 第四章 . 44 V 料與方法 . 44 料 . 44 法 . 45 果 . 52 合蛋白表達(dá)載體構(gòu)建及其 察 . 52 生理功能分析 . 55 論 . 62 錄因子的核定位信號(hào) . 62 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控非生物逆境及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) . 63 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控抗病反應(yīng)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) . 63 結(jié) . 65 第五章 結(jié)論 . 66 參考文獻(xiàn) . 67 致 謝 . 73 作者簡(jiǎn)歷 . 74 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 統(tǒng)獲得抗性 導(dǎo)系統(tǒng)抗性 定位信號(hào) 烯響應(yīng)元件結(jié)合因子 表達(dá)子 膠電泳遷移分析 體類蛋白 激酶 響應(yīng)元件 病原菌相關(guān)基因 促細(xì)胞分裂原蛋白激酶 楊酸 轉(zhuǎn)錄 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 究目的和意義 錄因子是近年來在植物中發(fā)現(xiàn)的一大類調(diào)控基因，在高等植物中構(gòu)成一個(gè)基因超家族 (如擬南芥中有 74個(gè)成員 (et 2003)，水稻中有 100余個(gè)成員 (et 2005; J & 2005)。 能復(fù)雜多樣的調(diào)控基因： 、鹽等非生物逆境的應(yīng)答及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) ； 態(tài)建成以及代謝調(diào)控。 但在水楊酸介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗性（ 重要作用，在茉莉酸介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ 生中也起重要調(diào)控作用，是水楊酸、乙烯和茉莉酸介 導(dǎo)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵因子，是這些信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵交叉點(diǎn)和平衡點(diǎn)。 大豆（ 一種重要的高蛋白油料作物和固氮植物，為人類提供了豐富的蛋白質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)來源。自 2001年以來，中國每年均需要進(jìn)口大豆 1000萬噸以上， 2004年進(jìn)口大豆總量高達(dá) 2023萬噸， 2005年 2659萬噸。因此，發(fā)展大豆生產(chǎn)，培育具有優(yōu)良性狀的大豆新品種成為我國大豆產(chǎn)業(yè)的主要任務(wù)之一。已證實(shí)有 30多種大豆病害直接對(duì)生產(chǎn)造成損失，平均每年因病害導(dǎo)致的減產(chǎn)為 10%左右。這些病害包括由真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲等，危害大 豆的根、莖葉、豆莢、豆?；蛘麄€(gè)植株。干旱、低溫等非生物逆境也嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量，平均每年導(dǎo)致的減產(chǎn)為 8左右 。因此培育抗病、抗逆的大豆新品種是提高我國大豆產(chǎn)量的有效措施。 綜上所述，本研究的目的是分離大豆中與調(diào)控基因 一步闡明其功能，為我國今后大豆及其它作物的抗性育種提供基因源和理論依據(jù)。 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 物轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展 植物在長期的進(jìn)化過程中，為了適應(yīng)環(huán)境和滿足各種生理需求，形成了復(fù)雜而精巧的調(diào)節(jié)機(jī)制。內(nèi)外環(huán)境的變化作為信號(hào)被感知后，通過 一系列信號(hào)途徑，引起相關(guān)基因的表達(dá)狀態(tài)發(fā)生改變，最終賦予植物在生理上的適應(yīng)性。 在眾多的適應(yīng)性機(jī)制中，基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)在植物應(yīng)答環(huán)境信號(hào)刺激反應(yīng)過程中起著重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子是植物中最重要的一類調(diào)節(jié)基因。 轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是指能夠與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的 過它們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄。典型的植物轉(zhuǎn)錄因子具有 轉(zhuǎn)錄調(diào)控域 (激活域或抑制域 )、寡聚化位點(diǎn) (核定位信號(hào) ( 4個(gè)功能區(qū)域。 轉(zhuǎn)錄因子一般處于信號(hào)途徑的中游，起承上啟下的作用，上可接受被感知、加工放大的信號(hào)，下則通過與其它轉(zhuǎn)錄因子或輔助蛋白的相互作用結(jié)合特定基因的啟動(dòng)子元件，調(diào)控基因的表達(dá)；同時(shí)，可作為共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分位于幾條信號(hào)的交匯點(diǎn)，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的整合與對(duì)話。因中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 此，要從分子水平了解植物生長發(fā)育和適應(yīng)外界環(huán)境的生理功能的機(jī)制，必須詳細(xì)研究 各類轉(zhuǎn)錄因子在生物體內(nèi)的功能。目前，轉(zhuǎn)錄因子功能的闡明已成為植物分子生物學(xué)的熱點(diǎn)。隨著模式植物和經(jīng)濟(jì)植物基因組測(cè)序的完成，如何運(yùn)用遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定這些轉(zhuǎn)錄因子功能顯得越來越迫切和重要。與它們調(diào)控的目的基因不同，轉(zhuǎn)錄因子在染色體上出現(xiàn)重復(fù) (產(chǎn)生大量冗余 ( 2000)；其本身的結(jié)構(gòu)也較復(fù)雜，既有被調(diào)控或互作的結(jié)構(gòu)域或基元 (如磷酸化位點(diǎn)、亮氨酸拉鏈 (螺旋一螺旋 (構(gòu)，又有發(fā)生調(diào)控作用的結(jié)構(gòu)域，如轉(zhuǎn)錄激活域和 /或抑制域 (et 1998)；另外，也是最重要的一點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子功能研究離不開它們的目的基因，即如何尋找、確定特異的目的基因。這些特點(diǎn)決定了轉(zhuǎn)錄因子功能研究與一般的最終效應(yīng)基因不同，具有其復(fù)雜性的一面。目前，通過遺傳鑒定方法確定功能的轉(zhuǎn)錄因子仍在少數(shù)，擬南芥中 1533 個(gè)基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，占總基因數(shù)的 而遺傳鑒定的只有 7%(et 1999; 1996)， 。 錄因子的結(jié)構(gòu) 合域 合域是指轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別順式作用元件并與之結(jié)合的一段氨基酸序列。相同類型轉(zhuǎn)錄因子 合域的氨基酸序列較為保守，因此，這段氨基酸序列決定了轉(zhuǎn)錄因子的特異性。轉(zhuǎn)錄因子中其他氨基酸起到增強(qiáng)其結(jié)合的作用 (et 1996)。另外， 合域的二級(jí)結(jié)構(gòu)也可能影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合的特異性，在這一過程中一些中性氨基酸殘基，例如脯氨酸和甘氨酸更為重要 ( Y, 1997; Ni et 1996)。典型的植物轉(zhuǎn)錄因子 合域有 構(gòu)域( J, 1991; S & P, 2002; et 2003)，鋅指結(jié)構(gòu)域 (H., 1998; et 2003)， et 1996; G et 2003; D et 1995)構(gòu)域 (et 2003)， 構(gòu)域 ( & J., 1997)等。 轉(zhuǎn)錄調(diào)控域 轉(zhuǎn)錄調(diào)控域包括轉(zhuǎn)錄激活域和轉(zhuǎn)錄抑制域兩類，他們決定了轉(zhuǎn)錄因子功能的差異。同類轉(zhuǎn)錄因子的主要區(qū)別在于它們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控域各不相同 ( & J, 1998)。轉(zhuǎn)錄因子的激活或抑制作用依賴于它對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄起激活還是抑制作用。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因的抑制作用可能是通過與其他轉(zhuǎn)錄因子競(jìng)爭(zhēng)同一順式調(diào)控元件進(jìn)行的。除此之外，還可能存在諸如通過使轉(zhuǎn)錄因子二聚化而導(dǎo)致調(diào)控域被掩蓋，轉(zhuǎn)錄抑制域與轉(zhuǎn)錄因子相互作用等機(jī)制 (et 1996)。 寡聚化位點(diǎn) 寡聚化位點(diǎn)是不同轉(zhuǎn)錄因子借以發(fā)生相互作用的功能域。它們的氨基酸序列很保守，大多與合域相連并形成一定的空間構(gòu)象，如 轉(zhuǎn)錄因子的寡聚化位點(diǎn)包括 1 個(gè)拉鏈結(jié)構(gòu)，而 b/轉(zhuǎn)錄因子含有螺旋 螺旋結(jié)構(gòu)。 錄因子的寡聚化域則形成兩個(gè) 折疊。這些寡聚化位點(diǎn)空間構(gòu)象的變化產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄機(jī)制的多樣性，從而使轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控高等植物基因表達(dá)的能力。許多高等植物的轉(zhuǎn)錄因子形成異聚或同聚物，以影響 合的特異性、轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子元件的親和 ( J & L, 1994; et 1992)和核的定位中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 ( B et 1997)。 核定位信號(hào) 核定位信號(hào)是轉(zhuǎn)錄因子中富含精氨酸和賴氨酸殘基的核定位區(qū)域，轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核的過程受該區(qū)段控制 (1994; et 2000)。 ( et 2002)在研究55細(xì)胞中定位的分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，核定位信號(hào)對(duì) 5細(xì)胞分布有決定作用。目前，已經(jīng)在水稻的 et 1995)，玉米的 轉(zhuǎn)錄因子 1994)等多種轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)了核定位信號(hào)。不同植物轉(zhuǎn)錄因子核定位信號(hào)的序列、組織器官的分布和數(shù)量存在著差異。另外，不同轉(zhuǎn)錄因子的核定位信號(hào)的數(shù)目也不相同。有的轉(zhuǎn)錄因子只有一個(gè)核定位信號(hào)區(qū)，該類核定位信號(hào)區(qū)的堿性氨基酸或者聚集在一起或者形成兩個(gè)被非保守氨基酸隔開的功能群 ( et 1997)。而有的轉(zhuǎn)錄因子具有多拷貝的核定位信號(hào)區(qū)，這些多拷貝的核定位信號(hào)區(qū)或者在功能上相互獨(dú)立，或者成簇存在 (et 1996)。 一般情況下，轉(zhuǎn)錄因子的分類是根據(jù)保守的 合域進(jìn)行的 (et 2000)。在植物中，轉(zhuǎn)錄因子分成幾十種類型。 集了擬南芥所有轉(zhuǎn)錄因子 (1922 個(gè)位點(diǎn)； 2290 基因模式 )，總共分成了 64 個(gè)基因家族，表 出了一些常見的植物轉(zhuǎn)錄因子類型及其 合域的結(jié)構(gòu)特征 ()。 錄因子的功能 在轉(zhuǎn)錄水平上與 生相互作用的蛋白質(zhì)分子中，最具多樣性的便是轉(zhuǎn)錄因子，它們?cè)诟叩戎参锏纳L、發(fā)育、形態(tài)建成，以及生物和非生物脅迫等環(huán)境反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用。 轉(zhuǎn)錄因子與植物生長發(fā)育和形態(tài)建成 高等植物的生 長發(fā)育和形態(tài)建成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。在這個(gè)過程中， 蛋白質(zhì)起著主要作用，通過它們之間的互作，實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。已經(jīng)鑒定的轉(zhuǎn)錄因子如 和 廣泛參與了植物的生長發(fā)育和形態(tài)建成。 近年來已經(jīng)從玉米、擬南芥、金魚草、水稻和棉花等多種植物中鑒定出了 轉(zhuǎn)錄因子( 2002)。 錄因子家族含有保守的 構(gòu)域，廣泛參與植物發(fā)育、代謝的調(diào)節(jié)和植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。王棟等研究了擬南芥根特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 果表明， 酵母中的過量表達(dá)導(dǎo)致染色體凝縮、細(xì)胞核不能正常分裂、胞質(zhì)分裂不能進(jìn)行、產(chǎn)生單核長細(xì)胞 (王棟 et 2001)。由于許多功能保守的植物基因在裂殖酵母中和植物細(xì)胞中具有相似的功能，因此可以推測(cè)植物 錄因子可能與植物的細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。植物 錄因子另一個(gè)研究的較清楚的功能是控制細(xì)胞和植物的形態(tài)建成。編碼 轉(zhuǎn)錄因子的 因，對(duì)擬南芥生物鐘有調(diào)節(jié)作用。 光信號(hào)在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的應(yīng)答，暗示了 轉(zhuǎn)錄因子可能通過光信號(hào)而參與生物生理節(jié)律的調(diào)控 ( 2002)。 是另一類數(shù)量龐大的基因家族，在人、植物及酵母中均存在，估計(jì)在每種植物中 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 基因家族 (保守結(jié)構(gòu)域 (基因家族功能 (擬南芥基因組中的數(shù)目 (20括 1 個(gè) 25 富含堿性氨基酸的區(qū)域和 1 個(gè)亮氨酸拉鏈 含有兩個(gè)相連的基本亞區(qū)，其中堿性 與 合有關(guān)，螺旋一環(huán)一螺旋區(qū)參與二聚體形成 30基組成，含兩個(gè)保守的 /或兩個(gè) 56成，含有 1 個(gè)長 鏈 含有 1由 5成的呈螺旋 螺旋構(gòu)象的不完全重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)含 3 個(gè)保守的 60 成 , N 端有保守的22含有 3 個(gè)平行的一折疊和 1個(gè)雙親性 由 350 成的類似 序列 ;有 , , ,四個(gè)基序 種子儲(chǔ)存蛋白基因表達(dá) ;光形態(tài)建成 ;葉發(fā)育 ;花發(fā)育 ;防衛(wèi)反應(yīng) :物合成 花青素合成 ;光應(yīng)答 ; 非生物脅迫 :花發(fā)育 花發(fā)育 ;開花時(shí)間 :種子 發(fā)育 ;根節(jié)發(fā)育 花發(fā)育 ;果發(fā)育 ;開花時(shí)間 ; 根發(fā)育 次生代謝 ;細(xì)胞形態(tài)建成 ;植物生長 :生物或非生物脅迫 :晝夜節(jié)律 生物或非生物脅迫反應(yīng) ;表皮毛發(fā)育、鞣質(zhì)合成 ;糖代謝 ;種子休眠 :倍半萜烯合成 :體細(xì)胞胚發(fā)育 花器官建成 ; 葉緣細(xì)胞形成 ; 生物或非生物脅迫反應(yīng) 生長素反應(yīng) ;參與光信號(hào) 72 127 134 104 150 74 146 29 表 物 中 主 要 的 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 of 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 約有 25 30 種 基因 ( 1999)。該類基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)，以及功能進(jìn)化與植物花器官發(fā)生、花形態(tài)多樣性的遺傳機(jī)制和進(jìn)化規(guī)律有密切的關(guān)系。對(duì)擬南芥 (, 1995)和牽?；?( G et 2003)的研究表明 ， 大多數(shù) 基因在植物發(fā)育中扮演多成角色。植物 基因除了調(diào)節(jié)花發(fā)育的作用外，還參與根、葉、果實(shí)、種子和胚胎的發(fā)育 (, 1995)。 轉(zhuǎn)錄因子與植物抗逆 高等植物中的脅迫誘導(dǎo)基因?qū)χ参锟鼓嬗兄匾淖饔?。近年來，該類基因誘導(dǎo)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因產(chǎn)物調(diào)控作用的研究，已成為植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)前言內(nèi)容。 由于高等植物本身的復(fù)雜性，其脅迫誘導(dǎo)反應(yīng)受多種信號(hào)途徑的調(diào)控，并且不同脅迫反應(yīng)的信號(hào)途徑及其相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控上存在著交叉。 利用差示篩選法，從干旱處理的擬南芥中克隆了一批受干旱誘導(dǎo)的基因，并將其 定名為 to 因。其中 因的表達(dá)，不僅受干旱、高鹽、低溫脅迫的誘導(dǎo)，而且還受到外源激素 K, 1994)。 植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)估計(jì)擬南芥中約有 124個(gè)該類轉(zhuǎn)錄因子，約占其轉(zhuǎn)錄因子總數(shù)的 8%。白具有一個(gè) 58 或 59 個(gè)保守氨基酸的區(qū)域，該區(qū)域能與兩個(gè)順式作用元件相結(jié)合：一個(gè)是，該元件存在于乙烯反應(yīng)的 因的啟動(dòng)子中；另一類是 序，該基序與干旱、低溫等非生物脅迫誘導(dǎo)的基因表達(dá)有關(guān) (et 2002)。除此之外，與非生物脅迫有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子還有 ，該類轉(zhuǎn)錄因子具有保守的 別基序，與高等植物高溫脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān) (et 2001)。 另外，還有一些轉(zhuǎn)錄因子，它們與生物脅迫的抗性有密切關(guān)系，如 轉(zhuǎn)錄因子，以及錄因子超家族等。 族成員之一 脅迫應(yīng)答密切相關(guān)，對(duì)脅迫誘導(dǎo)劑引起調(diào)控作用 (et 2002)。 的研究表明該家族的轉(zhuǎn)錄因子與水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要元件 互作用。當(dāng)用水楊酸處理后，這種作用明顯增強(qiáng)，與此同時(shí)特異的 合活性大大提高 ( X, 2002)。而 白除了與水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，還能與 結(jié)合。 在于許多植物抗性基因的啟動(dòng)子中，與系統(tǒng)獲得抗性有關(guān)（ et 000）。后面將詳細(xì)論述 錄因子。 究高等植物轉(zhuǎn)錄因子功能的方法 與功能基因的研究相比，有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子功能研究和分析的報(bào)道要少的多，近年來也有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。研究轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的功能主要用到了 白融合技術(shù)等。研究轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)功能的方法主要有瞬間轉(zhuǎn)化分析，突變分析，以及近年來發(fā)展起來的 擾技術(shù) 等。 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的功能研究方法 轉(zhuǎn)錄因子的功能域有 合域、轉(zhuǎn)錄激活或抑制域、核定位信號(hào)以及蛋白相互作用的寡聚化位點(diǎn)。如要研究轉(zhuǎn)錄因子的功能，一般先對(duì)這幾個(gè)功能域進(jìn)行研究。目前針對(duì)這些功能域的特點(diǎn)己發(fā)展了一些相應(yīng)的體外和體內(nèi)研究策略。 合域 基因的啟動(dòng)子區(qū)含有特異的轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別與結(jié)合的順式元件。通常情況下，鑒別一個(gè)轉(zhuǎn)錄因中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 子調(diào)控的啟動(dòng)子可以采取瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法，即將啟動(dòng)子序列與報(bào)告基因融合，將轉(zhuǎn)錄因子全序列或完整的編碼區(qū)置于強(qiáng)啟動(dòng)子 5S 或 動(dòng)子的控制下，共轉(zhuǎn)化植物、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體或酵母細(xì)胞，然后測(cè)定報(bào)告基因的活性 ( M, 1998)。如果要定義出啟動(dòng)子的順式元件，則可以運(yùn)用凝膠電泳遷移分析 (方法。 研究 蛋白互作時(shí)應(yīng)用最廣、簡(jiǎn)單、快速、靈敏的技術(shù)。它可以用純化的蛋白、細(xì)胞核或原核表達(dá)蛋白粗提物來檢驗(yàn)蛋白與候選啟動(dòng)子元件結(jié)合的活性?；驹硎窃诜亲冃缘木郾０纺z中，蛋白與標(biāo)記的 件結(jié)合，形成蛋白 合物。這種復(fù)合物在凝膠中的泳動(dòng)速度比較慢，標(biāo)記的 現(xiàn)出相對(duì)滯后。運(yùn)用 以鑒定轉(zhuǎn)錄因子的 et 1998)。一般是對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的某幾個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，確定合域中有關(guān)結(jié)合活性的關(guān)鍵氨基酸。通過這種方法，確定了水稻轉(zhuǎn)錄因子 責(zé) 個(gè)最小區(qū)域。這兩個(gè) 合域分別與水稻光敏色素 A 基因啟動(dòng)子上的 Ni et 1996)。 以用來研究轉(zhuǎn)錄因子的共價(jià)修飾，或者研究微量的金屬離子對(duì)合活性的影響。如，磷酸化的 白 強(qiáng)了與 件的親和性 (et 1995)。用 子的鰲合劑 1， 10(1， 10理降低或完全抑制 et 1995)與順式元件的結(jié)合。 轉(zhuǎn)錄調(diào)控域 確定一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是否具有轉(zhuǎn)錄激活功能，通常采用酵母單雜交體系。原理是，將該蛋白的編碼序列 (確定是否有轉(zhuǎn)錄激活活性 )或可能的轉(zhuǎn)錄激活區(qū) (確定轉(zhuǎn)錄激活域 )與酵母轉(zhuǎn)錄激活因子 合域融合， 轉(zhuǎn)化酵母，觀察轉(zhuǎn)化子在選擇培養(yǎng)基上的生長情況。這個(gè)方法很成熟，已經(jīng)成功鑒定了不同物種的多種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活域，如擬南芥的 合蛋白 米的 豆的 稻的 M, 1998)，以及煙草的 et 2001)。酵母單雜交法確定轉(zhuǎn)錄激活域的方法也存在其局限性：某些類型的激活域，如富含谷氨酰胺類在酵母中不起作用 (et 1995)。另外，它不能用來確定轉(zhuǎn)錄抑制域。抑制域的確定可以用另外的瞬時(shí)表達(dá)體系進(jìn)行。 核定位信號(hào) 核定位信號(hào)域的鑒定通常采用與報(bào)告基因融合的瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法。目前，運(yùn)用這種方法鑒定了許多植物轉(zhuǎn)錄因子的 玉米 C 端和 N 端序列與 告基因融合，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到煙草植株或瞬時(shí)表達(dá)在洋蔥中，表明該轉(zhuǎn)錄因子包含兩個(gè) 個(gè)是單位點(diǎn) ( ，另一個(gè)為雙位點(diǎn) ( ，二者都能單獨(dú)引導(dǎo) 入細(xì)胞核，但后者的作用更大。有趣的是， 位于負(fù)責(zé) 合的 中。突變分析表明，喪失 合能力的 白仍能進(jìn)入細(xì)胞核，說明其核定位信號(hào)區(qū)并不等同于 合區(qū)，而是各自獨(dú)立的發(fā)揮作用 ( 1994)。綠色熒光蛋白 (因是另一個(gè)用來研究轉(zhuǎn)錄因子核定位的報(bào)告基因，而且還能對(duì)蛋白進(jìn)出細(xì)胞核的動(dòng)態(tài)過程進(jìn)行觀察。但是，由于 子量小，短的 融合蛋白能在胞質(zhì)與核之間自由擴(kuò)散，所以當(dāng)用來研究 ，通常將 起融合到 (et 1997)。 轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)功能的研究方法 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 以上只是根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)來研究其結(jié)構(gòu)域與功能的一般信息，要全面、深入了解其生物學(xué)功能還得利用基因缺失和超表達(dá) (et 1998)，從植株表型、生理代謝、基因表達(dá)等層次進(jìn)行綜合分析。 基因功能缺失突變體 研究基因功能最理想的辦法是敲除 (者喪失掉該基因，觀察突變體的性狀。傳統(tǒng)的獲得突變體的方法通常是通過篩選自然突變體或用輻射、化學(xué)誘導(dǎo)劑處理，這些方法主要缺陷是不定向性?，F(xiàn)在發(fā)展了一些效率相對(duì)較高、特異性強(qiáng)的方法，如反義抑制 (共抑制 ( 轉(zhuǎn)座子插入突變和雙鏈 涉 (。 反義抑制是將基因的完整或部分編碼序列反向插入高活性的組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子的下游，通過轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株中該序列所表達(dá)的 其靶 互作用，從而抑制相應(yīng)內(nèi)源基因表達(dá) (et 2000)。共抑制是指正向的基因全長序列與高活性的組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子融合，通過轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株中該序列所表達(dá)的 制了相應(yīng)內(nèi)源基因的表達(dá) ( J, 2001)。目前，用這兩種策略己成功地鑒定了一些轉(zhuǎn)錄因子的功能，但它們的局限性是顯而易見的。兩種方法都有可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株的致死效應(yīng)或強(qiáng)烈的多重效應(yīng)，很難從表型鑒定出所需的轉(zhuǎn)基因植株；反義抑制的抑制作用只需 50 異性較低。這使得利用該方法研究那些高度保守的基因家族的轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，很難產(chǎn)生只抑制目的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的突變植株；抑制作用只發(fā)生在某些轉(zhuǎn)基因植株中，研究一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子需培育大量的轉(zhuǎn)基因植株，才可能篩選到有意義的突變體 (et 1990