密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 嗜線蟲致病桿菌北京變種抗生素抗性相關(guān)基因的研究 on 士 研 究 生：龔永興 指 導(dǎo) 教 師：楊懷文 研究員 申請學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)博士 專 業(yè)：農(nóng)業(yè)微生物學(xué) 研 究 方 向：微生物基因工程與技術(shù)應(yīng)用 培 養(yǎng) 單 位：研究生院 植物保護研究所 提交日期 2006 年 6 月 h. D on h. D 006 獨 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議) 論文作者簽名： 時間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時間： 年 月 日 論文評閱人、答辯委員名單 論文題目 嗜線蟲致病桿菌北京變種抗生素抗性相關(guān)基因的研究 論文作者 龔永興 指導(dǎo)教師 楊懷文 研究員培養(yǎng)單位 植物保護研究所 姓名 職稱職務(wù) 導(dǎo)師類別單位 專業(yè) 周廣和 研究員 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 植物病理學(xué)劉杏忠 研究員 博導(dǎo) 中國科學(xué)院微生物研究所 微生物學(xué) 評 閱 人 沈佐銳 教 授 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護 答辯 主席 李季倫 教 授 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 微生物學(xué) 譚華榮 研究員 博導(dǎo) 中國科學(xué)院微生物研究所 微生物學(xué) 劉杏忠 研究員 博導(dǎo) 中國科學(xué)院微生物研究所 微生物學(xué) 成卓敏 研究員 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 生物技術(shù) 簡 恒 教 授 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植病生防 張 杰 研究員 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 生物技術(shù) 答 辯 委 員 朱昌雄 研究員 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所 微生物學(xué) 答辯時間與地址 2006年6月16日 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院中日中心大樓305會議室 記錄人員 楊秀芬 副研究員 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 I 摘 要 嗜線蟲致病桿菌北京變種(X. 本實驗室從北京郊區(qū)土壤中分離的小卷蛾斯氏線蟲（共生細菌，經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)該菌的代謝產(chǎn)物具有殺蟲、抑菌、抗癌等生物活性，有著誘人的開發(fā)利用前景。本研究對嗜線蟲致病桿菌北京變種的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化技術(shù)進行了探討，對菌株的抗生素相關(guān)基因片段進行克隆、功能分析和定位，為菌株的遺傳改良提供技術(shù)支持與理論依據(jù)，同時為獲得新的功能基因奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1) 測定了嗜線蟲致病桿菌北京變種京變種對氯霉素、新霉素和卡那霉素敏感；對鏈霉素、氨芐青霉素和青霉素具有一定的抗性。 2) 首次研究了不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法對北京變種定接合轉(zhuǎn)移是適宜菌株遺傳操作的最佳方法。用不同方法制備北京變種同方法對菌株影響各異：經(jīng)電擊操作處理的菌株出現(xiàn)卡那霉素抗性，糖(葡萄糖(和山梨醇(用發(fā)生了變化，生長曲線呈雙菌活性降低；經(jīng)素吸收、抑菌活性及生理生化特性也受到影響；而接合轉(zhuǎn)移操作處理方法對菌株影響最小，各方面的特性與野生型菌株基本一致。 3) 首次利用接合轉(zhuǎn)移的三親雜交方法，建立了北京變種別將質(zhì)粒菌株的許多代謝途徑及性狀產(chǎn)生了較大影響。與野生型菌株相比，分別含有外源質(zhì)粒長速度明顯提高，提前12小時進入指數(shù)生長期；一些生理生化反應(yīng)特別是糖類利用所受影響較大；菌株產(chǎn)素水平也因為質(zhì)粒的導(dǎo)入而呈大幅度降低的態(tài)勢。 4) 首次從北京變種中克隆得到抗生素相關(guān)基因o.：31堿基與嗜線蟲致病桿菌17731堿基與發(fā)光光桿狀菌序列相似性。 5) 對北京變種具有氨芐青霉素水解活性的白純化及生物活性測定。設(shè)計引物從北京變種建原核表達載體化到E. 胞中，不同度以及時間等誘導(dǎo)條件下，發(fā)現(xiàn)目的肽段均以包涵體的形式表達。包涵體經(jīng)溶解、變性、透析復(fù)性后表現(xiàn)出氨芐青霉素水解活性。對用6) 對明非質(zhì)粒上。本研究從北京變種中首次發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒推測們在細胞內(nèi)發(fā)揮著各自的功能。 以上結(jié)果將對以后嗜線蟲致病桿菌北京變種的遺傳操作提供技術(shù)支持，并為該菌株抗生素的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 鍵詞： 嗜線蟲致病桿菌北京變種(X. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化技術(shù) 抗生素相關(guān)基因 包涵體 氨芐青霉素水解活性 is a an in in by of a of So it is to do of on of on of of as 1 . to of in of on 2 to . of on of It on to of OR PI of to as to is no of of 3 of . of in of 4 An . It 5731 of is to . 99% IV of to an 85% is in 5 of by a of . it ) to a . an 0 to of 6 It in in of in to be to in on of of . X. V 目 錄 第一章 緒論. 1 昆蟲病原線蟲共生細菌型變研究進展. 1 型變. 1 型變的可能機理. 1 型變的意義. 3 致病桿菌分子生物學(xué)研究技術(shù). 4 電擊轉(zhuǎn)化法. 4 化學(xué)轉(zhuǎn)化法. 4 接合轉(zhuǎn)移法. 5 致病桿菌功能基因研究進展. 5 外膜蛋白基因. 6 菌毛蛋白基因. 6 共生作用相關(guān)基因. 7 溶血素相關(guān)基因. 8 殺蟲毒素蛋白基因. 8 專利保護基因. 9 功能未知基因. 10 致病桿菌抗菌代謝產(chǎn)物研究進展. 10 致病桿菌抗菌代謝物的抑菌活性. 10 致病桿菌的抗菌代謝物質(zhì). 11 本研究的立題依據(jù)及意義. 13 立題依據(jù). 14 研究目的和意義. 14 第二章 嗜線蟲致病桿菌北京變種. 16 北京變種的抗生素抗性研究. 16 實驗材料. 16 實驗方法. 17 抗生素濃度梯度的配制. 17 抗生素抗性的測定. 17 結(jié)果與分析. 18 氯霉素抗性測定. 18 卡那霉素抗性測定. 18 鏈霉素抗性測定. 18 新霉素抗性測定. 19 青霉素抗性測定. 19 氨芐青霉素抗性測定. 20 討論. 20 不同轉(zhuǎn)化方法對北京變種. 21 實驗材料. 21 實驗方法. 22 化學(xué)轉(zhuǎn)化用感受態(tài)細胞的制備. 22 化學(xué)轉(zhuǎn)化用感受態(tài)細胞的空白轉(zhuǎn)化. 22 電擊轉(zhuǎn)化用感受態(tài)細胞的制備. 22 電擊轉(zhuǎn)化用感受態(tài)細胞的空白轉(zhuǎn)化. 23 接合轉(zhuǎn)移用感受態(tài)細胞的制備. 23 接合轉(zhuǎn)移用感受態(tài)細胞的空白轉(zhuǎn)化. 23 菌落對色素的吸收. 23 菌落在. 24 菌落過氧化氫酶活性測定. 24 落生長曲線的制定. 24 落抑菌活性的測定. 24 結(jié)果與分析. 24 不同轉(zhuǎn)化方法對北京變種卡那霉素抗性的影響. 24 不同轉(zhuǎn)化方法對北京變種色素吸收的影響. 25 不同轉(zhuǎn)化方法對北京變種細胞內(nèi)代謝作用的影響. 25 不同轉(zhuǎn)化方法對北京變種過氧化氫酶活性的影響. 27 不同轉(zhuǎn)化方法對北京變種生長曲線的影響. 27 不同轉(zhuǎn)化方法對北京變種抑菌活性的影響. 28 討論. 28 轉(zhuǎn)化操作對北京變種卡那霉素抗性的影響. 28 不同轉(zhuǎn)化方法對北京變種生理生化特性的影響. 29 外源質(zhì)粒導(dǎo)入對北京變種生理生化特性的影響. 30 實驗材料. 30 實驗方法. 31 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備. 31 供體質(zhì)粒和幫助質(zhì)粒在感受態(tài)細胞的電擊轉(zhuǎn)化. 31 質(zhì)粒在北京變種中的接合轉(zhuǎn)移. 31 轉(zhuǎn)移接合子的. 32 轉(zhuǎn)移接合子中質(zhì)粒的提取. 33 轉(zhuǎn)移接合子對色素的吸收. 33 轉(zhuǎn)移接合子過氧化氫酶活性的測定. 33 轉(zhuǎn)移接合子在. 33 轉(zhuǎn)移接合子生長曲線的制定. 33 移接合子抑菌活性的測定. 33 移接合子氯霉素抗性的測定. 33 結(jié)果與分析. 34 供體質(zhì)粒和幫助質(zhì)粒在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化. 34 質(zhì)粒在嗜線蟲致病桿菌北京變種的接合轉(zhuǎn)移. 34 轉(zhuǎn)移接合子的. 35 轉(zhuǎn)移接合子質(zhì)粒的穩(wěn)定性. 36 轉(zhuǎn)移接合子對色素的吸收. 36 轉(zhuǎn)移接合子的代謝及生化特征. 37 轉(zhuǎn)移接合子的生長曲線變化. 38 轉(zhuǎn)移接合子的抑菌活性. 39 . 40 討論. 41 北京變種遺傳轉(zhuǎn)化體