密級(jí): 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 豬瘟和豬水泡病基因標(biāo)記疫苗的研究 of 交日期 2005 年 12 月 博士研究生：馮 霞 指 導(dǎo) 教 師：謝慶閣 研究員 劉湘濤 研究員 申請(qǐng)學(xué)位類別 ：農(nóng)學(xué)博士 專 業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 研 究 方 向：動(dòng)物病毒基因工程 培 養(yǎng) 單 位：蘭州獸醫(yī)研究所 of : 005 評(píng)閱人和答辯委員會(huì) 論文評(píng)閱人 ：楊漢春 教 授 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 胡永浩 教 授 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 邱昌慶 研究員 蘭州獸醫(yī)研究所 答辯委員會(huì)主席：余四九 教 授 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 答辯委員會(huì)成員：余四九 教 授 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 吳 潤(rùn) 教 授 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 胡永浩 教 授 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 張永光 研究員 蘭州獸醫(yī)研究所 殷 宏 研究員 蘭州獸醫(yī)研究所 羅建勛 研究員 蘭州獸醫(yī)研究所 劉在新 研究員 蘭州獸醫(yī)研究所 答辯時(shí)間：2005 年 12 月 23 日 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果， 也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。 與我一同工作過(guò)的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽字： 時(shí)間： 年 月 日 略詞 英文名稱 中文名稱 芐青霉素抗性 原遞呈細(xì)胞 邊界病病毒 倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系 牛病毒性腹瀉病毒 薩奇病毒 腺病毒受體 of 化群 E 細(xì)胞病毒早期 瘟 SF 豬瘟病毒復(fù)制子顆粒 瘟病毒 胞毒性 T 淋巴細(xì)胞 薩奇病毒 變加速因子 突狀細(xì)胞 高辛 s 低必需培養(yǎng)基二胺四乙酸 鏈延伸因子 1 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 心肌炎病毒 口蹄疫 蹄疫病毒 多糖 細(xì)胞 型肝炎病毒 型肝炎病毒表面抗原 類免疫缺陷病毒 酸乙酰肝素 休克蛋白 純皰疹病毒 辣根過(guò)氧化物酶 擾素 （或 M） 細(xì)胞介素 部核糖體進(jìn)入位點(diǎn) 疫刺激序列 B 培養(yǎng)基 數(shù)致死量 克隆抗體 抗單克隆抗體 要組織相容性復(fù)合體 飾活疫苗 肽疫苗 使 -4,52,5甲基偶氮唑鹽 密度 界動(dòng)物衛(wèi)生組織 放閱讀框 酸緩沖鹽水 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 腸道病毒 斑形成單位 物血凝素 殖與呼吸綜合征病毒 狂犬病病毒 髓灰質(zhì)炎病毒 肽疫苗 組腺病毒 組豬腺病毒 組痘病毒 分鐘轉(zhuǎn)速 轉(zhuǎn)錄 同源重復(fù)序列 二烷基磺酸鈉 門(mén)利克森林病毒 辛德比斯 0 猿猴病毒 40 水泡病 水泡病病毒 細(xì)胞受體 助性 T 細(xì)胞 瘤壞死因子 翻譯區(qū) 苗病毒 毒樣顆粒 毒中和試驗(yàn) 毒基因組連接蛋白 皰性口炎病毒 光霉素抗性 要 豬瘟和豬水泡病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（ 入 A 類傳染病名錄，世界各國(guó)對(duì)這兩種疫病均采取了嚴(yán)加防制及消滅措施，二者也是國(guó)際貿(mào)易中必查必檢的對(duì)象。疫苗接種是預(yù)防和控制動(dòng)物疫病的主要手段。由于傳統(tǒng)疫苗在生產(chǎn)中的生物安全隱患和感染與免疫動(dòng)物難以鑒別等缺陷，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)理論，研制新型安全、多聯(lián)、可鑒別疫苗已成必然之勢(shì)?；蛞呙缫云渥陨淼闹T多優(yōu)點(diǎn)和巨大的應(yīng)用潛能已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)之一。本研究通過(guò) 式 亞克隆技術(shù)構(gòu)建了豬水泡病基因疫苗、豬水泡病和豬瘟二聯(lián)基因疫苗和幾種豬瘟基因疫苗，研究其免疫效果，為最終研制成功豬瘟和豬水泡病基因疫苗作技術(shù)探索。 1) 構(gòu)建了幾種豬瘟基因疫苗：包括 因單表達(dá)重組質(zhì)粒 因雙抗原表達(dá)質(zhì)粒 因與報(bào)告基因 表達(dá)質(zhì)粒 因共表達(dá)質(zhì)粒 及 因與豬 因共表達(dá)質(zhì)粒以上真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 胞，用原位染色、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ 術(shù)證實(shí)它們均可表達(dá)外源基因。 2） 用這幾種豬瘟基因疫苗免疫兔，以阻斷 監(jiān)測(cè)試驗(yàn)兔抗體水平和淋巴細(xì)胞增殖情況，并進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果，單表達(dá)質(zhì)粒 疫組中有 3/4 兔產(chǎn)生 毒后， 4/4 完全保護(hù)。雙抗原表達(dá)質(zhì)粒 疫組有 1/4 兔產(chǎn)生抗體，攻毒后， 1/4 完全保護(hù)， 1/4 部分保護(hù)， 2/4 不保護(hù)。 未檢測(cè)到豬瘟抗體（ 4/4） ，攻毒后， 1/4 部分保護(hù)， 3/4 不保護(hù)。 3 只）也沒(méi)出現(xiàn)豬瘟抗體，攻毒后， 3/3 部分保護(hù)。而空載體 4/4 血清陰性，攻毒后，全部發(fā)病。與對(duì)照組相比，各免疫組的淋巴細(xì)胞均有一定程度的增殖。 3）構(gòu)建了豬水泡病和豬瘟二聯(lián)基因疫苗 2/ 它轉(zhuǎn)染 胞，以間接免疫熒光染色和 別檢測(cè)到豬水泡病和豬瘟抗原的表達(dá)。將其免疫兔，可檢測(cè)到免疫組兔 T 淋巴細(xì)胞增殖明顯； 但用阻斷 檢測(cè)到血清 異性抗體， 用豬瘟活疫苗 （）攻擊， 實(shí)驗(yàn)兔有 1/4 完全保護(hù)。 用乳鼠中和試驗(yàn)檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)所有兔血清 和抗體均低于 1:4。 4）構(gòu)建了豬水泡病基因疫苗 1，將其轉(zhuǎn)染的 胞經(jīng)熒光染色，可見(jiàn)許多特異性熒光細(xì)胞。用其單獨(dú)（ B 組）免疫或與 同（ C 組）免疫豬三次，檢測(cè)免疫前、后豬血清中 異性抗體的變化，發(fā)現(xiàn)免疫后 B 組和 C 組各有兩只豬產(chǎn)生低水平的抗體，并在攻毒后迅速升高；并對(duì)免疫前和攻毒前的豬血清用乳鼠中和試驗(yàn)檢測(cè) 異性抗體，結(jié)果只有 1 與 同免疫組中有兩只豬產(chǎn)生低水平的中和抗體（ 1:4） ，其余豬的中和抗體均小于 1:4。第三次免疫 3 月后，用豬水泡病香港乳鼠組織毒 52叉和 3兩個(gè)滴度（ 104.1 105.1 擊，結(jié)果 1 單獨(dú)免疫組（ B 組）有 1/4 獲得完全保護(hù)（為 104/0.1 擊） ， 1 與 同免疫組（ 有 1/4 獲得部分保護(hù)（為 105/0.1 擊） ， A 和 D 兩個(gè)對(duì)照組全部發(fā)病。 關(guān)鍵詞： 2 基因， 1 基因，基因疫苗，標(biāo)記疫苗，細(xì)胞因子，報(bào)告基因，兔，豬 of in by is to a of is of be in on an of SF In by of VD or/SF in of to to of 1) of a 2 2 a 2 a of a 2 a of a 2 a of 8 2 in a of in by a of 8 in 2) SF in or 3 4 SF ). , Of 1/4 of 2 , of of or , , 3/3) 2 or 4/4 2 ) 2/ 1 of 2 of CR To in by 2/in by by a 2 in a 2/ t of 2, ( ). of of :4 by 4) 1 VD To in in by by a to in by 1 or 13 by in of 2/4) 1 or 1 of 2/4) 1:4) in 1 in :4 by of 04.1 mL K) on 3 at of 2 05.1 mL of of in 1 04.1 mL of in 1 05.1 mL 3 or 2 5/5 VD In of of NA to SF 2 1 錄 第一章 序 言 .究背景及目的、意義 . 豬瘟、豬瘟病毒和豬瘟弱毒疫苗 . 豬水泡病和豬水泡病病毒 . 基因標(biāo)記疫苗 . 本研究的目的及意義 .內(nèi)外研究現(xiàn)狀 . 豬瘟疫苗研究進(jìn)展 . 豬水泡病疫苗研究概況 .究?jī)?nèi)容與方法 .二章 豬瘟基因標(biāo)記疫苗的構(gòu)建及體外表達(dá) .材料和方法 . 菌種、載體和主要試劑 . 主要儀器 . 細(xì)胞和種毒 . 引物的設(shè)計(jì)與合成 . 目的片段的獲得 . 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、克隆及鑒定 . 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的提取 . 轉(zhuǎn)染 . 各基因體外表達(dá)的檢測(cè) . 果 . 目的片段 .達(dá)質(zhì)粒的鑒定 . 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度 . 各基因的體外表達(dá) .討 論 .三章 豬瘟基因標(biāo)記疫苗對(duì)兔的免疫保護(hù)試驗(yàn) .料與方法 . 質(zhì)粒、疫苗與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 . 主要試劑 . 免疫用質(zhì)粒的制備 . 各豬瘟基因疫苗對(duì)家兔的免疫 . 阻斷. . 病毒攻擊保護(hù)試驗(yàn) . 果 . 兔血清. . 攻毒試驗(yàn) .討 論 .四章 豬瘟與豬水泡病二聯(lián)基因疫苗研究 .料和方法 . 菌種、載體和主要試劑 . 細(xì)胞、種毒、質(zhì)粒、疫苗和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 . 豬瘟病毒因與豬水泡病病毒基因雙表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 . 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的提取、轉(zhuǎn)染和體外表達(dá) . 免疫用質(zhì)粒的制備 . 雙表達(dá)基因