密級 論文編號 中國農(nóng)業(yè)科學院 碩士學位論文 型禽流感病毒進化分析及 型禽流感變異株疫苗株的構(gòu)建 95士研究生：指 導 教 師：申請學位類別：專 業(yè)：研 究 方 向：培 養(yǎng) 單 位： 鐘 功 勛 陳 化 蘭 研 究 員 農(nóng) 學 碩 士 預 防 獸 醫(yī) 學 動物流感病毒分子生物學 中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院 哈爾濱獸醫(yī)研究所 提交日期 2007 年 6 月 95 2007 獨 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下 進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果， 也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學院或其它教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。 與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學院有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學院有權(quán)保留送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內(nèi)容。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 導師簽名： 時間： 年 月 日 國農(nóng)業(yè)科學院 碩士學位論文評閱人、答辯委員會名單表 論文題目 型禽流感病毒進化分析及 型禽流感變異株疫苗株的構(gòu)建 論文作者 鐘功勛 專 業(yè) 預防獸醫(yī) 研究方向 動物流感病毒分子生物學 指導教師 陳化蘭 研究員 培養(yǎng)單位（研究所） 哈爾濱獸醫(yī)研究所 姓名 職稱 碩 （博）導師 單 位 專 業(yè) 簽 名 劉湘濤 研究員 碩導博導 蘭州獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學 評 閱 人 喬傳玲 副研究員 碩導 博導哈爾濱獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學 答辯 主席 李書華 研究員 碩導 博導黑龍江省獸醫(yī)局 預防獸醫(yī)學 李一經(jīng) 教授 碩導博導 東北農(nóng)業(yè)大學 預防獸醫(yī)學 劉思國 副研究員 碩導 博導哈爾濱獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學 馮 力 副研究員 碩導 博導哈爾濱獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學 答 辯 委 員 王靖飛 副研究員 碩導 博導哈爾濱獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學 會議記錄（秘書） 曾顯營 論文答辯時間地點 2007 年 6 月 12 日 哈爾濱獸醫(yī)研究所 要（一） 型禽流感病毒在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，而且對人類健康造成威脅。我國在 1994 年從廣東省某雞場中分離到第一株 型禽流感病毒，此后，該亞型禽流感病毒迅速在國內(nèi)蔓延，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重危害。 本實驗室李呈軍等人對 型禽流感病毒 19962002 年國內(nèi)分離株進行了系統(tǒng)的遺傳演化分析，所觀察到的病毒都是起源于 J/1/94毒，并且在進化過程中發(fā)生了復雜的基因重組。為了持續(xù)觀察國內(nèi) 型禽流感病毒的變化方向，本研究對 20032004 年中國大陸分離到的 13 株具代表性的 型禽流感病毒進行序列測定和遺傳演化分析。發(fā)現(xiàn)其中 11 株病毒的 因?qū)儆?J/1/94 群系， 因?qū)儆?J/1/94 或 K/7 群系，說明J/1/94 群系病毒仍是我國 毒流行的最主要類型。而另外兩株病毒 因均屬于 系；同時，我們對其中一株 系病毒 D/125/03 進行了全基因測序，通過遺傳分析發(fā)現(xiàn)其為 系病毒和其它群系病毒的自然重組毒株，表明 群病毒至少是該亞群病毒的一些基因節(jié)段在我國家禽中仍然存在并已進入雞群。而且這些類 毒具有不同的抗原性以及人流感病毒的受體結(jié)合位點。本研究結(jié)果強調(diào)應對 毒的防治及其公共衛(wèi)生意義予以高度重視。 流感病毒血凝素受體結(jié)合位點特性與病毒宿主特異性密切相關(guān)。本研究 13 株病毒中有 9 株病毒的血凝素 226 位氨基酸為 L，使病毒能與人類細胞中的 半乳糖苷鍵連接的唾液酸受體結(jié)合。特別是兩株 群病毒 D/123/03 和 25/03 的 合，呈現(xiàn)了典型的人流感病毒受體結(jié)合位點特性，與 1997 年香港禽流感病毒感染人事件發(fā)生時從鵪鶉中分離的 A/K/7( 1999 年香港女童中分離到的毒株 A/073/99（ 及早期 型人流感病毒相同。 部受體結(jié)合位點附近新增兩個潛在糖基化位點，有可能改變病毒的抗原性并影響受體結(jié)合特性而感染新的宿主，并進一步對人類公共衛(wèi)生造成威脅。 某些在同一地區(qū)不同種類家禽體內(nèi)分離到的病毒具有很高的同源性，表明當 型禽流感病毒進入某一地區(qū)后，常會引起該地區(qū)多種家禽同時感染，并且由于它的低致病性而使其更易長期在家禽間傳播，增加了防控難度。 關(guān)鍵詞： 流感，遺傳分析， 群 要（二） 型高致病性禽流感的爆發(fā)給世界養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性打擊，而且具有重要的公共衛(wèi)生學意義。疫苗免疫是預防高致病性 型禽流感的重要防線。流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立為流感病毒疫苗研制提供了有力工具。 利用我國分離的第一株 型禽流感病毒 A/，為我國禽流感疫情的防控工作做出了巨大貢獻。然而，自 2006 年以來，在國內(nèi)某些地區(qū)陸續(xù)分離到一些 型禽流感病毒抗原變異株，使用疫苗免疫后的雞群仍不能抵御這些病毒的感染。因此，我們有必要針對這些抗原變異株制備新的疫苗以阻止禽流感病毒的感染和蔓延。 本研究人工救獲了 型重組流感病毒株 X)/ 因來源于我國分離的 型高致病性禽流感病毒抗原變異株 A/(X/2/06)， 使疫苗株具有與國內(nèi)變異株相一致的抗原性。六個內(nèi)部基因來源于高滴度雞胚適應株 A/(，使病毒具有高滴度雞胚生長特性。通過分子修飾去除了 因裂解位點的多個連續(xù)的堿性氨基酸，使其具備了低致病性禽流感病毒的 因特征，令疫苗更具安全性。 利用該重組毒株制備的全病毒滅活疫苗在通過了本實驗室后續(xù)的生物學特性和安全性試驗后，證實其具有理想疫苗的所有特點并迅速投入生產(chǎn)應用，對這一抗原群病毒引發(fā)的高致病性禽流感疫情防控起到了關(guān)鍵性作用。 關(guān)鍵詞： 原變異株，疫苗，反向遺傳操作 V is as a to IV 994, 9IV in 9IV 9962002, of K/, 13 9N2 0032004 in 1 3 K/, K/, 1A A of 1A/25/03 is a 1a 9N2 It 1in to as as 1at A to be to 9N2 in in of A 226L at in In of 3 at 26 A, it to 6in 183, 226 at K/23/03 A /25/03, as 1 , of A be We in of A A 9N2 in of be it to G1 is of in a on is a to be a to by , in 006 to be be to of In 5X)/on (is to as of be to 5N1 in 錄 第一章 引言 . 1 流感病毒生物學特性 . 1 流感病毒的組成和復制 . 1 . 2 部基因功能 . 4 感的歷史及其流行現(xiàn)狀 . 6 致病性禽流感 . 6 致病性的 型禽流感 . 7 共衛(wèi)生意義 . 8 流感疫苗 . 9 活全病毒疫苗 . 9 單位疫苗 . 9 組活載體疫苗 . 9 . 10 向遺傳操作疫苗 . 10 向遺傳操作技術(shù)及其在流感病毒研究中的應用 . 11 向遺傳學和反向遺傳操作技術(shù) . 11 感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的發(fā)展過程 . 11 研究的目的和意義 . 12 第二章 型禽流感病毒表面蛋白基因遺傳演化分析 .料和方法 . 14 料 . 14 法 . 15 果 . 17 列測定結(jié)果 . 17 . 17 . 22 D/125/03 全基因組分析 . 27 論 . 27 第三章 型禽流感病毒重組滅活疫苗的構(gòu)建 .料與方法 . 29 料 . 29 法 . 31 果 . 33 . 33 X)/救獲和病毒鑒定 . 34 論 . 35 第四章 結(jié)論 .考文獻 .錄 .錄 1 13 株 型禽流感病毒 . 46 附錄 2 13 株 型禽流感病毒 . 50 致謝 .者簡歷 .文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 流感 流感病毒 芐青霉素抗性 bp 基對 血清白蛋白 補 TT 巰基蘇糖醇 二胺四乙酸 凝素 HI 凝抑制 致病性禽流感 丙基 Kb 堿基 道爾頓 LB B 培養(yǎng)基 ow 致病性禽流感 鐘 ml 升 經(jīng)氨酸酶 OD 密度 酸鹽緩沖液 合酶鏈式反應 pH of 堿值 糖核酸酶 SA 液酸 特定病原 43 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 禽流感（ 由 A 型流感病毒所引起的禽類的感染和 /或疾病綜合征。該病 1878 年首次發(fā)生于意大利，當時稱之為“雞瘟” ，現(xiàn)已幾乎遍布世界各地。 引起大多數(shù)家禽、野禽及水禽的感染，其中以雞和火雞最為易感，水禽則為流感病毒的自然宿主 (et 1980)。 1997 年之前，盡管人和其他靈長類動物可人工感染禽流感病毒，但在這些宿主體內(nèi)禽流感病毒的復制受到很大限制，使人們一直認為禽流感病毒在自然界不能跨越種間屏障直接感染人類，然而 1997 年香港爆發(fā)的 型禽流感導致 18 人感染，其中 6 人死亡，這一事件使人們清楚的認識到禽流感不僅可直接由禽感染人，而且還能致人死亡（ et 1998） 。 高致病性禽流感所造成的危害往往是迅即的，猝不及防的。與之相比，低致病性禽流感的發(fā)生是潛在性的。但是 樣可怕，同樣可以給養(yǎng)禽業(yè)帶來滅頂之災，對人類的威脅同樣存在。低致病性禽流感病毒的流行特點就是分布極為廣泛，危害持久和難以控制。尤其是 僅在全世界范圍的禽類中廣泛流行，而且可以感染人（ et 1999; et 1999） ，同時還是 97 年香港禽流感感染人事件的 內(nèi)部基因的供體（ et 1999） ，因此，對 究工作也非常重要。 禽流感病毒 (顯著的生物學特征之一就是亞型眾多，不同亞型病毒之間可以通過交換某些基因片段發(fā)生基因重排，出現(xiàn)具有新的生物學特征的病毒，而且其抗原變異頻繁，包括由點突變引起的抗原漂移（ 不同亞型毒株同源重組產(chǎn)生新亞型所引起的抗原轉(zhuǎn)變（ （ et 1981; et 1981） ，因此為禽流感的有效防制帶來了極大的困難和挑戰(zhàn)。 在美國和其他一些發(fā)達國家，對高致病力禽流感的控制與消滅主要是采取檢疫、撲殺和隔離措施。在我國，為了更好地防止該病的發(fā)生，在采取各種控制措施的同時，目前普遍采用的手段主要還是疫苗接種，且疫苗免疫已成為當今用來控制日益嚴重的禽流感疫情的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、主動措施和最后防線。在目前，重組滅活疫苗是應用最為廣泛的禽流感疫苗（ et 2003） ,它的安全性和有效性已經(jīng)在實踐中得到證實。 流感病毒生物學特性 流感病毒的組成和復制 禽流感病毒屬于正粘病毒科， 有囊膜，多形態(tài)的單股負鏈 因組分為 8 個節(jié)段，由大到小依次為 M、 個 末端均有 13 個高度保守的核苷酸， 即 3 3末端有 12 個保守核苷酸，中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 2 即 3在這些共有序列中，可部分互補，形成鍋柄環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是病毒 1 種病毒蛋白，其中 8種是病毒的組成成分（ ，長度最小的 位于細胞的線粒體中， 與流感病毒介導的細胞凋亡有關(guān) （ et 2001） 。病毒粒子外的脂質(zhì)囊膜伸出許多纖突，包括血凝素 (神經(jīng)氨酸酶 (兩種糖蛋白，也是病毒主要的表面抗原，根據(jù) 前己鑒定 16 種 種 et 1987; et 2004） 。 流感病毒 面具有受體結(jié)合位點（ ，可以識別和結(jié)合宿主細胞表面唾液酸受體 (et 1981)。病毒首先吸附于細胞表面受體上，通過由受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞。病毒粒子導入細胞的內(nèi)含體， 降低，導致 構(gòu)象改變，介導膜的融合，核衣殼隨之進入細胞質(zhì)，然后遷移至細胞核。由病毒的 別和切割宿主細胞 帽子結(jié)構(gòu)，作為轉(zhuǎn)錄的引物，合成病毒的 后翻譯成 三個聚合酶蛋白 M 基因每一個前體 生兩個成熟的 子，分別翻譯出 1， 白。為使復制開始， 要另一轉(zhuǎn)錄本 的合成無需引物啟動， 3端也無 )，其序列與 全互補，是 成的模板。三種類型的 在細胞核內(nèi)合成，在病毒感染的早期主要合成 后期基本上僅合成 白沿著高爾基體移動，定位到胞漿膜上，然后基質(zhì)蛋白、病毒的核衣殼、 次組裝形成子代病毒粒子。病毒蛋白和 裝完成后，病毒釋放部位的胞漿膜形成了子代病毒粒子的囊膜，將基質(zhì)蛋白和核衣殼包裹起來，病毒粒子最后以出芽方式從細胞膜上釋出。 A 和 因功能 與流感病毒和宿主細胞的吸附、融合和子代病毒粒子的釋放過程。流感病毒的宿主特異性、組織嗜性和致病力需要病毒從感染細胞中的有效釋放以及病毒和新靶細胞的有效結(jié)合。這是通過 體結(jié)合特性的調(diào)節(jié)和 活性的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的，從而使 活性達到最佳的平衡。 裂解與流感病毒致病性的關(guān)系 盡管 毒力是由多個基因決定的， 然而 最具決定性作用的 （ et 1999） 。病毒產(chǎn)生新的感染性粒子的必要條件是 須在宿主蛋白酶作用下裂解為 個亞單位。因此， 裂解活性對病毒感染和在宿主體內(nèi)的擴散是非常關(guān)鍵的。 裂解活性是由兩種結(jié)構(gòu)決定的，即裂解位點的氨基酸序列和裂解位點附近是否有糖基化位點。蛋白酶在組織中的不同分布和 這些酶的敏感性決定了流感病毒的組織嗜性。 解位點上游只有單個的堿性氨基酸 R，只能在呼吸道、消化道等少數(shù)細胞中被裂解，造成溫和感染或不表現(xiàn)臨床癥狀；而 解位點上游有多個連續(xù)的堿性氨基酸插入，可以在各種宿主細胞中裂解，造成感染動物全身系統(tǒng)衰竭，導致死亡（ et 1981） 。即使裂解位點處有多個堿性氨基酸，如果在該位點附近糖基化位點上的寡糖鏈將裂解位點遮掩起來，那么該毒株仍然表現(xiàn)中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 3 為低致病性， 但這種毒株在復制過程中糖基化位點如發(fā)生缺失， 則非常容易轉(zhuǎn)變?yōu)楦咧虏⌒远局?，例?1983西法尼亞爆發(fā) 流感就是由于低致病性禽流感病毒在 解位點附近丟失了 基化位點后轉(zhuǎn)變?yōu)楦咧虏⌒远局甓鸬拇罅餍校?et 1987; et 1984） 。 體結(jié)合與釋放的特異性 受體結(jié)合位點位于 單位的頂端，與連接在宿主細胞半乳糖表面的唾液酸（ 合 (et 1988)。流感病毒的 別兩種類型的 ，它們分別與 糖苷鍵或 糖苷鍵連接的半乳糖結(jié)合（ et 1995） 。 體結(jié)合位點氨基酸組成以及宿主細胞唾液酸種類和糖苷鍵類型在很大程度上影響流感病毒在不同宿主內(nèi)的復制能力。在典型禽流感病毒中， 226 位為谷氨酸，與 半乳糖連接的唾液酸結(jié)合，而在 型的人流感病毒中 226 則為亮氨酸，與 半乳糖連接的唾液酸結(jié)合 (et 1994; et 1983; et 1998; et 2000)。 1968年香港流感的 因是源于 ，對該病毒的前期病毒的氨基酸序列分析表明，在禽到人的傳遞過程中， 僅發(fā)生了 6 個氨基酸的改變，但是每個改變都發(fā)生在 子的頭部，也就是 近，這其中就包括 226 位的 成了 宿主不同，流感病毒的受體特異性也不同。人流感病毒的受體多為唾液酸 ，禽和馬流感病毒的受體主要是唾液酸 。相應的，在人的氣管上皮細胞表面主要含有 在馬的氣管和鴨的腸道主要含有得注意的是，在豬的氣管上皮細胞中同時含有 也就揭示了豬對人和禽的流感病毒都很敏感的原因。 基化和唾液酸化對受體親和性的調(diào)控作用 受體結(jié)合位點附近糖基化位點的變化是細胞嗜性和宿主范圍的重要決定因素（ et 1997） 。在 子的頭部和頸部具有 4潛在糖基化位點。 子受體結(jié)合位點附近的糖基化和唾液酸化對流感病毒從宿主細胞內(nèi)的釋放起調(diào)控作用，并因此而影響到病毒的致病力和組織嗜性 (et 1999; et 1997) 。寡糖鏈的存在由于空間位阻效應會降低 受體結(jié)合的親和性，寡糖鏈表面發(fā)生唾液酸化以后，部分或全部的占據(jù)了受體結(jié)合位點，使得 有當 面的唾液酸裂解以后 能獲得完全的受體結(jié)合能力 (et 2000; et 2001)。 過比較鴨和人流感病毒基酸序列及其糖基化位點，認為 基化位點的數(shù)目和分布對流感病毒宿主的特異性也有一定的影響 (et 1993)。 流感病毒從宿主細胞釋放的過程中需要 唾液酸酶活性裂解宿主細胞的唾液酸，所以流感病毒 受體結(jié)合特性和 受體裂解特性以及 頸部區(qū)長度應該是相匹配的。 第一章 引言 4 和 相匹配會限制重排病毒的增殖。 頸部長度和序列在不同亞型病毒會有所不同 (et 1982)。 頸部起到支持作用，將 酶活性位點暴露在病毒囊膜表面，使 活性位點和底物充分接觸而發(fā)揮作用。 部基因功能 合酶蛋白（ 流感病毒的聚合酶 由 3 個最大的 段（ 1碼的三種蛋白質(zhì)，分別為 9687 85中 堿性蛋白， 酸性蛋白。其氨基酸序列有一個共同特點，均有特定的親核序列