密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 碩士學位論文 鑒別豬瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的 復合實時熒光定量 法的建立與評價 of a of 士 研 究 生：趙建軍 指 導 教 師：仇華吉 研究員 申請學位類別：農(nóng)學碩士 專 業(yè)：預防獸醫(yī)學 研 究 方 向：分子病毒學與免疫學 培 養(yǎng) 單 位：中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院 哈爾濱獸醫(yī)研究所 提交日期 2007 年 6 月 of a of . 007 獨 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下 進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學院或其它教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關于論文使用授權的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學院有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學院有權保留送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學位論文在解密后應遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時間： 年 月 日 導 師 簽 名： 時間： 年 月 日 論文評閱人、答辯委員名單 論文題目 鑒別豬瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的 復合實時熒光定量 法的建立與評價 論文作者 趙建軍 指導教師 仇華吉 研究員 培養(yǎng)單位 哈爾濱獸醫(yī)研究所姓名 職稱職務 導師類別 單位 專業(yè) 評 閱 人 答辯 主席 劉文周 教 授 博導 東北農(nóng)業(yè)大學 預防獸醫(yī)學劉文周 教 授 博導 東北農(nóng)業(yè)大學 預防獸醫(yī)學師東方 教 授 博導 東北農(nóng)業(yè)大學 預防獸醫(yī)學喬傳玲 副研究員 碩導 哈爾濱獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學劉長軍 副研究員 碩導 哈爾濱獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學張 云 副研究員 碩導 哈爾濱獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學答 辯 委 員 答辯時間、地點 2007 年 6 月 13 日于哈爾濱獸醫(yī)研究所學術報告廳 記 錄 劉家森 摘 要 豬瘟（ 由豬瘟病毒（ 起的一種高度接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（列入 病名錄（為須申報的（動物傳染病。近年來，我國豬瘟的流行和發(fā)病特點發(fā)生了很大的變化，在臨床表現(xiàn)上趨于非典型化，主要表現(xiàn)為隱性帶毒和慢性感染，成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的一大隱患。 同屬的牛病毒性腹瀉病毒 1 型（ 牛病毒性腹瀉病毒 2 型（、綿羊邊界病病毒（和長頸鹿瘟病毒（of 都屬于是黃病毒科（瘟病毒屬（ 成員，由于瘟病毒屬其它成員大都可以感染豬，與 在血清學交叉反應，因此給豬瘟診斷造成一定干擾。此外，豬瘟兔化弱毒疫苗（在我國的大規(guī)模應用，為控制豬瘟起到了重要作用，但同時也給傳統(tǒng)的診斷方法對 毒感染豬和疫苗接種豬的鑒別診斷帶來較大困難。 本研究旨在建立一種復合熒光定量 于過對公布的 34 株 其 5端非編碼區(qū)設計了一對針對毒株和兔化弱毒疫苗株的特異性解探針，建立了一種能區(qū)分 異、重復性好的復合熒光定量別診斷方法。該方法能將我國大陸流行的不同基因亞群（ 因亞群）的 106別可檢測到初始模板中 （野毒）或 （弱毒）拷貝的病毒與本實驗室建立的復合式 敏感性相近，二者對 152 份不同樣品（包括細胞培養(yǎng)物和臨床現(xiàn)地樣品）檢測陽性符合率分別為 野毒） 和 100%（兔化弱毒疫苗）。應用復合熒光定量 06 份現(xiàn)地樣品檢測發(fā)現(xiàn)， 32/106）。 應用本方法對人工感染 106 14示了時發(fā)現(xiàn)，人工感染豬在感染后第2 天在其全血中就可檢測到病毒而同居感染豬在出現(xiàn)豬瘟臨床癥狀前 34 應用本方法對 8 份豬瘟兔化細胞疫苗原液效價的檢測，證實本方法與兔體反應熱法在疫苗效價測定上具有良好的相關性，初步確定細胞疫苗樣品中病毒含量為 07拷貝/當于 5104 上時才可以用于制苗。 本方法可以及早對豬瘟爆發(fā)做出準確快速診斷，防止疫情蔓延；可以將 毒感染豬迅速從免疫豬群中篩查出來并予以清除，有利于豬瘟的凈化和無豬瘟疫區(qū)的建立；同時本方法還可輔助傳統(tǒng)的兔體定型熱反應用于豬瘟疫苗效價估測、病機制研究以及豬瘟疫苗免疫攻毒保護效力評價。 關鍵詞：豬瘟病毒，豬瘟兔化弱毒疫苗，復合熒光定量 針，鑒別診斷I is a of In a in of in or in ( of to be It is to by to On it to is to a of of 4 of in of of in no to of of of 2.2 .3 an 0601L of by of to 1.8 of a CR of (00% ( 52 06 ( of by To in of 06 or by 4 to NA in of as NA in to of is an in I NA by It 07NA 104 be By be to a be in 目 錄 第一章 緒 論 .瘟和豬瘟病毒概述 . 1 豬瘟 . 1 豬瘟病毒及其基因組結構 . 1 豬瘟病毒的編碼蛋白及其功能 . 2 豬瘟病毒的遺傳分型 . 5 豬瘟兔化弱毒疫苗 . 6 光定量 . 6 熒光定量術的原理 . 7 熒光定量術的兩種定量形式 . 7 熒光定量術的種類 . 8 熒光定量術在動物疾病檢測中的應用 . 9 瘟診斷方法研究現(xiàn)狀 . 9 病原學檢測 . 9 血清學檢測 . 10 間接免疫熒光試驗 . 11 間接血凝試驗 . 11 分子診斷 . 12 鑒別 診斷 . 14 研究的背景與目的 . 15 第二章 鑒別豬瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的復合熒光定量 . 16 料與方法 . 17 毒株、細胞與質粒 . 17 主要實驗儀器及試劑 . 17 引物和探針 . 18 病毒 . 18 復合熒光定量性標準品 . 20 常規(guī). 20 復合熒光定量應條件的優(yōu)化 . 20 特異性試驗 . 21 敏感性試驗 . 21 復性試驗 . 22 合熒光定量復合符合率試驗 . 23 毒分離試驗 . 22 合熒光定量現(xiàn)地樣品的檢測和種系發(fā)生分析 . 22 果 . 23 . 23 合熒光定量應參數(shù)的優(yōu)化結果及標準曲線的建立 . 23 合熒光定量特異性 . 26 合熒光定量敏感性 . 26 合熒光定量重復性 . 26 合熒光定量復合符合率 . 27 毒陽性樣品的病毒分離驗證 . 27 合熒光定量現(xiàn)地樣品的檢測和種系發(fā)生分析 . 28 論 . 30 第三章 復合熒光定量 . 32 料與方法 . 33 驗動物及病毒 . 33 器和試劑 . 33 驗動物的人工感染 . 33 血中病毒提取和合成 . 33 工感染豬全血中豬瘟病毒的檢測 . 33 染豬各組織中豬瘟病毒的檢測 . 33 果 . 34 工感染豬臨床表現(xiàn)和體溫檢測 . 34 工感染豬全血中豬瘟病毒的檢測 . 34 瘟病毒在感染豬體內(nèi)的復制動態(tài) . 35 瘟病毒在感染豬各組織中的分布 . 36 論 . 36 第四章 應用復合熒光定量 . 38 料與方法 . 39 苗與實驗動物 . 39 劑和儀器 . 39 體定型熱法測定疫苗效價 . 病毒 . 豬瘟兔化弱毒疫苗病毒度的檢測 .果 . 豬瘟細胞苗的兔體熱反應結 果 . 39 合熒光定量量檢測結果 . 40 論 . 41 第五章 結 論 . 43 參考文獻 . 44 致 謝 . 51 作者簡歷 . 52V 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 羊邊界病病毒 病毒性腹瀉病毒 瘟 瘟病毒 到閾值的循環(huán)數(shù) 碳酸二乙酯 聯(lián)免疫吸附試驗 光定量 og 豬瘟兔化弱毒 接免疫熒光試驗 疫過氧化物酶單層試驗 道爾頓 放讀碼框 酸鹽緩沖溶液 PK 腎細胞 制性片段多態(tài)性分析 數(shù)兔體感染劑量 轉錄套式聚合酶鏈式反應 轉錄聚合酶鏈式反應 基羅丹明 數(shù)組織細胞感染量 ,2,7氯基熒光素 翻譯區(qū) VI 毒分離 國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒 論 第一章 緒 論 瘟和豬瘟病毒概述 瘟 豬瘟（ 是由豬瘟病毒（ 起豬的一種以高熱稽留、出血、梗死、壞死和高死亡率為主要特征的高度接觸性傳染?。╡t 2005）。世界動物衛(wèi)生組織（將其列入 病名錄（為須申報的（動物傳染病之一，我國將其列為一類傳染病。 據(jù)世界糧農(nóng)組織世界動物衛(wèi)生組織世界衛(wèi)生組織（版的動物衛(wèi)生年鑒 （ 1992）公布，全世界有44 個國家和地區(qū)存在豬瘟，主要分布在南美、歐洲和遠東的一些國家和地區(qū)。截止到1976年，阿爾巴尼亞、保加利亞等12 個國家宣布消滅了豬瘟。到1992年底又有美國、日本等9 個國家宣布為無豬瘟國家，此外還有新西蘭、澳大利亞和斯堪的納維亞半島的國家也相繼宣布消滅了豬瘟。目前該病主要在亞洲、歐洲、非洲、美洲的國家與地區(qū)流行。在我國，當前各省市均有豬瘟的流行，每年因豬瘟死亡的約占病死豬的1/3以上（杜念興，1998 ）。 豬瘟具有高度接觸傳染性，發(fā)病率、死亡率高，流行廣泛，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。在荷蘭僅 1983 和 1984 年度為控制豬瘟的直接開支就為 荷蘭盾。面對如此大的經(jīng)濟損失，世界各國紛紛開始制定和執(zhí)行豬瘟防制和根除計劃，在英國 1963 1966 三年半時間內(nèi)為此耗資1200 萬英鎊，宣布為無豬瘟國家；美國 19621978 年為根除豬瘟花費 美元；比利時 1990年爆發(fā)豬瘟銷毀豬只直接經(jīng)濟損失達 美元。 瘟病毒及其基因組結構 根據(jù)最新的第八次國際病毒分類委員會報告（et ， 2004）：豬瘟病毒（牛病毒性腹瀉病毒1 型（，、牛病毒性腹瀉病毒2 型（、綿羊邊界病病毒（ 長頸鹿瘟病毒（of 成了黃病毒科瘟病毒屬5 個確定的成員。 et 1996 ；et ，1996 ；et 1996 ），5 端無帽子結構，3 端也沒有多聚腺苷酸（ ）尾。含有一個大的開放性讀碼框（ ，由其編碼一條約3898 個氨基酸的多聚蛋白，在病毒和宿主細胞蛋白酶的作用下，多聚蛋白在翻譯和翻譯后加工過程中形成12 種成熟的病毒蛋白，在聚蛋白上從N 端到C 端的順序依次為： C、 0 ）、 圖1表1 ，其中 C、 復制是必不可少的（et ，1989；et ， 1990）。 編碼構蛋白的基因主要定位于基因組5 端 1/3部分，包括核衣殼蛋白，C ）和3- 1 - 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒 論 種囊膜糖蛋白（： 8 ）、 El（和 E2（。 8種非結構蛋白（，除 碼其他非結構蛋白的序列定位于端 2/3部分（et ，1996；1996 ）。大多數(shù)非結構蛋白的功能目前還不是很清楚。 病毒基因組制和病毒蛋白表達的主要調控區(qū)。 5et ， 1990；et ，1995 ；et ， 1994），而3 能含有起始基因組成的啟動子、增強子等順式作用元件。 通過測定 種結構糖蛋白的N 端，確定1 、N 端分別位于氨基酸殘基構蛋白的加工是由宿主細胞的信號酶介導的，蛋白酶首先在核衣殼蛋白 后在 后2。在最后這三種囊膜糖蛋白通過分子內(nèi)或分子間二硫鍵形成復合物（et ，1998 ）。兩側的非翻譯區(qū)（，存在一段17個核苷酸的互補序列，在內(nèi)是非常保守的。在5 碼子和一個高度結構化的核糖體進入位點（。 其 5邊界位于核苷酸2866間，這些核苷酸形成一個莖環(huán)結構（發(fā)卡B ），該結構可能對于活性十分重要（et ，1997 ）。 圖 1因組結構示意圖 1 豬瘟病毒的編碼蛋白及其功能 ，此 98個氨基酸殘基，分子量約438進一