密級 論文編號： 中國農業(yè)科學院 學位論文 桑種質資源的遺傳多樣性及分子系統(tǒng)學研究 of 士研究生：趙衛(wèi)國 指 導 教 師：潘一樂 黃勇平 申請學位類別： 農學博士 專 業(yè) ：特種經濟動物飼養(yǎng) 研 究 方 向：桑樹遺傳育種 培 養(yǎng) 單 位：蠶業(yè)所 提交日期 2005 年 6 月 of 2005 論文答辯委員會成員名單 答辯委員會主席：樓程富 研究員 浙江大學 答辯委員會成員： 蔡偉明 研究員 中國科學院上海植物生理生態(tài)研究所 黃自然 教 授 華南農業(yè)大學 吳大洋 教 授 西南農業(yè)大學 秦 利 教 授 沈陽農業(yè)大學 郭錫杰 研究員 中國農科院蠶業(yè)研究所 黃君霆 研究員 中國農科院蠶業(yè)研究所 論文答辯日期：2005 年 6 月 獨 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農業(yè)科學院或其它教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 趙衛(wèi)國 時間： 2005 年 6 月 20 日 關于論文使用授權的聲明 本人完全了解中國農業(yè)科學院有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：中國農業(yè)科學院有權保留送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意中國農業(yè)科學院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內容。 (保密的學位論文在解密后應遵守此協(xié)議) 研究生簽名：趙衛(wèi)國 時間：2005 年 6 月 20 日 導師簽名： 潘一樂 時間：2005 年 6 月 21 日 摘 要 桑樹是多年生的重要經濟作物，是家蠶的唯一飼料。桑樹在我國地理分布廣，易適應不同的生態(tài)環(huán)境，容易通過自然和人工雜交，這些特性形成了豐富的桑樹種質資源。利用 子標記，本文開展了桑種質資源的遺傳多樣性和分子系統(tǒng)發(fā)育研究，對桑種質的鑒定、保護、利用、核心種質的構建和遺傳育種具有重要的實用價值和理論意義。本論文的主要研究內容如下： 一、桑樹栽培種和野生種間遺傳多樣性的 較分析 構建了一個桑樹（15微衛(wèi)星富集文庫，篩選出了 10 對具有多態(tài)性的物。首次利用新的物和已報道的 5 對物以及篩選出的物，研究了 27 個桑樹品系（包括19 個栽培種和 8 個野生種品系）的遺傳多樣性。 15 個物共擴增條帶為 138 條，多態(tài)性條帶為 126 條，多態(tài)性比例為 平均多態(tài)性信息含量（）為 15 對物每個位點平均等位基因數(shù)為 均 樹品系間示的平均遺傳相似系數(shù)分別為 種標記揭示野生種內所有遺傳多樣性指數(shù)高于栽培種內，說明栽培、馴化引起了桑樹遺傳多樣性的丟失。利用構建的類圖，野生種和栽培種有較遠的親緣關系?；趽?jù)的主成分分析(支持 較記，發(fā)現(xiàn)記多態(tài)性較高，有較強的信息量，并進行了記的相關性測驗。根據(jù)研究結果，進一步提出了桑樹種質資源的保護策略。 二、我國桑樹選育品種 紋圖譜的構建及遺傳多樣性分析 利用 記構建了 24 個選育桑品種的指紋圖譜，用 3 種獨立的方法（特殊的標記；特異的譜帶類型；不同引物提供的譜帶類型組合）可以有效地鑒別桑樹選育品種，證明 記在桑樹品種的鑒別方面是一個有效的工具和方法。 17 個 物共擴增出 80 條帶， 40 條帶具有多態(tài)性，占 24 份選育桑樹品種間平均遺傳相似系數(shù)、 s 基因多樣性（和 s 信息指數(shù)分別為 樹選育品種間的遺傳多樣性較低，說明我國選育桑品種間遺傳距離較小，親緣關系較近，遺傳基礎較狹窄。 聚類和 4 個桑樹選育品種的親緣關系，聚類結果與桑樹品種的系譜基本一致。 三、我國不同生態(tài)型桑樹品種遺傳多樣性的 析 利用記評價了我國 8 個不同生態(tài)類型桑樹群體結構和遺傳變異。來源 8 個生態(tài)類型的 66 個桑樹地方品種間， 12 個物總擴增條帶數(shù)為 83， 50 條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為 平均為 雜合度（ 體內雜合度（為 體間多樣性為（ 體間的遺傳分化系數(shù)（為 明群體間的變異大于群體內的變異。基因流（為 明群體間遺傳漂移引起了當?shù)剡z傳差異及群體分化。平均遺傳相似系數(shù)為 8 個群體間的遺傳相似系數(shù)變異范圍為 明不同群體間的遺傳多樣性存在差異。 根據(jù)記遺傳相似系數(shù)按對 66 個地方桑樹品種進行了聚類分析。從聚類結果來看，每個生態(tài)型的大部分桑樹品種聚為一類。 樹二倍體及人工誘導同源四倍體遺傳變異的 析 利用 子標記技術，對 6 份二倍體桑樹品種和經秋水仙素化學誘變得到的同源四倍體間的 傳差異進行了研究。農桑 8 號、湖桑 197 號、育 2 號的二倍體及其同源四倍體間擴增條帶完全一致，無差異，湖桑 32 號二倍體及其同源四倍體 態(tài)性最高，達到了 說明不同桑樹材料經秋水仙素誘變后在 子遺傳結構上差異較大。 五、桑樹無性系遺傳變異的 步分析 利用 步分析了桑樹無性繁殖系的遺傳變異，在田間和組織培養(yǎng)無性系中僅檢測到 1個變異，此結果說明桑樹通過無性繁殖方法繁殖個體僅存在少量遺傳變異，遺傳性狀穩(wěn)定。 六、鳳尾桑及其芽變品系間遺傳變異的 析 利用 物，從分子水平分析了鳳尾桑及其芽變株系的遺傳變異。從 8 個 物擴增結果來看，3 個引物的擴增產物在株系間無差異，從變異株系擴增條帶來看，鳳尾芽變變異最大。本結果從分子水平證明了芽變株系的遺傳結構差異。 七、基于 列研究桑屬（蕁麻目：?？疲┫到y(tǒng)發(fā)育 用 物直接測序法對 9 個種 3 個變種共 13 份桑種質和構屬構樹的 列進行了測定。結果表明：桑屬植物 度平均約為 189 屬 152 度平均為 212 屬 列 G+C 含量大約為 60%左右。構建了桑屬 列的系統(tǒng)發(fā)育樹，桑屬所有材料聚為一類，并探討了參試桑種質的親源關系。 八、基于 隔區(qū)序列研究桑屬（蕁麻目：?？疲┫到y(tǒng)發(fā)育 用 物直接測序法對 12 個種 4 個變種共 25 份桑種質和構屬構樹的 因間隔區(qū)序列進行了測定，桑屬內該序列長度變異范圍為 360367) ) ) )，平均 A+T 含量為 明該序列富含 A/T。由 因間隔區(qū)序列構建了其分子系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結果表明薔薇科所有材料聚為一類；菊科的所有材料聚為一類；?？浦械纳俸湍静ぬ}屬，無花果屬和構屬親緣關系較近，總的形成了桑科的姐妹群，表明它們親緣關系較近。桑屬所有材料聚為一類，證明桑屬為單系，并探討了桑屬的親源關系。 關鍵詞: 桑樹，遺傳多樣性，L.) is a as it is is to in NA in it be of as 1. of as SR (5 SR 0 to 7 9 5 138 NA 26 ( of 5 an an IC SR of by It of of SR SR in of in a of 7 a of of to 2. of of 4 a in to a) b) c) a of by 17 0 40 of eis h) s I) of of CA 4 to 3. of as 12 a 3 of 0 6 IC H T), H S), D of G of of A of 6 of on 4. of of to by no , 97 u 2 2 . of by 5. A of in as of in in 6. as he at of 3 no of . of on TS 3 of CR of is 89 bp 11 52 +C is 0%. TS of 8. of on he 5 2 of by CR 60 67) ) ) ), +T a . of of a to We of to of a 目 錄 第一章 緒論 1 研究目的和意義 1 國內外研究現(xiàn)狀 3 桑樹的分類簡史 3 分子系統(tǒng)學的研究方法及其在桑樹分子系統(tǒng)學研究上的應用 6 12 分子系統(tǒng)學研究的主要基因種類及其在桑屬系統(tǒng)學研究中的應用 17 研究內容和方法 20 利用微衛(wèi)星富集程序，開展桑樹微衛(wèi)星的分離與鑒定研究 20 利用 記，研究桑樹栽培種和野生種遺傳多樣性 21 利用 記，構建我國育成桑樹品種的指紋圖譜及其遺傳多樣性分析 21 利用 記，研究不同生態(tài)型桑樹品種的遺傳多樣性 21 利用 記，研究桑樹二倍體及人工誘導同源四倍體的遺傳變異 21 用 記，研究桑樹無性系的遺傳變異 21 利用 記，研究鳳尾桑及其芽變品系間遺傳變異 21 利用 物直接測序法，測定桑屬 列，研究其系統(tǒng)發(fā)育 21 利用 物直接測序法，測定桑屬 隔區(qū)序列，研究其系統(tǒng) 發(fā)育 21 第二章 桑樹微衛(wèi)星位點的分離與鑒定 22 材料與方法 22 試驗材料 22 桑樹基因組 提取 22 桑樹基因組 酶切反應及提純 24 酶切產物的純化 24 準備接頭( 25 接頭連接反應 25 25 生物素化 26 磁珠捕獲 26 26 載體連接 26 電轉感受態(tài)細胞的制備 27 感受態(tài)電轉 27 涂板 28 克隆的篩選 28 測序和設計引物 28 增體系 28 泳 28 數(shù)據(jù)分析 28 結果 29 桑樹基因組 離 29 微衛(wèi)星基因組文庫構建與堿基序列分析 30 桑樹微衛(wèi)星的多態(tài)性檢測 30 討論33 第三章 桑樹栽培種和野生種間遺傳多樣性的 較分析 34 材料與方法 35 試驗材料 35 桑樹基因組 35 35 36 數(shù)據(jù)分析 36 結果 37 37 遺傳相似系數(shù)和聚類分析 40 記的相關分析 41 討論 41 41 42 桑種質資源資源保護策略的思考 42 第四章 我國桑樹選育品種 紋圖譜的構建及遺傳多樣性分析 50 材料和方法 51 試驗材料 51 桑樹基因組 提取 51 析 51 擴增、電泳、數(shù)據(jù)分析 51 結果 51 樹選育品種間的態(tài)性 51 桑樹選育品種的子鑒定 55 桑樹選育品種的遺傳變異及聚類分析 56 討論 60 第五章 我國不同生態(tài)型桑樹品種遺傳多樣性的 析61 材料與方法 61 試驗材料 61 桑樹基因組 提取、增、電泳 61 數(shù)據(jù)分析 61 結果 64 群體間 態(tài)性 64 遺傳多樣性及聚類分析 65 討論 69 群體間遺傳多樣性及聚類分析 69 群體樣本大小 69 生物保護的含義 69 第六章 桑樹二倍體及人工誘導同源四倍體遺傳差異的 析71 材料與方法 71 試驗材料 71 桑樹基因組 提取、擴增、電泳及數(shù)據(jù)分析 71 結果 71 桑樹品種間的多態(tài)性 72 桑樹二倍體及人工誘導同源四倍體的態(tài)性 73 供試材料間的遺傳相似系數(shù)及聚類結果 74 討論 75 同源材料間的多態(tài)性 75 二倍體及人工誘導同源四倍體桑樹品種性狀差異的原因分析 75 第七章 桑樹無性系遺傳變異的 析77 材料和方法 77 結果 77 桑樹田間和試管苗無性繁殖個體 傳變異 77 桑樹品種間 傳變異 79 討論 80 第八章 鳳尾桑及其芽變品系間遺傳變異的 析 81 材料與方法 81 結果 81 討論 83 第九章 基于 列研究桑屬（蕁麻目：?？疲┫到y(tǒng)發(fā)育84 材料與方法 84 試驗材料 84 桑樹基因組 提取 84 列的擴增 84 增產物的純化和測序 84 列分析 85 實驗結果 85 桑屬 列的長度、G+C 含量 85 桑屬 列的聚類分析 87 論 87 第十章 基于 隔區(qū)序列研究桑屬 （蕁麻目：?？疲┫到y(tǒng)發(fā)育89 料與方法 89 試驗材料 89 桑樹基因組 提取 89 列的擴增 89 增產物的純化和測序 89 列分析 90 結果 91 桑屬 特點 91 桑屬 因間隔區(qū)序列同源性的比較和進化分析 91 討論 92 桑屬 因間隔區(qū)序列和 列的比較 92 桑屬 因間隔區(qū)序列的聚類結果分析 92 結論與討論 94 參考文獻 98 附錄 108 致謝114 作者簡歷116 十六烷基三甲基溴化胺 聚乙烯吡咯烷酮 氨芐青霉素 5- 溴哚- - 硫代半乳糖苷 異丙基- 硫代- 乳糖苷 寡核苷酸 SR：簡單序列重復 聚合酶鏈式反應 聚丙烯酰胺凝膠 內轉錄間隔區(qū) 葉綠體 堿基對 脫氧核糖核酸 乙二胺四乙酸 線粒體 核核糖體 十二烷基硫酸鈉 類平均法聚類 脫氧核糖核酸 二烷基硫酸鈉 氧核苷三磷酸 ,N,N,NN,N,N,N態(tài)性信息含量 成分分析 HE:望雜合度 HO:察雜合度 W/B 滌緩沖液 第一章 緒論 第一章 緒 論 研究目的與意義 我國是蠶桑生產起源地，栽桑、養(yǎng)蠶歷史悠久，蠶繭產量居世界首位。蠶業(yè)對中華民族的繁榮昌盛，對世界物質文明與文化交流作出了杰出的貢獻。我國地域遼闊，生態(tài)環(huán)境各異，經長期的自然選擇和人工選育，形成了豐富的桑樹種質資源，不少種為我國特有。開展桑樹種質資源遺傳多樣性和分子系統(tǒng)學研究，這對桑種質的親緣關系鑒定、保存、利用、核心種質的構建、評價及桑樹育種都具有重要的實用價值和理論意義。 桑樹是多年生的重要經濟作物，是家蠶的唯一飼料，目前我國有桑種質資源 3000 余份。由于桑是異花授粉植物，自然界分布極廣，很易雜交，又能通過無性繁殖，所以易于形成過渡類型，且易于保留，因此通過長期的自然雜交和人工雜交繁殖，使桑樹遺傳背景十分復雜, 使桑屬（ 許多種（及變種（ 。自從 1753 年林奈將桑屬分為五