密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 因介導(dǎo)抗大麥黃矮病毒 轉(zhuǎn)基因小麥研究 NA 士研究生 ：燕飛 指導(dǎo)教師 ：成卓敏 申請學(xué)位類別 ：農(nóng)學(xué)博士 專業(yè)：植物病理學(xué) 研究方向 ：植物抗病毒基因工程 培養(yǎng)單位 ：研究生院 植物保護(hù)研究所 提交日期 2006 年 6 月 NA 006 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果， 也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。 與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時間： 年 月 日 摘 要 在以往的抗 基因小麥研究中，已經(jīng)使用的策略有 因介導(dǎo)的病毒抗性、復(fù)制酶基因介導(dǎo)的病毒抗性、運(yùn)動蛋白基因介導(dǎo)的抗性，雖然這些抗性手段對 有延遲發(fā)病的抗性作用，但一直沒有獲得能夠達(dá)到高度抗性水平的抗 基因小麥植株。同時，這些抗性手段都具有專一性，只對基因來源病毒表現(xiàn)抗性，對其他病毒沒有作用，即不具有廣譜性。本文從進(jìn)一步提高對 特異抗性和病毒廣譜抗性兩個方面入手進(jìn)行小麥轉(zhuǎn)基因研究，希望獲得高抗 轉(zhuǎn)基因小麥植株和具有廣譜病毒抗性的轉(zhuǎn)基因小麥。 在提高對 性的轉(zhuǎn)基因小麥研究方面，利用 系的復(fù)制酶基因（片段和外殼蛋白基因（片段構(gòu)建成可表達(dá)復(fù)合發(fā)夾 含有由 段雙鏈（鏈）成的莖和反義 義復(fù)制酶片斷）成的環(huán)的表達(dá)框架，將該框架分別連入含有 5S 啟動子和 動子的真核表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（轉(zhuǎn)35S:基因槍法（轉(zhuǎn) 花粉管通道法（分別轉(zhuǎn)P+/小麥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，基于該結(jié)構(gòu)表達(dá)的 擾機(jī)制而達(dá)到特異性高度抗病毒的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的 82 株 性植株中有 75 株 果呈陽性；經(jīng)過第一次病毒抗性試驗(yàn)，有 59 株未發(fā)病或只有輕微癥狀； 測表明 59 株抗性植株中有 46 株整合有外源基因； 7株能夠正常表達(dá)外源基因； 果表明外源基因在小麥體內(nèi)多以雙拷貝形式存在；第二次病毒抗性試驗(yàn)表明，在 陽性的 37 株再生植株中有 14 株表現(xiàn)低度抗性，有 12 株表現(xiàn)中度抗性，有 10 株表現(xiàn)高度抗性，另外 1 株在實(shí)驗(yàn)過程中死亡。在基因槍法轉(zhuǎn)化中，因未使用標(biāo)記基因，故應(yīng)用改進(jìn)的葉片快速 再生幼苗在生根階段進(jìn)行篩選，共移栽成活 64 株快速 性植株；經(jīng)第一次病毒抗性試驗(yàn)有 30 株表現(xiàn)抗性，果表明其中 21 株整合有外源基因；經(jīng)第二次病毒抗性試驗(yàn)， 21 株 性植株中有 5 株表現(xiàn)低度抗性，有 8 株表現(xiàn)中度抗性，有 8 株表現(xiàn)高度抗性。通過花粉管通道法獲得轉(zhuǎn) 67 粒，獲得轉(zhuǎn) 45 粒；對 幼苗進(jìn)行大田抗病性鑒定結(jié)果表明，有 2 株轉(zhuǎn) 0 天后仍沒有明顯發(fā)病癥狀。 在提高病毒抗性譜方面，利用克隆自粟酒酵母的 因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥。該基因是一種 鏈分解酶。由于大多數(shù)植物病毒為 毒，不管其基因組是單鏈還是雙鏈，在寄主體內(nèi)復(fù)制過程都會有一個雙鏈 間體階段，如果通過基因工程手段將 因轉(zhuǎn)入植物體，利用其降解病毒 活性而阻斷病毒復(fù)制過程，就有可能達(dá)到抗植物病毒病的目的。并且 作用靶位點(diǎn)只針對 鏈，對 序列無特殊要求，這就擴(kuò)大了其對病毒抗性譜。本轉(zhuǎn)化試驗(yàn)共獲得 41 株 性植株；經(jīng)第一次病毒抗性試驗(yàn)獲得 30 株抗性植株；其中 27 株 果呈陽性； 果表明 27 株整合有外源基因的再生植株中有 25 株能夠正常表達(dá)外源基因；經(jīng)第二次病毒抗性試驗(yàn)，獲得 12 株低度抗性植株，12I 株中度抗性植株， 1 株高度抗性植株。對于轉(zhuǎn) 因小麥能否對其他小麥病毒表現(xiàn)抗性、真正達(dá)到廣譜抗病毒的目的，我們將在后續(xù)的工作中做進(jìn)一步研究。 最后，針對構(gòu)建 需要多次連接反應(yīng)的問題，設(shè)計(jì)了一個含有新型表達(dá)框架的雙元載體，只要通過 1 步連接反應(yīng)既可構(gòu)建完成可表達(dá)目的基因 真核表達(dá)載體。以轉(zhuǎn)有綠色熒光蛋白的煙草中的 沉默目的基因，通過農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)成功地沉默了煙草中的就證實(shí)了該載體的有效性。該載體可廣泛應(yīng)用于植物功能基因組研究、病毒沉默抑制蛋白研究、植物抗病毒基因工程研究。 關(guān)鍵詞：大麥黃矮病毒，小麥，轉(zhuǎn)基因，擾， 因，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，基因槍法，花粉管通道法 by in by of in In we of in to of To of P) to an NA P) NA P( 5S mu in to NA of so 5S:P- P+/P- to as 75 2 CR In 59 5 6 9 in ot in as of 7 6 7 14 of 12 0 In no a CR to at of 4 in CR No 0 4 in 1 ot in In 5 1 of 8 367 45 P- by T1 in to 0 In As NA be NA in 1 418, in 0 in ot 7 of 0 in 5 7 of 12 of 12 of of To of to a of be in To of to NA in 6c be on It be to V 目 錄 第 1 章 文獻(xiàn)綜述 .麥黃矮病毒研究進(jìn)展 . 生物學(xué)特征 .主范圍和癥狀 .系及分布 .毒傳播特點(diǎn) .毒顆粒結(jié)構(gòu) . 分子生物學(xué)特征 .因組結(jié)構(gòu) .因產(chǎn)物的功能 .病毒轉(zhuǎn)基因植物研究進(jìn)展 . 病毒基因介導(dǎo)的抗病性 .殼蛋白( 基因 .制酶基因( .動蛋白(基因 . 11 星 . 11 擾介導(dǎo)的抗性 . 非病毒來源的基因介導(dǎo)的抗性 .物抗病基因 .糖體失活蛋白(.酶(.體(.5 解酶介導(dǎo)的抗性 .擾與植物抗病毒 . 程 .起始 .裝配 .用特點(diǎn) . 病毒編碼的 默抑制蛋白 .1 白 .2 蛋白 .b 蛋白 .S 蛋白 .他抑制蛋白 . 術(shù)在植物抗病毒基因工程中的應(yīng)用 . 第 2 章 材料與方法 .隆及測序 . 試劑及儀器 . 菌株和載體 . 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備 . 質(zhì)粒提取 .粒的小量制備 .粒的大量制備 . 質(zhì)粒純化 . 酶切、目的片斷回收及連接轉(zhuǎn)化 .切及目的片斷回收 .接及轉(zhuǎn)化 . 重組質(zhì)粒的快速篩選 . 序列測定 .傳轉(zhuǎn)化 . 試劑. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 .株及載體 .桿菌用培養(yǎng)基 .桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化 .物組培用培養(yǎng)基 . 基因槍法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 .核表達(dá)載體 .擊操作 . 花粉管通道法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 .生植株的檢測 . 小麥基因組 提取 . 植物組織總 取 . 測 .接用葉片進(jìn)行的 速檢測 .提取的小麥基因組 模板的 測 . . .針標(biāo)記 .制備 .交 .測 . 測 .I 第 3 章 病毒來源發(fā)夾 導(dǎo)抗 基因小麥研究 .料與方法 . 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 . 用于轉(zhuǎn)化的真核表達(dá)載體的制備 . 小麥幼胚組織培養(yǎng) .麥品種及組織材料 .胚的獲取及培養(yǎng) . 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 .液的準(zhǔn)備 .染轉(zhuǎn)化 .性愈傷組織的篩選和轉(zhuǎn)基因苗的獲得 . 基因槍法進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化 . 花粉管通道法介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 . 轉(zhuǎn)基因再生小麥植株的分子生物學(xué)檢測 . 抗性檢測方法 .室病毒抗性檢測方法 .田病毒抗性檢測方法 .果與分析 . 農(nóng)桿菌介導(dǎo)對小麥的遺傳轉(zhuǎn)化