密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 小麥（ .）高分子量麥谷蛋白 11 士 研 究 生：徐 濤 指 導(dǎo) 教 師：張學(xué)勇 研究員 申請(qǐng)學(xué)位類別：理學(xué)博士 專 業(yè)：生物化學(xué)與分子 研 究 方 向：小麥重要性狀的功能 基因組學(xué)研究 培 養(yǎng) 單 位：作物科學(xué)研究所 提 交 日 期： 2006 年 6 月 h. D. of in 006 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士畢業(yè)論文 摘 要 I 摘 要 高分子量麥谷蛋白是一類對(duì)小麥面粉的烘烤等品質(zhì)有重要決定作用的種子貯藏蛋白。 近年來， 研究表明， 11面條加工品質(zhì)呈密切正相關(guān)， 111在所有已分析的小麥品種中， 表達(dá)量遠(yuǎn)低于 1表達(dá)量。因此，本文在已克隆該亞基編碼基因的基礎(chǔ)上，從基因調(diào)控入手，研究因在種子發(fā)育過程中的表達(dá)變化規(guī)律，克隆和篩選胚乳特異表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子，構(gòu)建載體，并進(jìn)行小麥轉(zhuǎn)化，為用分子手段進(jìn)行小麥品質(zhì)改良提供技術(shù)和科學(xué)依據(jù)。 對(duì) 11帶者小偃 54、 小偃 6 號(hào)、 陜優(yōu) 225 和偃展 1 號(hào)籽粒 白和 現(xiàn)無論翻譯水平還是轉(zhuǎn)錄水平 表達(dá)要明顯高于 且在品種間存在一定的差異。對(duì)陜優(yōu) 225 和小偃 54 兩個(gè)品種中 1因組織和發(fā)育時(shí)間的表達(dá)特異性研究發(fā)現(xiàn)， 在胚乳發(fā)育特定時(shí)期表達(dá)，并且表達(dá)階段和表達(dá)峰值在品種間存在差異。 根據(jù)已知的序列特征，用 克隆了 1部分啟動(dòng)子序列，并克隆了 11 1基因的啟動(dòng)子。序列分析表明 因的啟動(dòng)子序列同源性較高，都具有典型的 因啟動(dòng)子的序列特征，發(fā)現(xiàn) 1啟動(dòng)子序列具有明顯的特異性。在啟動(dòng)子的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中， 它們操縱 達(dá)水平結(jié)果相一致，即 1啟動(dòng)子活性低于 1的啟動(dòng)。此外我們還得到了能啟動(dòng) 表達(dá)的 因的啟動(dòng)子 從煙草和水稻中成功克隆了兩個(gè)已知的基質(zhì)序列（ 。瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，僅在基因表達(dá)盒前側(cè)加入 能發(fā)揮其促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用，反而可能會(huì)對(duì)基因表達(dá)起到抑制作用。 利用內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子 因的啟動(dòng)子）和 列構(gòu)建了 1 基因槍法和花粉管通道法進(jìn)行了小麥轉(zhuǎn)化研究。在對(duì) 1基因槍法轉(zhuǎn)化中，共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化效率明顯高于 交證明有 4 個(gè)轉(zhuǎn)基因品系（ 1因的插入； 測(cè)到 6 個(gè) 通過花粉管通道法進(jìn)行 1轉(zhuǎn)化， 只有 體得到了 56 個(gè) 測(cè)為陽性的獨(dú)立株系。 交證明有 2 個(gè)轉(zhuǎn)基因品系（ 1因的插入；經(jīng) 測(cè)有 6 粒（ 子得到了目的蛋白的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)該基因的導(dǎo)入可能干擾了受體品種原有種子蛋白基因的表達(dá)，但 交分析證明，轉(zhuǎn)化籽粒低分子量區(qū)出現(xiàn)的一些未知蛋白（可能）并不是高分子量谷蛋白的變異體。 對(duì)于 步鑒定表明基因槍法轉(zhuǎn)化率平均為 關(guān)鍵詞 : 高分子量麥谷蛋白亞基；啟動(dòng)子；瞬時(shí)表達(dá)；轉(zhuǎn)基因 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士畢業(yè)論文 of an in of it 1of is to a on of 1 4, , 25 to of at at is 4 25 by TIt in a of 111in of In of US it of a of 1in by s by or CR 0 we of 4 T0 of to in 1 by 56 12 to in of MW In in 0 of 錄 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 麥遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展 1 麥遺傳轉(zhuǎn)化研究概況 1 麥遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法及其問題 1 因表達(dá)調(diào)控元件及載體構(gòu)建策略 5 源基因的表達(dá)與遺傳 9 相關(guān)研究及其進(jìn)展 10 小麥加工品質(zhì) 10 價(jià)小麥加工品質(zhì)的指標(biāo) 11 傳模式 12 麥 結(jié)構(gòu) 13 分子量麥谷蛋白的分離與基因克隆 13 加工品質(zhì)關(guān)系的研究 14 蛋白基因的表達(dá)調(diào)控 15 分子量麥谷蛋白亞基基因上游調(diào)控序列的研究 15 蛋白基因組織特異性表達(dá)的調(diào)控 16 因表達(dá)水平影響因子的研究 17 因的轉(zhuǎn)化研究 18 基因小麥的功能分析 18 因或啟動(dòng)子導(dǎo)入其它種屬的研究 19 麥近緣種屬高分子量麥谷蛋白基因轉(zhuǎn)化普通小麥 20 論文研究的目的和意義 20 第二章 因的表達(dá)分析 22 1譯和轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異的比較分析 22 料和方法 22 果 25 因在不同組織和胚乳發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況 28 料和方法 28 果 28 論 30 蛋白基因的組織特異性表達(dá)調(diào)控 30 因的表達(dá)調(diào)控 31 第三章 因啟動(dòng)子和 列的克隆及 時(shí)表達(dá)分析 32 分子量麥谷蛋白基因部分啟動(dòng)子序列的克隆與分析 32 料和方法 32 果與討論 36 分子量麥谷蛋白基因啟動(dòng)子的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 39 料和方法 39 果與分析 41 論 42 稻和煙草 列的克隆與瞬時(shí)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 43 料和方法 43 果 44 論 46 第四章 小麥 48 麥 個(gè)表達(dá)載體的構(gòu)建與普通小麥的轉(zhuǎn)化 48 料 48 法 48 果與分析 56 麥 69 料 69 法 69 果 71 論 75 種轉(zhuǎn)化方法的比較 75 體構(gòu)建策略對(duì)基因表達(dá)的影響 75 轉(zhuǎn)化法的優(yōu)勢(shì) 76 基因過程中的基因沉默 76 基因株系的品質(zhì)預(yù)測(cè) 77 第五章 結(jié) 論 78 達(dá)的研究 78 因啟動(dòng)子及 列的克隆和 時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn) 78 麥 效表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 78 山羊草 79 參考文獻(xiàn) 80 主要試劑的配制 92 致 謝 97 作 者 簡 歷 98 V 英文縮略表） 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 分子量麥谷蛋白亞基 哚丁酸 哚乙酸 乙酸 2,4,4,4芐青霉素 bp 基對(duì) 牛血清白蛋白 椰菜病毒 花天數(shù) 碳酸二乙酯 N,甲基甲酰胺 二銨四乙酸 達(dá)序列標(biāo)簽 丙基 基質(zhì)結(jié)合序列 效唑 ,N,N,N， N， N， N一四甲基乙二胺 啉代丙烷磺酸 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 乙烯凝膠電泳 轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 二烷基硫酸鈉 錄因子類似的基序 霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士畢業(yè)論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1第一章 文獻(xiàn)綜述：小麥轉(zhuǎn)基因概況及與品質(zhì)相關(guān)的高分子量麥谷蛋白的遺傳轉(zhuǎn)化研究 小麥?zhǔn)鞘澜缟蠌V泛栽培的重要糧食作物之一，其種植面積為各大作物之首，在解決世界糧食問題中具有舉足輕重的作用。在小麥生產(chǎn)和育種上，世界各國都經(jīng)歷了一個(gè)由只重視產(chǎn)量到產(chǎn)量與品質(zhì)并重，進(jìn)而發(fā)展到重視品質(zhì)的過程。在我國，多年小麥面積僅次于水稻，為第二大作物，小麥饅頭、面條、面包、等是廣大民眾的日常食品。小麥高分子量（ 谷蛋白亞基的組成和含量對(duì)小麥面包的烘烤品質(zhì)等具有決定性作用。在我國，小麥育成品種中優(yōu)質(zhì)亞基的頻率顯著低于歐洲及北美品種，并因高分子量麥谷蛋白亞基的組成不盡合理，使得小麥面粉的烘烤品質(zhì)普遍較差。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)，直接將普通小麥或其近緣種屬中的優(yōu)質(zhì)基因?qū)朐耘嗥贩N，改善我國小麥面粉中 谷蛋白的組成及含量是改良面粉加工品質(zhì)的一條捷徑。 麥遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展 麥遺傳轉(zhuǎn)化研究概況 由于較難建立起適合的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，對(duì)小麥、水稻、玉米、大麥等重要禾谷類作物遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展一直較為緩慢。小麥?zhǔn)亲詈笠粋€(gè)獲得成功轉(zhuǎn)化的重要禾本科作物，直至 1991 年，人才開拓性地利用基因槍法轉(zhuǎn)化小麥懸浮細(xì)胞，獲得了轉(zhuǎn)化的愈傷組織。經(jīng)過十幾年的努力，小麥遺傳轉(zhuǎn)化取得了長足的發(fā)展，已將抗除草劑、抗病毒、抗逆、抗菌、抗蟲、雄性不育、品質(zhì)相關(guān)基因、花發(fā)育等多種基因?qū)肓诵←?，獲得了一批轉(zhuǎn)基因小麥，為外源基因的遺傳研究提供了資料。其中，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)旨在改善小麥營養(yǎng)、增強(qiáng)品質(zhì)的研究與實(shí)踐，主要通過五個(gè)途徑來實(shí)現(xiàn)： 增加蛋白含量； 增加必需氨基酸的含量； 增加 谷蛋白的含量，以改進(jìn)小麥面粉的烘烤品質(zhì)； 調(diào)整淀粉組成； 生產(chǎn)出具有藥用和保健性能的品種（ 001） 。近年來，在這方面已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，外植體高效再生系統(tǒng)的建立、遺傳轉(zhuǎn)化方法的建立與優(yōu)化、有效篩選系統(tǒng)的建立和篩選標(biāo)記的去除，以及對(duì)轉(zhuǎn)基因在植物中的整合與表達(dá)調(diào)控的深入研究促進(jìn)了基因工程技術(shù)在小麥遺傳改良中的應(yīng)用 。 麥遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法及其問題 迄今，植物轉(zhuǎn)基因的方法有基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、電擊法、激光微束穿孔法、顯微注射法、 乙二醇）法 /滲透法、花粉介導(dǎo)法、硅碳纖維法、 泡法 /直接吸入法、花粉管通道法等。根據(jù)需要載體與否，可將這些方法分為兩大類，即農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和沒有轉(zhuǎn)化載體的裸露 直接轉(zhuǎn)化。在禾谷類作物轉(zhuǎn)化方法中應(yīng)用較早的是 ，最廣泛和最成功的是基因槍法，而最有發(fā)展前途的是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（ et 2001） 。轉(zhuǎn)化受體 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士畢業(yè)論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2有幼胚、胚性愈傷組織、原生質(zhì)體、子房、成熟胚、授粉后的柱頭等，不同轉(zhuǎn)化方法所選用受體有所差異。我們將禾谷類作物基因遺傳轉(zhuǎn)化方法及其特點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)的概括（表 。盡管禾谷類作物遺傳轉(zhuǎn)化的方法已相當(dāng)豐富，但其轉(zhuǎn)化效率都還不高，穩(wěn)定性也不夠理想，多數(shù)方法在很大程度上受轉(zhuǎn)化材料及基因型的限制，離育種的實(shí)用要求還有一定的差距。特別是小麥原生質(zhì)體培養(yǎng)對(duì)基因型依賴性很大、植株再生困難、重復(fù)性差，且轉(zhuǎn)基因植株育性低（郭殿京等， 1997） 。直至 1988 年原生質(zhì)體才培養(yǎng)成功，其研究基礎(chǔ)和進(jìn)展都不夠理想，要將其真正應(yīng)用于實(shí)際，仍有大量問題亟待解決。因此，在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最多、效果最好的仍然是基因槍法。 表 植物常用遺傳轉(zhuǎn)化方法的比較 植 物 常 用 遺 傳 轉(zhuǎn) 化 方 法 評(píng)價(jià)內(nèi)容 農(nóng)桿菌法 基因槍法 電激法 注射法 花粉管通道法 宿主范圍限制 有 無 無 無 無 有性生殖植物 組織培養(yǎng)操作 簡單 復(fù)雜 簡單 復(fù)雜 復(fù)雜 無 轉(zhuǎn)化可重復(fù)性 高 一般 高 一般 一般 低 轉(zhuǎn)化嵌合體 少 無 多 無 無 無 操作復(fù)雜程度 簡單 較復(fù)雜 簡單 復(fù)雜 復(fù)雜 簡單 設(shè)備要求 便宜 便宜 昂貴 昂貴 昂貴 便宜 轉(zhuǎn)化效率 高 低 較高 低 低 較高 單子葉應(yīng)用 少 可行 廣泛 可行 可行 廣泛 因槍法 基因槍法的原理是利用高速金（鎢）微粒穿過細(xì)胞壁，將附著其上的外源 性愈傷組織、盾片等組織細(xì)胞中，然后以某種未搞清的機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞核并整合到基因組中。 基因槍法在一定程度上避開了采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)時(shí)培養(yǎng)及再生困難的障礙， 且重復(fù)性高、操作方法相對(duì)簡單。由于基因槍法誕生不久就相繼在水稻、玉米、大麥、小麥、燕麥、高梁等重要禾谷類作物的轉(zhuǎn)化中獲得了成功，而與此同時(shí)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法在禾谷類作物中的研究進(jìn)展卻不盡人意，因此， 90年代初基因槍法很快就成為許多禾谷類作物遺傳轉(zhuǎn)化的首選方法。 基因槍法的轉(zhuǎn)化效率受多種因素的影響，小麥的組培特性可能是小麥基因槍轉(zhuǎn)化的最大影響因子。盡管成功的報(bào)道已經(jīng)不少，但小麥?zhǔn)荏w基因型還是相當(dāng)有限的，轉(zhuǎn)化效率也只有 et 1996；曾君祉等， 1998；梁輝等， 1998） 。此外，小麥轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生及分化能力可能是最主要的限制因子。有報(bào)道認(rèn)為，在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)?落酸）可以使愈傷組織表面細(xì)胞變得致密，有利于外源基因進(jìn)入可分化細(xì)胞，以提高轉(zhuǎn)化率。進(jìn)行適當(dāng)濃度和時(shí)間的甘露醇或山梨醇處理，可使細(xì)胞產(chǎn)生一定程度的質(zhì)壁分離，以減少微粒穿孔后胞液的外滲，也可在一定程度上提高轉(zhuǎn)化效率（ et 1992；梁輝等， 1999） 。轟擊時(shí)所采用的金（鎢）粉顆粒的大小及用量、壓力大小、轟擊距離等參數(shù)同樣會(huì)影響到轉(zhuǎn)化細(xì)胞的傷害程度，從而進(jìn)一步影響轉(zhuǎn)化效率。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士畢業(yè)論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3但隨著研究的不斷深入，其缺點(diǎn)也越來越明顯。首先，基因槍設(shè)備昂貴，轉(zhuǎn)化的成本較高；其次，轉(zhuǎn)化的受體材料仍以胚性愈傷組織為主，這類材料受基因型影響較大、轉(zhuǎn)化后篩選時(shí)間較長、再生分化能力和轉(zhuǎn)化效率都不夠理想；第三，由于基因槍法轉(zhuǎn)化是一個(gè)隨機(jī)事件，轉(zhuǎn)化后的嵌合體、轉(zhuǎn)移基因的完整性、多拷貝及其對(duì)基因表達(dá)的影響等問題都相當(dāng)突出。因此，盡可能克服這些缺點(diǎn)，選用和創(chuàng)造適當(dāng)?shù)男←湶牧?、改良培養(yǎng)條件、優(yōu)化轉(zhuǎn)化中的參數(shù)，將對(duì)提高基因槍法的轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生積極的影響，在這一方面開展系統(tǒng)研究目前仍很有價(jià)值。 桿菌法 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法因其簡單有效、轉(zhuǎn)移基因整合效率高，且整合多發(fā)生于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，利于外源基因的表達(dá)，因而在雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中倍受青睞。盡管單子葉植物不是農(nóng)桿菌天然的宿主，但這種障礙并非不可逾越。近幾年來這方面已取得了重大突破，繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻 (et 1994) 轉(zhuǎn)化成功后，在玉米 (et 1996)、小麥 (et 1997)、大麥 (et 1997) 和黑麥 (et 2003)上也相繼取得了成功。與煙草等雙子葉模式植物相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的禾谷類作物的轉(zhuǎn)化要困難的多。 目前用于植物基因遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌主要有兩種類型：一為根癌農(nóng)桿菌（ ，它含有能誘導(dǎo)被浸染的植物細(xì)胞形成腫瘤的 粒；而另一類為發(fā)根農(nóng)桿菌（ ，它含有能誘導(dǎo)被浸染的植物細(xì)胞產(chǎn)生發(fā)狀根的 粒。其中，以前者應(yīng)用最多。野生型根癌農(nóng)桿菌能夠?qū)⒆陨淼囊欢?入植物細(xì)胞，因此段 有一些激素合成基因，因而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化細(xì)胞自身激素水平的不平衡從而形成冠癭瘤。 粒為根癌農(nóng)桿菌一個(gè)約 200 環(huán)狀質(zhì)粒，它包括 、毒性區(qū)（ ） 、接合轉(zhuǎn)移區(qū)（ ）和復(fù)制起始區(qū)（ ）四部分，其中 和 與冠癭瘤形成有關(guān)，前者決定了 加工和轉(zhuǎn)移過程， 包括 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G 等七個(gè)操縱子，由24 個(gè)基因共同作用，決定著 加工和轉(zhuǎn)移。 以將攜帶的任何基因整合到植物基因組中，這些基因本身與 轉(zhuǎn)移與整合并無任何關(guān)系，僅 右兩端的 25 向重復(fù)序列為其加工所必需，其中 14 完全保守的，呈 10 和 4 連續(xù)的兩組，兩邊界中以右邊界更為重要。 受體蛋白 損傷植物細(xì)胞分泌物的誘導(dǎo)， 自身磷酸化后進(jìn)一步磷酸化而激活 白。后者是一種 錄活化因子，被激活后可以特異性結(jié)合于其他 因啟動(dòng)子上游的一個(gè)叫的序列，啟動(dòng)這些基因的轉(zhuǎn)錄，其中 因產(chǎn)物可對(duì) 行剪切，產(chǎn)生 鏈，然后以類似于細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移過程方式將 那里與許多 鏈結(jié)合蛋白）相結(jié)合，形成 T 鏈復(fù)合物（ et 1996；et 1999 ） 。在此過程中 結(jié)合的功能（ et 1996） 。之后，這一復(fù)合物在 引導(dǎo)下，以 入細(xì)胞核的 單或多拷貝的形式隨機(jī)整合到植物染色體中。研究表明， 先整合到轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，而且，在與其同源的宿主基因組 度重復(fù)區(qū)的整合頻率較高（ et 1991； et 1992） 。 早在八十年代中期，研究人員就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乙酰丁